Extrahieren von Metriken für die dreidimensionale Wurzelsysteme: Volumen und Oberflächenanalyse von In-Boden Röntgen Computertomographie Daten

Summary

Eine Methode zur visuellen und quantitative Wurzelstruktur Informationen von Röntgencomputertomographiedaten zu erhalten im Boden erfasst wird präsentiert.

Abstract

Pflanzenwurzeln spielen eine entscheidende Rolle bei der Pflanze-Boden-Mikroben-Interaktionen, die in der Rhizosphäre auftreten, sowie Prozesse mit erheblichen Auswirkungen auf den Klimawandel und des Pflanzenanbaus. Quantitative Größeninformationen an Wurzeln in ihrer natürlichen Umgebung ist von unschätzbarem Wert für das Studium Wurzelwachstum und Umweltprozesse mit Pflanzen. Ein wirksames Instrument zur in situ Wurzel Scannen und Analyse Röntgencomputertomografie (XCT) wurde nachgewiesen. Wir wollten ein costless und effizientes Werkzeug zu entwickeln, die die Oberfläche und das Volumen der Wurzel unabhängig von seiner Form von dreidimensionalen (3D) Tomographiedaten annähert. Die Wurzelstruktur eines Prairie Dropseed (Sporobolus heterolepis) Probe wurde unter Verwendung von XCT abgebildet. Die Wurzel wurde rekonstruiert, und die primäre Wurzelstruktur wurde aus den Daten unter Verwendung einer Kombination von lizenzierten und Open-Source-Software extrahiert. Ein isosurface Polygonalnetz wurde dann für eine einfache Analyse erstellt. Wir haben t entwickelter eigenständige Anwendung imeshJ, erzeugt in MATLAB ^1, Wurzelvolumen und die Oberfläche aus dem Netz zu berechnen. Die Ausgänge der imeshJ sind Fläche (in mm ²⁾ und das Volumen (in mm ^3). Das Verfahren, eine einzigartige Kombination von Werkzeugen aus Bildgebung quantitative Wurzelanalyse verwendet wird, beschrieben. Eine Kombination aus XCT und Open-Source-Software erwies sich als eine leistungsstarke Kombination nichtinvasiv Bild Pflanzenwurzelproben, Segment Stammdaten und extrahieren quantitative Informationen aus den 3D-Daten zu sein. Diese Methodik von 3D-Datenverarbeitung sollte auf andere Material / Probensysteme anwendbar sein, wo es die Verbindung zwischen Komponenten von ähnlicher Röntgenschwächungs und Schwierigkeiten mit der Segmentierung entstehen.

Introduction

Roots, als Teil der Rhizosphäre ^2-5, eine "unsichtbare" Teil der Pflanzenbiologie dar , da es schwierig Boden zu Bild Wurzeln nicht-invasiv ^{6 macht, 7.} Doch das Wurzelwachstum und Interaktion innerhalb der Bodenumgebung zu studieren ist entscheidend für das Verständnis root / Pflanzenwachstum und Nährstoffkreislauf, was wiederum Auswirkungen auf Aufforstung, Ernährungssicherheit, und das Klima. X-ray - Computertomographie (XCT) hat ⁸ ein wertvolles Werkzeug für die nichtinvasive Bildgebung von Pflanzenwurzelproben in ihren lokalen Umgebungen erwiesen. Um die Wurzelentwicklung und Dimensionsänderungen unter verschiedenen Bedingungen zu messen, und in der Lage sein, Daten aus verschiedenen Datensätzen / Proben zu vergleichen, muss man quantitative Informationen aus den Tomographiedaten zu extrahieren. Segmentierung der Stammdaten von der des umgebenden Bodens, das heißt, der Isolierung des Wurzel Bild von allem anderen um ihn herum (einschließlich zum Beispiel einer benachbarten Anlage) ist ein kritischer Schritt, bevor accuRate Größenanalyse kann durchgeführt werden. Allerdings ist eine einfache Schwellwertoperation Ansatz oft nicht machbar für Stammdaten. Die Herausforderungen im Zusammenhang mit bildgebenden Pflanzenwurzeln im Boden umfassen Variationen in den Röntgendämpfungseigenschaften des Stammmaterials und die Überlappung in Dämpfungswerte zwischen Wurzel und Boden durch Wasser und organische Stoffe. Diese Fragen wurden hervorragend kürzlich von Mairhofer et al gerichtet. in ihrer visuellen Tracking - Tool RooTrak ^{7, 9.} Der nächste Schritt nach einer erfolgreichen Segmentierung ist die genaue Bestimmung der Wurzelvolumen und die Oberfläche. Das Volumen kann durch Zählen der Anzahl von Voxeln und Multiplizieren mit dem Voxel 'Größe gewürfelt geschätzt werden wie vorher ⁷ gezeigt. Für eine genauere Bestimmung der Wurzeloberfläche und Volumen der Isofläche des segmentierten Wurzelsystem kann durch ein Gitter von Dreiecken dargestellt werden können, ein Algorithmus , bekannt als Marching Cubes ¹⁰ verwendet wird . Die Open-Source - ImageJ ¹¹ eingesetzt werden th angenäherte Wurzelvolumen auf der Grundlage der Marching Cubes Algorithmus. Nach bestem Wissen und Gewissen, nur eine begrenzte Anzahl von Open-Source - Software die Berechnung Tomographie-basierte Volumen / Oberflächendaten für die Wurzelproben im Zentimeterbereich gewidmet und oben ist derzeit ¹² zur Verfügung. Eine Open-Source - Software , die wir auf ¹³ schaute konzentriert sich auf das Wurzelwachstum und wird auf zellulärer Funktionen richtet ermöglicht quantitative Volumenanalyse an Einzelzellauflösung. Einige Open-Source - Software , um ganze Wurzelsysteme gewidmet ¹⁴ eignet sich hervorragend für kleine Durchmesser Systeme Rohr Wurzel auf der Basis der Annäherung , dass ihre Form tatsächlich rohrförmig ausgebildet ist. Allerdings sind einige Arbeit mit 2D - Bildern und nicht in der Lage zu handhaben 3D ¹⁴ Stacks. Des Weiteren kann die rohrförmige Form Approximation nicht gültig sein, wenn Wurzelsysteme mit rauen Oberflächen und ungleichmäßige Formen, wie die von Bäumen, untersucht. Ein weiterer Ansatz ¹⁵ verwendet zweidimensionale (2D) Drehbildsequenzen innovativ umgehen the benötigen für eine teure CT-Scanner. Er misst, Aufzeichnungen und zeigt Wurzelsystem Längen. Die Software , die wir von denen nur im Handel erhältlich ^16-18 getestet haben; ein nicht erscheint 3D in der Lage sein Bild zu handhaben ¹⁶ stapelt, die zweite ist eine Blattfläche und Wurzellängenmesswerkzeug ^17, während die dritte auf die Farbanalyse ¹⁸ basiert. Auf der Grundlage dieser Umfrage, schlagen wir vor, dass eine costless Option, die die Oberfläche und das Volumen der Wurzel unabhängig von seiner Form von 3D-Tomographiedaten annähert wünschenswert ist.

Aufbauend auf dem frei verfügbaren RooTrak und ImageJ, haben wir ein Programm entwickelt, mit dem Namen imeshJ (Supplemental - Code - Datei) , welche Prozesse eine isosurface mesh (Oberfläche Stereolithografie - Datei) von segmentierten Stammdaten erzeugt, und berechnet das Volumen und die Oberfläche der Wurzel von tun einfache geometrische Berechnungen auf dem Dreieck Indexdaten Mesh. Hier berichten wir über eine Methode, die die Verwendung von XCT Bildgebung kombiniert,Daten Rekonstruktion und Visualisierung (Software CT Pro 3D und VG Studio), Segmentierung der Wurzel der Probe aus dem Boden in den 3D-Daten (Open-Source-Software ImageJ und RooTrak) und Extraktion der Oberflächen- und Volumeninformationen aus einem Dreiecksnetz (ImageJ und der Computercode imeshJ).

Protocol

Achtung: Der Betrieb eines Röntgentomographen erfordert sowohl allgemeine Strahlung Ausbildung und instrumentenspezifischen Strahlung Sicherheitstraining. Alle entsprechenden Verfahren relevant in das Labor des Experimentators zu beachten.

1. Root-Imaging

Anmerkung: Dieser Schritt beschreibt die Bebilderung einer Gras Probe gehalten in seiner ursprünglichen Boden in einer röhrenförmigen Kunststofftopf (ein Kunststoffrohr mit einem Durchmesser von 40 mm, einer Höhe von 210 mm, und einer Wanddicke von etwa 2 mm).

1. Legen Sie Topfpflanze auf dem Probenmanipulator des Instruments in einem Abstand zur Ziel Vergrößerung gewünscht. Für eine Anlage in einem 2-Zoll Durchmesser Halter die Probe auf Quell Abstand sollte etwa 3 Zoll (7 cm) betragen.
2. Passen Sie die Röntgenscaneinstellungen optimale Farbe zu erzielen (Graustufe) Kontrast im Detektor Bild. Hinweis: Diese Einstellungen sind in der Instrumentensteuerungssoftware verwendet.
   1. Set Röntgenenergieeinstellungen; 85 kV und 190 & mgr; A wurden in dieser Prüfung verwendetple.
   2. Stellen Sie die Belichtungszeit. Hier wird eine relativ lange Belichtungszeit von 1 sec wurde für eine bessere Signal-Rausch-Verhältnis verwendet.
   3. Legen Sie die Anzahl von Vorsprüngen und Frames pro Projektion; 4 Bilder pro Projektion für insgesamt 3142 Projektionen für eine gute Datenstatistiken vorgeschlagen.
   4. Führen Sie eine Shading-Korrektur der Messbedingungen eingestellt oben durch die "Shading-Korrektur" Tab auswählen und auf "Create" verwenden.
      Hinweis: Die Schattierungskorrektur für die Variation in Reaktion der Abbildungsvorrichtung der Pixel gleicht, wenn sie mit einer konstanten Menge von Röntgenfluss beleuchtet. Der Vorgang dauert leere Bilder (mit Probe aus Strahlengang entfernt werden) mit dem Röntgenstrahl eingeschaltet und mit dem Strahl ausgeschaltet. Diese Korrektur wird für alle Bilder gesammelt angewendet.
   5. Wählen Sie den "Minimieren Ring Artefakte" Option (auch als "pendelt Modus"); die Probe wird in Winkelschritten gedreht werden, während die Projektionsbilder erfasst werden. Dies führt dazu, dasseine Akquisition mit einer geringeren Geschwindigkeit, hilft aber Ring Artefakte zu beseitigen.
   6. Starten Sie den Scan durch die Schaltfläche "Erfassen" unter der Acquisition Registerkarte klicken (mit den Einstellungen oben skizzierten Bildsammlung dauert etwa 4 Stunden).

2. Datenrekonstruktion

Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt die Rekonstruktion von 3D-Volumendaten aus den RAW-Bilder (Röntgenbilder aus der CT-Scan).

1. Legen Sie die Rohdaten in das Programm.
2. Vergleichen erste und das letzte Bild (sollten sie nahezu identisch sein , wie das letzte Bild nach einer ^360-Grad - Drehung der Probe genommen wird) , um sicherzustellen , dass die Probe nicht bewegt oder die Scan - Einstellungen nicht während der Datenerfassung geändert werden .
3. Berechnen Sie die Rotationszentrum (COR) durch das "Center of rotation" Tab auswählen und auf "Start"; Verwendung Optionen "Automatisch" COR Suche mit "High Quality" Genauigkeit und "Dual" (obere und untere) Scheibe sWahl für COR-Berechnung.
4. Wählen Sie das Probenvolumen rekonstruiert werden: Wählen Sie die Registerkarte "Lautstärke" und bearbeiten Sie die Lautstärke Auswahlfenster die Thumbnails verwenden.
5. Führen Sie den Wiederaufbau der Lautstärke-Datei mit 3D-Daten zu erstellen, indem Sie auf "Start".

3. Datenverarbeitung / Segmentation

Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt die Schritte, die rekonstruierten Daten für die Weiterverarbeitung im Programm RooTrak vorzubereiten genommen werden Wurzeln zu verfolgen, wie sie durch den Boden verzweigen, und zu isolieren, die Wurzeln von jedem umgebenden Material einen Stapel von binären Bildern von nur produzieren die Wurzel selbst.

1. Die Verarbeitung von Volumendaten in ImageJ ein RooTrak verarbeitbare Bildstapel vorzubereiten:
   1. Legen Sie das Volume-Datei in ImageJ.
   2. Optimieren Sie den Bildkontrast zwischen Wurzel und Boden durch Helligkeits- und Kontrasteinstellungen Einstellung (Bild klicken / Anpassen / Helligkeit / Kontrast). Wenn der interessierende Bereich innerhalb des Bildes sichtbar ist und clearly unterscheidbar, werden die Einstellungen betrachtet optimiert.
   3. Speichern als Bildstapel in JPEG, BMP oder PNG-Format.
2. Die Verarbeitung in RooTrak segmentieren die Wurzel:
   1. Bild laden Stapel in RooTrak (gehen Sie zu Registerkarte "Extras", und drücken Sie "Tracker").
   2. Set Saatpunkte innen Wurzel: Klicken Sie mehrere Punkte innerhalb jeder der zugehörigen Wurzelabschnitte sichtbar in der Draufsicht Scheibe der Volumendaten.
   3. Gesetzt tracker parameters "Glätte" und "Ähnlichkeit" bis 0,3 bzw. 0,8.
   4. Führen Sie die Tracking-Funktion. Dies wird die Wurzel aus dem oberen Bildscheibe den ganzen Weg nach unten Scheibe folgen.
   5. Nachdem Sie die Volumendaten zu lesen, wählen Sie die Anzahl der Scheiben auf die nutzbare Datenvolumen entsprechend; in diesem Fall wurde, Tracking bei 200 Scheiben gestoppt, das entspricht bis zu einer Tiefe von 6,2 mm, wobei root Grenzen wurde schlecht definiert (das Bild des verfolgten Wurzel begonnen, in die des Bodens zu mischen).
      Beachten Sie dasBildstapel erzeugt wird automatisch gespeichert werden, wo das Ausgabeverzeichnis erstellt wurde.

4. Volumen und Oberflächenanalyse

Hinweis: Dieser Schritt beschreibt die isosurface Netzgenerierung aus dem Bildstapel von RooTrak erstellt.

1. Konvertieren Sie Bildstapel von RooTrak in ein binäres Bildformat in ImageJ. Wählen Sie "Bearbeiten" und dann auf "Binary", dann "Binary Make".
2. Verwenden Sie die Open-Source-ImageJ Plugin, BoneJ, das Dreiecksnetz zu schaffen; in ImageJ wählen "Plugins", dann "BoneJ", dann "Isosurface".
3. Set "Resampling" und "Threshold" bis 6 bzw. 120 (Standardeinstellung). Check "anzeigen Oberfläche", und drücken Sie die Taste "OK".
4. Auf der "3D-Viewer" klicken Sie auf die Registerkarte Datei, dann auf "Export-Oberflächen", dann speichern unter "STL (binär)".
5. Öffnen Sie imeshJ, wählen Sie die STL-Datei und Voxelgröße in Mikron ein. Klicken Sie auf "Calculate Fläche "in mm ² Gesamtprobenwurzeloberfläche zu erwerben. In ähnlicher Weise auf" berechnen Volume "auf Gesamtprobe Wurzelvolumen in mm ³ erhalten.

Results

Die Probe , bestehend aus zwei Stämmen des nativen Gras Prairie Dropseed (Sporobolus heterolepis) und dem ursprünglichen Boden um ihn herum von einem Wohngebiet und in einem kleinen röhrenförmigen Halter in 1 zu sehen genommen wurde. Die rekonstruierten Daten Voxelgröße betrug ungefähr 31 & mgr; m x 31 & mgr; m x 31 & mgr; m. Das rekonstruierte Volumen Datei wurde verwendet , um einen Stapel von Bildern aus einer gewählten Ausrichtung (Draufsicht) zu...

Discussion

Eine Kombination von Röntgencomputertomografie und mehrere Open-Source-Programme erwies sich als eine leistungsstarke Kombination nichtinvasiv Bild Pflanzenwurzelproben, Segment Stammdaten und extrahieren quantitative Informationen (Fläche und Volumen) aus den 3D-Daten zu sein. Unsere Fähigkeit, Funktionen zu visualisieren und zu messen ist immer von Scan-Auflösung begrenzt sowie durch Beschränkung des RooTrak Software. Jedoch war Abtastauflösung ausreicht, um die Mehrheit der Funktionen der Probe in dieser Studie zu er...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
X-Tek/Metris XTH 320/225 kV	Nikon Metrology		Röntgentomograph
Inspect X	Nikon Metrology		Software zur Instrumentensteuerung
CT Pro 3D	Nikon Metrology		Rekonstruktionssoftware, Version XT 2.2
VG Studio MAX	Visual Graphics GmbH		Visualisierungssoftware für 3D-Volumen, Version 2.1.5
ImageJ	Open-source		Bildverarbeitungs- und Analysesoftware, Version 1.6
RooTrak	Open-Source		Root-Segmentierungssoftware, Version 0.3.1-b1 beta
imeshJ	EMSL		MATLAB-Skript, entwickelt von den Autoren
Prärie-Dropseed-Grasprobe			Probe aus dem Boden in einem Wohngebiet