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Methodenartikel

Feeder freie Ableitung von Melanozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen

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DOI:

10.3791/53806

⸱

3. März 2016

 ,  , 
1The Center for Stem Cell Biology, Developmental Biology Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 2Cancer Biology and Genetics Program, Gerstner Sloan-Kettering Graduate School, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, 3Thermo Fisher Scientific

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt ein in vitro Differenzierung Protokoll pigmentiert, reife Melanozyten von menschlichen pluripotenten Stammzellen über einen Neuralleiste und Melanoblasten Zwischenstufe mit einem Zubringer frei, 25 Tage - Protokoll zu erzeugen.

Zusammenfassung

Humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) stellen eine Plattform dar, um die menschliche Entwicklung in vitro sowohl unter normalen als auch unter Krankheitsbedingungen zu untersuchen. Forscher können die Differenzierung von hPS-Zellen in den interessierenden Zelltyp lenken, indem sie die Kulturbedingungen manipulieren, um die während der Entwicklung beobachteten Signale zu rekapitulieren. Einer dieser Zelltypen ist der Melanozyten, eine pigmentproduzierende Zelle aus der Neuralleiste (NC), die für den Schutz der Haut vor UV-Strahlung verantwortlich ist. Dieses Protokoll stellt eine Erweiterung eines derzeit verfügbaren in vitro Neuralleisten-Differenzierungsprotokolls von hPSCs dar, um NC weiter in vollständig pigmentierte Melanozyten zu differenzieren. Melanozyten-Vorläufer können aus dem Neural Crest-Protokoll angereichert werden, indem sie aktivatoren der WNT-, BMP- und EDN3-Signalübertragung unter dualen SMAD-Hemmbedingungen ausgesetzt werden. Die resultierenden Melanozytenvorläufer werden dann gereinigt und durch Kultur in einem selektiven Medium zu vollständig pigmentierten Melanozyten gereift. Die resultierenden Melanozyten sind vollständig pigmentiert und färben sich entsprechend für Proteine, die für reife Melanozyten charakteristisch sind.

Einleitung

Humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) bieten eine Plattform normale Differenzierung in einer skalierbaren Art und Weise für Krankheitsmodelle, Drogen - Screening zu imitieren, und Zell - Ersatz - Therapien 1-6. Von besonderem Interesse, öffnen hPSCs Wege bis zur Untersuchung von schwer zu isolieren oder seltene / transient Zelltypen, bei denen Patientenproben knapp sind. Darüber hinaus induzierte pluripotente Stammzellen (iPS - Zellen) können die Forscher die Entwicklung und Krankheitsmodelle bei einem Patienten bestimmte Art und Weise zu studieren 1,2,7-11 einzigartige Mechanismen zu entwirren. Die bisher veröffentlichten Protokoll zur Differenzierung von Melanozyten von hPSCs erfordert bis 6 Wochen von Differenzierungen und werden Zellen mit konditioniertem Medium von L-Wnt3a Zellen 12 kultiviert werden . Das Protokoll zuerst von Mica et al. Und hier beschrieben produziert pigmentierten Zellen in drei Wochen und entfernt die Mehrdeutigkeit und Inkonsistenzen mit konditioniertem Medium verbunden.

Melanozyten are von der Neuralleiste abgeleitet, einer wandernden Population von Zellen, die einmalig für Wirbeltiere. Die Neuralleiste wird während der Gastrulation definiert und stellt eine Population von Zellen am Rand der Neuralplatte, an der Grenze zwischen der neuronalen und nicht-neuronalen Ektoderm. Während Neurulation entwickelt sich das Nervengewebe einer neuralen Platte Neuralfalten zu bilden, die an der dorsalen Mittellinie im Neuralrohr 13,14 resultierende konvergieren.

Die Neuralleistenzellen ergeben sich aus der Dachplatte des Neuralrohrs, gegenüber dem notochord, und durchlaufen eine epitheliale zu mesenchymale Transition vor der Migration weg zu einer vielfältigen Bevölkerung von differenzierten Zellen zu geben. Die Schicksale der Kammzellen werden zum Teil durch die anatomische Lage der Dachplatte entlang der Körperachse des Embryos definiert. Neuralleistenzellen Derivate umfassen Abstammungslinien charakteristisch sowohl Mesoderm (glatte Muskelzellen, Osteoblasten, Adipozyten, Chondrozyten) und Ektoderm Zellen (Melanozyten, Schwann cells, Neuronen) 14. Neuralleiste Stammzellen upregulate den Transkriptionsfaktor SOX10 und durch fluoreszenzaktivierte Zell mit Antikörpern gegen p75 und HNK1 Sortierung isoliert werden.

Die Neuralleistenzellen beschieden zu Melanozyten durch eine Melanoblasten Bühne passieren werden und KIT und MITF (Mikrophthalmie-assoziierter Transkriptionsfaktor) 6,21 MITF upregulate ist ein Hauptregulator der Melanozyten - Entwicklung und ist ein Transkriptionsfaktor , verantwortlich für viel von Melanozyten Entwicklung Controlling 22- 24. Menschliche Melanoblasten wandern in der basalen Schicht der Epidermis, wo sie entweder in den Haaren Ausbuchtung wohnen oder von Keratinozyten in der Epidermis umgeben (Bildung Pigmentierung Einheiten) als Vorläufer für den reifen, pigmentierten Melanozyten zu dienen. Die Differenzierung und Reifung von Melanoblasten in pigmentierten Melanocyten tritt mit der Kolonisierung des Haarzwiebel und die Expression des Melaninproduktion Wegs (TYRP1, TYR, OCA2 Begleit- undPMEL) 25,26.

Isolieren von humanen Melanozyten und Melanoblasten von Patienten ist teuer, schwierig und in der Menge zu begrenzen. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, hPSCs (induziert oder embryonale) in Melanozyten oder Melanozyten-Vorstufen in einem gut definierten, schnelle, reproduzierbare, skalierbare und kostengünstige Methode ohne Zellsortierung zu unterscheiden. Das Protokoll wurde zuvor verwendet, um krankheitsspezifische Defekte zu identifizieren, wenn iPSCs von Patienten mit Pigmentstörungen zu unterscheiden.

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Protokoll

HINWEIS: Die Melanozyten-Protokoll hier skizziert wurde zuerst von Mica et al.

1. Herstellung von Kulturmedium, beschichtete Platten und Wartung von hPSCs

  1. Medium Vorbereitung
    Hinweis: Speichern Sie alle Medium bei 4 ° C im Dunkeln für bis zu 2 Wochen. Filter alle Medium für die Sterilisation.
    1. Bereiten Sie DMEM / 10% FBS. Mischen Sie 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep und 5 ml L-Glutamin. Filter für die Sterilisation.
    2. Bereiten Sie hES-Medium. Mischen Sie 800 ml DMEM / F12, 200 ml KSR, 5 ml L-Glutamin, 10 ml MEM Minimum essentiellen Aminosäuren Lösung, 1 ml β-Mercaptoethanol und 5 ml Pen / Strep. Nach dem Filtern 10 ng / ml FGF-2 hinzuzufügen.
    3. Bereiten Sie den KSR-Differenzierungsmedium: Mischen Sie 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-Glutamin, 10 ml Pen / Strep, 10 ml MEM Minimum essentiellen Aminosäuren-Lösung und 1 ml β-Mercaptoethanol. Filter für die Sterilisation.
    4. Bereiten N2-Differenzierungsmedium. Man löst 12 g DMEM / F12 Pulver in 980 ml ​​dH 2 O. Hinzufügen 1,55 g Glucose, 2 g Natriumhydrogencarbonat und 100 mg apo menschliches Transferrin. Mix 2 ml dH 2 O mit 25 mg Humaninsulin und 40 & mgr; l 1 N NaOH; einmal gelöst, die Mischung auf dem Medium hinzuzufügen. 100 l Putrescin dihydrochlorid, 60 ul Selenit, 100 & mgr; l Progesteron. Bringen Sie das endgültige Volumen auf 1 l mit dH 2 O vor der Filterung.
    5. Bereiten Voll Melanozyten Medium. Kombinieren Sie 50% Neurobasalmedium, 30% Low Glucose DMEM und 20% MCDB201. Zu diesem Add: 0,8% ITS +, 250 nM L-Glutamin, 100 uM Ascorbinsäure (L-AA), 50 ng / ml Cholera-Toxin, 50 ng / ml SCF, 0,05 & mgr; M Dexamethason, 100 nM EDN3, 4 ng / ml FGF2 . Sterilfilter fügen Sie dann verbleibenden Reagenzien: 2% B27 Supplement, 25 ng / ml BMP-4, 3 uM CHIR99021, 500 & mgr; M cAMP.
  2. Beschichtung von Kulturschalen
    1. Führen Sie die Beschichtung mit gallertartig Protein wie Matrigel. Beim Öffnen aliquoten und gefrier in Matrigel 1 ml Teile repetitiven Gefrier-Auftau-c zu vermeidenycles. Tauen und eine 1 ml gefrorene aliquote mit 19 ml DMEM / F12 erneut suspendieren. Tafel 5 ml auf eine 10-cm-Schale. Inkubieren des Geschirrs 1 h bei RT. Saugen Sie das gallertartig Protein unmittelbar vor dem Ausplattieren der Zellen und waschen mit DMEM / F12.
    2. Führen Sie die Beschichtung mit Poly-L Ornithin hydrobromide / Maus Laminin-I / Fibronektin (PO / Lam / FN). Coat Schale mit PBS, das 15 ug / ml Poly-L Ornithin hydrobromide. O / N bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator inkubiert. Aspirieren der Lösung und Waschen der Platten mit PBS dreimal vor der Beschichtung mit PBS, das 1 & mgr; g / ml Maus-Laminin-I und 2 & mgr; g / ml Fibronektin enthält. Inkubieren des Geschirrs O / N bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator.
      1. Vor der Zellen Plattierung absaugen Lösung und lassen Sie die Platten ohne Deckel in der Gewebekultur Haube gründlich trocknen. Lassen Sie die Platten für etwa 10-15 Minuten trocknen lassen.
        Hinweis: Die Gerichte sind trocken und bereit für die Zell Plattierung, wenn Kristallstrukturen auf der Oberfläche mit dem Auge erscheinen. Die plates kann mit PBS, das LAM / FN in den Inkubator für zwei Wochen, so lange gehalten werden, wenn die Flüssigkeit nicht verdampft. Die Platten können für einige Stunden bei RT getrocknet gehalten werden.
  3. Wartung von hPSCs
    Hinweis: hPSCs auf 0,1% Gelatine gehalten und mitotisch inaktivierten embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) in hES-Medium. Die Zellen sollten alle 6-8 Tage aufgeteilt werden.
    1. Mantel eine 10 cm-Schale mit 0,1% Gelatine in PBS bei RT für 5 min.
    2. Tauwetter schnell gefroren MEFs in einem 37 ° C Wasserbad.
    3. Aspirieren die Gelatine und die Zellen plattieren. Platte MEFs bei einer Dichte von ~ 50.000 Zellen / cm 2 in DMEM / 10% FBS. Inkubieren MEFs bei 37 ° CO / N vor hPSCs zu addieren.
    4. Saugen Sie das DMEM / 10% FBS aus der hergestellten MEF Platte, Waschplatte mit PBS und 10 ml hES-Medium mit hPSCs. Passage die hPSCs in einem Verhältnis von 1: 5/10 je nach Dichte vor der Passagierung.
      Hinweis: Wenn die hPSCs aufgetaut werden, oder als einzelne Zellen agierten, supErgänzung mit 10 & mgr; M Y-27632 dihydrochlorid (Rocki) bis zum ersten Durchgang.
    5. Feed-Zellen täglich mit frischen 10 ml hES-Medium.
    6. Vor einer Differenzierung entfernen Sie alle pluripotente Kolonien zu beginnen , die differenzierten Zellen zu enthalten scheinen, unregelmäßige Ränder oder transparente Zentren 28. Mechanisch entfernen und die unregelmäßigen Kolonien mit einer Pipette unter einem Laminar-Flow-Haube mit einem Binokular absaugen.

2. Überzug von hPSCs für Differenzierung

Hinweis: Differenzierungsbedingungen werden für 10 cm-Schalen beschrieben.

  1. Bereiten Sie 10 cm Matrigel Gerichte vor, die Differenzierung beginnt, wie in Schritt 1.3.1 beschrieben.
  2. Wenn Plattierung hPSCs für eine Differenzierung beginnen mit einer Platte von hPSCs bei einer Dichte bereit für den Durchgang (~ 80% konfluent) absaugen hES-Medium, Waschen mit PBS und 3 ml 0,05% Trypsin-EDTA zu den Zellen.
  3. Kräftig schütteln Sie die Schale horizontally für 2 min, während sie unter dem Mikroskop zu visualisieren, bis die MEFs als einzelne Zellen abheben. Die HPSC Kolonien sollten als Kolonien verbunden bleiben.
  4. Saugen Sie das Trypsin, nachdem die MEFs abgehoben haben, aber bevor die hPSCs Kolonien lösen.
  5. 10 ml hES-Medium, das 10 & mgr; M Y-27632 dihydrochloride an der Platte und lösen die Zellen durch Pipettieren nach oben und unten über die Kolonien.
  6. Saugen Sie das Matrigel-Lösung aus dem in Stufe 10 cm Schale 2.1 und waschen mit DMEM / F12 Klumpen zu entfernen. Platte, die die hPSCs bei einem 1: 2-Verhältnis auf die Matrigel Platte. In hES-Medium, das 10 & mgr; M Y-27632-dihydrochlorid bis 10ml. Inkubieren bei 37 ° CO / N.
    Hinweis: Dieses Plattieren führen sollte in etwa 100.000 Zellen / cm 2.

3. Die Induktion der Differenzierung neuronaler

Anmerkung: Die Differenzierung begonnen werden sollte (Tag 0), wenn die hPSCs 80% konfluent sind. Die Zellen können täglich mit hES-Medium zugeführt werdenmit 10 & mgr; M Y-27632 dihydrochloride die Differenzierung bis Anfang.

  1. Am Tag 0 und Tag 1, füttern die Zellen mit 10 ml KSR-Differenzierungsmedium, das 100 nM LDN193189 und 10 & mgr; M SB431542.
  2. Am 2. Tag füttern die Zellen mit 10 ml KSR-Differenzierungsmedium, das 100 nM LDN193189, 10 uM SB431542 und 3 uM CHIR99021.
  3. Am Tag 3 füttern die Zellen mit 10 ml KSR-Differenzierungsmedium, das 10 & mgr; M SB431542 und 3 uM CHIR99021.
  4. An den Tagen 4 und 5 Vorschub die Zellen mit 15 ml von 75% KSR-Differenzierungsmedium und 25% N2-Differenzierungsmedium, enthaltend 3 uM CHIR99021.
    Hinweis: Verwenden Sie keine große Menge an Zelltod in Form von Floating-Zellen zu sehen, alarmiert werden. Dies ist normal und zu erwarten.
  5. An den Tagen 6 und 7 Futter die Zellen mit 15 ml 50% KSR-Differenzierungsmedium und 50% N2-Differenzierungsmedium sowohl mit 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP-4 und 100 nM EDN3.
  6. An den Tagen 8und 9-Feed die Zellen mit 20 ml 25% KSR-Differenzierungsmedium und 75% N2-Differenzierungsmedium sowohl mit 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP-4 und 100 nM EDN3.
  7. An den Tagen 9 und 10 PO / Lam / FN Gerichte zubereiten, wie in 1.2.2 für die Wieder Plattierung der Zellen am Tag 11 angegeben.
  8. Am Tag 10 Vorschub Zellen mit 20 ml von N2-Differenzierungsmedium, enthaltend 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP-4 und 100 nM EDN3.

4. Replattierung in Droplets für die NC-Spezifikation

  1. Am Tag 11 absaugen Lam / FN aus den vorbereiteten PO / LAM / FN Platten und vollständig trocknen.
  2. Entfernen Medium aus den Tag 11 Zellen, Waschen mit PBS und 4 ml Zellablösung Lösung wie Accutase pro 10 cm Schale. bei 37 ° C für 25 min inkubieren.
  3. 5 ml Voll Melanozyten Medium in die Schale und Resuspendieren der Zellen durch manuelles Pipettieren nach oben und unten mit einer 10 ml Pipette, bis alle Zellen, die die Platte abgehoben haben. Übertragen Sie die Suspension auf einen 15-ml-Tube.
  4. Spin theZellen nach unten für 5 min bei 200 xg und die Zellen bei 2 x 10 6 Zellen pro ml in Vollmedium Melanocyte resuspendieren. Zählen Sie die Zellen, die die Trypanblau-Ausschluss auf einem Hämozytometer oder gleichwertige Technik.
  5. Platte 10 ul Tröpfchen nahe beieinander (ohne sie zu berühren) auf die getrockneten PO / Lam / FN 10 cm Teller. Wenn die Platte ausreichend getrocknet worden ist, haben die Tröpfchen gut sollten Kanten definiert und nicht ausgeführt werden.
    Hinweis: Dies schafft eine hohe Dichte lokalen Umgebung für die Zellen, was wichtig ist, wenn die Zellen Replattierung, während Raum für Expansion innerhalb der Schale zu halten.
  6. Lassen Sie die Tropfen für 10-20 min bei RT stehen Zellen zu ermöglichen, haften dann langsam (nicht die anhaftenden Zellen zu stören) 10 ml Voll Melanozyten Medium. Bewegen Gericht in den Inkubator.

5. Ausweitung der Melanozyten Vorläufern

  1. Weiter mit Voll Melanozyten Medium Fütterung alle 2 bis 3 Tage.
    Hinweis: Die Pigmentierung sollte sichtbar sein, beginnen wnnerhalb Cluster von Zellen, die durch das Ende der ersten Woche und sehr klar in der zweiten Woche werden. Sehen Sie sich die Platte über einen weißen Hintergrund wie ein Blatt Papier diese frühen kleinen, dunklen Cluster zu erkennen. Die Zellen werden sich zunehmend pigmentierte im Laufe der Zeit, bis die gesamte Platte gleichmäßig pigmentiert ist (siehe 2B).
  2. Passage-Zellen einmal pro Woche in einem Verhältnis von ~ 1: 6 (plating als Tröpfchen ist nicht mehr notwendig in dieser Phase). Verwenden Sie Accutase zu Zellen trennen und waschen zweimal mit klarem Neurobasalmedium vor dem erneuten Plattierung in Full Melanozyten Medium. Pflegen Zellen auf PO / LAM / FN-Platten.
    Hinweis: Wir haben festgestellt, dass die Voll Melanozyten Medium eignet sich am besten für die Erhaltung und den Ausbau hESC und iPS-derived Melanozyten. Jedoch können Zellen in handelsüblichen M254 Medium kultiviert kurz sein, aber die vereinfachte Medien erhöht das Risiko von Zellen sterben und der Platte abheben.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll stellt ein Verfahren zur effizienten in einem in vitro - Feeder frei, Kosten vollständig pigmentiert, reife Melanozyten aus hPSCs Ableiten und reproduzierbar. Im Gegensatz zu dem zuvor festgelegten Fang et al. Protokoll für HPSC abgeleitetes Melanozyten, wird das umrissenen Protokoll nicht konditionierten Medium erfordern , und verringert den Zeitbedarf. Der Fang et al. Protokoll konditioniertes Medium aus einer Wnt3a produzierenden Maus - Zell...

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Diskussion

Für die erfolgreiche Differenzierung von Melanozyten aus hPSCs sollten die folgenden Vorschläge in Betracht gezogen werden. In erster Linie ist es wichtig, zu allen Zeiten unter sterilen Kulturbedingungen zu arbeiten. Zusätzlich ist es wichtig, mit pluripotenten zu beginnen, vollständig undifferenzierte hPSCs; wenn die Ausgangspopulation differenzierten Zellen enthält, wird die Ausbeute immer fallen, da die Verunreinigungen nicht in Richtung Melanozyten gerichtet werden und die richtig differenzierenden Zellen noch weit...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine widerstreitenden Interessen offen zu legen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium für Melanom-Forscher von der Joanna M. Nicolay-Stiftung und von den National Institutes of Health unter Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F31 unterstützt. Diese Arbeit wurde weiter durch Zuschüsse aus NYSTEM und der Tri-institutionellen Stammzellen Initiative (Starr Foundation) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
apo humanes TransferrinSigmaT1147
Ascorbinsäure (L-AA)SigmaA4034100 mM
B27 (B27 Ergänzung)Invitrogen17504044
β-MercaptoethanolGibco-Life Technologies21985-02310 mg/ml
BMP4R& D Systems314-bp
CHIR99021Tocris-R& D Systems44236 mM
CholeratoxinSigmaC805250 mg/ml
cAMP (cyclicAMP)SigmaD0627100 mM
DexamethasonSigmaD2915-100MG50 μ M
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco-Life Technologies11985-092
DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nährstoffmischung F-12Gibco-Life Technologies1133--032
DMEM/F12 PulverInvitrogen12500-096
EDN3 (Endothelin-3, human)American Peptide Company88-5-10B100 μ M
FibronektinBD Biosciences356008200 μ g/ml
Gelatine (PBS ohne Mg/Ca)im Haus0,1% in PBS
GlukoseSigmaG7021
HumaninsulinSigmaI2643
ITS+ Universal Culture Supplement Premix BD Biosciences354352
KSR (Knockout-Serumersatz)Gibco-Life Technologies10828-028
Knockout DMEMGibco-Life Technologies10829-018
L-GlutaminGibco-Life Technologies25030-081
LDN193189Stemgent04-0074100 mM
mit niedrigem Glukosegehalt11885-084
Matrigel-MatrixBD Biosciences354234Auflösen 1:20 in DMEM/F12
MCDB201 MediumSigmaM6770
MEM Minimum essentielle Aminosäuren LösungGibco-Life Technologies11140-080
embryonale Fibroblasten der Maus (7 Millionen Zellen/Fläschchen)GlobalStemGSC-8105M
Maus Laminin-IForschung & Forschung D Systems3400-010-011 mg/ml
Neurobasales MediumInvitrogen21103049
Penicilin/StreptomycinGibco-Life Technologies15140-12210.000 U/ml
Poly-L Omithin HydrobromidSigmaP365515 mg/ml 
ProgesteronSigmaP87830,032 g in 100 ml 100
Ethanol PutrescindihydrochloridSigmaP5780
FGF2 (rekombinante humane FGF basisch)R& D Systems233-FB-001MG/CF10 mg/ml
SB431542Tocris-R& D Systems181410 mM
SelenitSigmaS5261
NatriumbicarbonatSigmaS5761
SCF (Stammzellfaktor, rekombinant Mensch)Peprotech Inc.300-0750 μ g/ml
TYRP1 (G-17) AntikörperSanta Cruz104431:200
TYRP2 AntikörperAbcam740731:200
Trypsin-EDTA (0,05%)Gibco-Life Technologies25300-054
Y-27632 DihydrochloridTocris-R& D Systems125410 mM
DMEM Invitrogen%

Referenzen

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Schlagwörter

MelanozytendifferenzierungNeuralleistendifferenzierungWNT BMP EDN3 SignalisierungDual SMAD Inhibitionselektive MediumkulturAnreicherung von Melanozytenvorl ufernvoll pigmentierte MelanozytenZellabl sungsl sungPO Laminin Fibronectin Beschichtung
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