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Methodenartikel

Pflegen Primäre Nasenepithelzellen von Kindern und umprogrammieren in induzierte pluripotente Stammzellen

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DOI:

10.3791/53814

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10. März 2016

 ,  ,  ,  , 
1Pyrosequencing Core, Cincinnati Children's Hospital, 2Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital, 3Division of Pulmonary Medicine, Seattle Children's Hospital, 4Division of Asthma Research, Cincinnati Children's Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Veröffentlichung demonstriert Methoden zur erfolgreichen Probenahme und Kultivierung der Nasenepithelschleimhaut von Kindern und zur Reprogrammierung dieser Zellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs).

Zusammenfassung

Nasenepithelzellen (NECs) sind der Teil der Atemwege, der auf Luftschadstoffe reagiert und sind die ersten Zellen, die mit Atemwegsviren infiziert sind. Sie sind auch an vielen Atemwegserkrankungen durch ihre angeborene Immunantwort und die Interaktion mit Immun- und Atemwegsstromazellen beteiligt. NECs sind aufgrund ihrer Zugänglichkeit während klinischer Besuche für Studien an Kindern von besonderem Interesse. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) wurden aus mehreren Zelltypen gewonnen und sind ein leistungsfähiges Werkzeug für die Modellierung der menschlichen Entwicklung und Krankheit sowie für ihre potenziellen Anwendungen in der regenerativen Medizin. Dies ist das erste Protokoll, das Methoden für die erfolgreiche Generierung von iPSCs aus NECs von pädiatrischen Teilnehmern zu Forschungszwecken festlegt. Es wird beschrieben, wie Nasenepithelzellen von Kindern gewonnen werden, wie aus diesen Proben primäre NEC-Kulturen generiert werden und wie primäre NECs in gut charakterisierte iPSCs umprogrammiert werden. Nasenschleimhautproben sind nützlich für epidemiologische Studien im Zusammenhang mit den Auswirkungen der Luftverschmutzung bei Kindern und stellen ein wichtiges Instrument zur Untersuchung von Atemwegserkrankungen dar. Primäre Nasenzellen und daraus gewonnene iPSCs können ein Werkzeug sein, um unbegrenztes Material für die patientenspezifische Forschung in verschiedenen Bereichen der Epithelbiologie der Atemwege, einschließlich der Asthma- und COPD-Forschung, bereitzustellen.

Einleitung

Induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen Proben (hiPSCs) sind eine sich schnell entwickelnde Technologie der Stammzellforschung. Sie bieten eine Alternative zu embryonalen Stammzellen (hES) Forschung mit weit weniger ethischen und moralischen Nachteile 1,2. Obwohl sie zu hESCs 3-5 nicht epigenetically identisch sind, bieten eine einzigartige Möglichkeit hiPSCs Entwicklung und Krankheit Phänotypen zu modellieren, und sie können 5-8 aus Geweben mit Bezug auf die Krankheitszustand ableiten. Neue Methoden der Erzeugung von hiPSCs ständig erforscht werden optimale Zelltypen zu identifizieren , als eine Möglichkeit , mit zu beginnen, GMP-Qualität iPSCs für eine Transplantation geeignet, die Vorbereitung und auch 6,9-11 die Aktualität und Effizienz der Reprogrammierung zu erhöhen.

Epithelzellen der Atemwege sind kritisch für die Entwicklung von allergischen Entzündung 12 und das Epithel ist ein Haupttreiber von allergischen Reaktionen und Atemwegs Remodeling durch Interaktion mit Immune und Stromazellen. Das Atemwegsepithel spielt eine wesentliche Rolle bei der Entstehung und Persistenz von Lungenerkrankungen wie Asthma. Jedoch niedriger Epithelzellen der Atemwege sind schwierig in einer klinischen Umgebung, insbesondere von gesunden Kontrollpatienten und Kinder zu erhalten. Daten aus mehreren Studien unterstützen die Annahme , dass Epithelzellen aus Nasenschleimhaut sind ein gültiger und praktische Proxy für niedrigere Epithelzellen der Atemwege 13-20, vor allem , wenn Antworten auf Luftschadstoffe und Allergene zu studieren. Die Nasenschleimhaut besteht aus mehr als 90% ciliated Epithelzellen der Atemwege und Probenahme diese Nasenepithelzellen (NECs) leicht bei Kindern im Alter von vier Jahren oder fünf durchgeführt werden, da sie weniger invasiv als andere Zell- / Gewebeprobenahmetechniken und ist im Zusammenhang mit einem minimalen Risiko von unerwünschten Ereignissen wie Infektionen 20-23. Es bietet eine schnelle und einfache Möglichkeit, sowohl bei gesunden und kranken Kindern ohne lange, unnötige und oft schmerzhaft Bronchoskopie procedu zu probierenres, die Sedierung erforderlich machen. Frühere Studien haben festgestellt , dass Krankheit Asthma Schwere verwandte Subtypen können die Nasenschleimhaut in sowohl als auch Proben bronchial Zelle von asthmatischen Kindern genommen unterschieden werden, und der Genexpression zwischen den beiden Gewebetypen war ähnlich in etwa 90% der nicht-ubiquitären Gene 22 , 24. Als Quelle für iPSCs, NECs bieten Vorteile gegenüber anderen Zelltypen häufig verwendet. Fibroblasten werden häufig für iPSC Erzeugung verwendet, aber obwohl diese Zellen leicht kultiviert, aus einer Hautbiopsie sein kann, dieser Vorgang erfordert typischerweise Lokalanästhesie, einen Einschnitt und Nähten ist und mit einem gewissen Infektionsrisiko verbunden. Daher kann für diese Art der Biopsie von Patienten informierte Einwilligung schwierig sein 25. Eine Alternative zu Fibroblasten ist peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs). Jedoch kann es schwierig sein, ausreichend Blut für iPSC Generation von pädiatrischen Patienten zu erhalten. Darüber hinaus gibt es Einschränkungen nachgeschalteter apkationen für Fibroblasten und Blutzellen abgeleitet iPSCs, vor allem ihre Differenzierungsfähigkeit auf bestimmte Zelltypen 5,26. Daher die relative Zugänglichkeit und der geringen Gefahr von Nebenwirkungen im Anschluss an ihre Sammlung gegeben, NECs stellen eine ideale Zellquelle für iPSC Generation von pädiatrischen Populationen.

iPS-Zellen haben für das Studium der menschlichen Entwicklung, Herstellung neuer Krankheitsmodelle, und als eine potenzielle Quelle von Zellen für personalisierte Therapien eine Menge Aufmerksamkeit vor kurzem als Plattform erhalten. Bevor das volle Potenzial dieser Technologie realisiert werden kann, müssen die molekularen Grundlagen der Umprogrammierung aufgeklärt werden, aber jetzt dieses Protokoll und die im beschriebenen Verfahren werden die Forschung Studien konzentrierten sich auf Atemwegs Belichtungen aufzuklären, sowie eine Plattform für die Auswirkungen der personalisierten Medizin zu studieren Beteiligung iPSCs.

Die gemeinsame Arbeit von mehreren Labors hat zur gene geführtn für eine erfolgreiche Technik nicht nur für die Nasenschleimhaut Abtastung, sondern auch NECs Züchten und Umprogrammieren diese Zellen zu iPSCs 23. Dieser Artikel gibt einen Überblick über ein Protokoll für eine optimale Probenahme, Züchtung und Neuprogrammierung Bedingungen.

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Protokoll

Das folgende Protokoll folgt den Richtlinien der Organe menschlichen Ausschuss Forschungsethik.

1. Probenahme der Nasenschleimhaut

HINWEIS: Sie erhalten Proben von Probanden, die frei von Anzeichen einer Atemwegsvirusinfektion sind.

  1. Bereiten Sie eine 15 ml konischen frisch vor dem Teilnehmer besuchen und 2 ml BEGM (Bronchial Epithelzellwachstum Medium) plus 20 ul sterile Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%).
  2. Offene Zytologie Bürste kurz vor der Entnahme der Probe, und achten Sie darauf, Pinsel steril zu halten und berühren Sie es nicht zu irgendwelchen Oberflächen neben den Nasenflächen.
  3. Fragen Sie Teilnehmer, still zu sitzen und den Kopf kippen in Richtung Decke. Haben kleinere oder unruhiger Kinder sitzen auf ihren Händen und / oder Liegen weg swatting Bürste zu vermeiden.
  4. Richten Sie Pinsel auf der Rückseite der Nase, wo der Durchgang (Sieht aus wie ein kleines schwarzes Loch) verengt. Schieben Sie Bürste nach unten und drehen Sie die Handgelenke wie die Bürste aus nostri entferntl.
  5. Legen Sie Pinsel in konisch und versenken in BEGM. Das überstehende Bürste und ersetzen Kappe auf dem Rohr. NICHT VORTEX.
    HINWEIS: Wenn der Teilnehmer bereit ist, eine zweite Bürste in der gleichen Weise erhalten, aber in der zweiten Nasenloch. ein Bürsten der beiden Nüstern Gewinnung führt zu einer höheren Wahrscheinlichkeit zur Folge haben, dass die Probenahme erfolgreich sein wird. die gleiche Nasenloch Probenahme kann zu Blutungen und wird wahrscheinlich nicht um die Probe zu verbessern.
  6. Halten Proben so nahe 37 ° C wie möglich während des Transports einen Becher mit warmem Wasser.

2. Zellzahl und Cytospin

  1. leicht bewegen Sie die Bürste in BEGM und 10 ul der Probe für eine Zellzahl nehmen einen Hemacytometer verwenden. In 10 ul einer Live / Dead-Fleck und zählen nur Zellen unter einem Mikroskop leben.
  2. Bis zu 50 & mgr; l der Probe und mit Wasser auf 200 ul mit 1x PBS. In den Cytospin Trichter an Glasobjektträger und Spin bei 300 Umdrehungen pro Minute für 2 min. Lassen Sie gleiten trocken O / N und Flecken Rutsche following Anweisungen des Herstellers. Erlauben O / N, vorzugsweise im Dunkeln zu trocknen.
  3. Stain Slide mit Hema 3 Stain
    1. Bringen Sie jede Lösung (Hema Fixiermittel, hellblau; Hema 3 Lösung I, rosa und Hema 3 Lösung II, tiefblau) in eine Färbung Schale; Halten bedeckt, wenn sie nicht in Gebrauch ist. Legen Sie Dias in Färbesystems Boot
    2. Dip Slides kontinuierlich in Fixiermittel für 30 Sekunden, dann lassen Überschuss ablaufen lassen. Dip Slides kontinuierlich in Lösung I für 30 Sekunden, dann überschüssiges abtropfen lassen. Dip Slides kontinuierlich in Lösung II für 30 Sekunden, dann überschüssiges abtropfen lassen
    3. Spülen mit VE-Wasser, bis das Wasser klar bleibt. Erlauben O / N, vorzugsweise im Dunkeln zum Trocknen
  4. Schauen Sie sich Schlitten unter dem Mikroskop und Zählen von Zellen bestimmen Prozentsatz von Epithelzellen. Sollte 90% oder mehr, wenn Probenahme gut ist.

3. Seeding Zellen

HINWEIS: Führen Sie alle Zellkulturverfahren in einem richtigen und zertifizierten GewebekulturKapuze mit steriler Technik.

  1. Coat-Platten mit Rinderhautkollagen (BDC), Typ 1. In 0,5 ml 3 mg / ml BDC verdünnt in 49,5 ml 1x PBS. Bereiten weniger, wenn nur wenige Platten verwendet. Mantel eine T25-Flasche mit 2 ml BDC und Inkubation in sterile Haube O / N oder bei 37 ° C für 2 Stunden, falls erforderlich.
  2. Nach der Inkubation aspirieren jede verbleibende Flüssigkeit. Expose Flaschen mit UV-Licht für 30 Minuten in sterilen Haube. Shop-Flaschen für bis zu einem Monat bei 4 ° C, aber bringen sie auf RT oder 37 ° C, bevor Zellen Aussaat.
  3. Halten Sie Bürste und Zellen in BEGM bei 37 ° C, bis sie bereit zu säen. Leicht Swish Bürste innen konisch, aber nicht vortexen.
    1. Platte 7 x 10 5 Zellen in einem T25 - Kolben. Wenn es weniger ist, verwenden Sie einen kleineren Behälter, wie eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. Diese Größe Platte erfordert etwa 3 x 10 5 Zellen.
      HINWEIS: Wenn es nicht so viele Zellen sind, ist es nicht ratsam ist, fortzusetzen.
  4. Unter einer sterilen Haube nehmen Bürste aus Rohr und gently drehen Bürste auf der Oberfläche des beschichteten Kolben, darauf achten, daß die Beschichtung zu kratzen. Entsorgen Sie Bürste in einem geeigneten Behälter für biologischen.
  5. Langsam Pipette die restlichen Zellen in BEGM aus dem konischen und in den T25-Flasche. Beachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Eine Anzahl von schwimmenden Zellen wird beobachtet werden , und es kann einige Trümmer von der Nase sein, die in dieser Stufe (3A) akzeptabel ist.

4. Zellkultur

  1. Nachdem die Zellen Aussaat, lassen Sie sie für 48 Stunden ohne Unterbrechung (Abbildung 3) zu begleichen. Nach 48 Stunden, fügen Sie langsam und vorsichtig 2 ml warmem BEGM und 20 ul sterile penicilin / Streptomycin / Fungizone (P / S / F).
    HINWEIS: NICHT die ursprünglichen 2 ml Medium absaugen.
  2. Am 4. Tag nach der Aussaat, sorgfältig alle Flüssigkeit absaugen und ersetzen mit 4 ml frisch, erwärmt BEGM und 1x Pen / Strep (Fungizon ist nicht mehr erforderlich). Ändern Medien alle zwei Tage und bewerten Zellen anhängenment, das Wachstum und Zusammenfluss. Wenn die Zellen erreichen ~ 80% Konfluenz, in der Regel in 2-3 Wochen, sind sie bereit, agiert werden.
  3. Einem T25 - Kolben (etwa 2,5 x 10 6 Zellen , wenn sie konfluent) in drei T25 Kolben oder einem T75 - Kolben passagiert werden. Nach dem ersten Durchgang sollten die Zellen robust und gesund sein, Einmündung etwa alle drei Tage zu erreichen.

5. Passagierung Zellen

  1. aspirieren vorsichtig die Medien von der Platte. 1 ml 0,05% Trypsinlösung pro T25-Flasche an der Platte und in den Inkubator für etwa 4 min, oder bis die Zellen lösen sich von Platte. Überprüfen Sie die Höhe der Ablösung von Zellen alle 2 Minuten und nicht verlassen Trypsin auf mehr als 10 min.
  2. 5 ml Trypsin-Neutralisationslösung (TNS) oder serumhaltigen Medien das Enzym zu neutralisieren. Entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit und Zellen aus dem Kolben und in einem 15 ml konischen Röhrchen.
  3. Zentrifuge bei 200 xg (Beschleunigung 0 Verzögerung 0) für 5 min ein Zellpellet zu erhalten. absaugen supernatant und resuspendieren Zellen in BEGM + P / S in dem Volumen für die neuen Flaschen erforderlich (4 ml für einen T25-Kolben wurden 10 ml für einen T75-Kolben)
  4. Führen Zellzahl mit einem Live / Dead-Fleck wie oben (2.1) beschrieben. Fügen Sie entsprechende Menge an BEGM und Zellen zu den beschichteten Kolben und zurück in den Inkubator. Halten , wie detaillierter oben oder Kryokonservierung Medium (70% BEGM, 20% FBS und 10% DMSO) in einer Konzentration von 0,5-2 x 10 6 Zellen pro ml in einfriert.

6. Umprogrammierung zu iPS-Zellen

HINWEIS: Vor dem iPSCs Erzeugung gewährleisten die Einhaltung aller institutionellen Regelungen, die Erzeugung und Verwendung von menschlichen iPS-Zellen gelten. Sterile Technik ist besonders wichtig für iPSC Kulturen, als Kulturmedium routinemßig keine Antibiotika enthalten. Es ist wichtig, dass NECs scheinen gesund und kräftig sind proliferative für erfolgreiche Neuprogrammierung.

  1. Tafel 5 x 10 5 NECs pro Vertiefung einer 6 - Well - Gewebekulturplatte. Nach 24 Stunden hinzufügen Polybrenzu BEGM bis zu einer Endkonzentration von 8 & mgr; g / ml und transduzieren NECs durch lentivirale Partikel exprimieren Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc zu den Medien hinzugefügt wird. Richten Sie eine Vielzahl der Infektion (MOI) von ~ 5 27 zu erreichen.
    1. Um das MOI Bestimmung, bereiten serielle Verdünnungen der konzentrierten-lentiviralen Lager und HT1080-Zellen mit diesen Verdünnungen transduzieren. Nach dem ersten, durch die Bewertung der Anzahl von dTomato-positive Zellen / kleine Klumpen von Zellen in jeder Verdünnung die Anzahl der "transduzierenden Einheiten / ml" unzweideutig Detektion dTomato Expression in den HT1080-Zellen, zu berechnen.
      HINWEIS: In der Regel wird es Verdünnungen sein, die zu hoch sind (alles ist dTomato positiv) und zu niedrig (kein oder nur ein paar positive Zellen).
    2. Führen Sie Scoring aus den Verdünnungen, in denen diskrete positive Zellen / kleine Klumpen von Zellen identifiziert. Bestimmen des Titers durch die Anzahl der Korrektureinheiten / ml mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor transduzieren. MOI ist dann das Verhältnis der Zahlvon 27 Zellen auf die Anzahl von Viruspartikeln transduziert.
      HINWEIS: Jede dTomato positive Zelle / kleine Klumpen wird angenommen, aus einem einzigen Viruspartikel entstehen.
  2. Etwa 3 Stunden nach der Transduktion, entfernen Medien und ersetzen mit frischen BEGM. Entsorgen Sie Lentiviren haltigen Medien mit institutionell genehmigten Verfahren. Zurück transduzierten NECs in den Inkubator für 3 Tage.
  3. Am Tag 3 ersetzen Medien mit frischen BEGM und dann für weitere 3 Tage inkubiert. Absaugen verbrauchte Medien, Zellen mit 1x PBS waschen und 1 ml 0,05% Trypsinlösung zum Brunnen hinzuzufügen. Passage-Zellen mit Trypsin, wie oben (Abschnitt 5) geschrieben. vorsichtig absaugen Überstand und resuspendieren Zellen in 4 ml BEGM + P / S. Die Zellen können zu einer neuen Vertiefung einer 6-Well-Platte mit BDC oder hinzugefügt, um MEF Kulturen, wenn bereit (siehe nächster Schritt) beschichtet agiert werden.
  4. Bereiten Sie MEF-beschichtete Platten. Am Tag 4 0,1% Gelatine-Lösung (1 ml / Well) bis 2 Vertiefungen einer 6-Well hinzufügen (auszuführen +/- Thiazovivin (SPT) siehe Schritt 6.6). Auf der nächstenTag, ein Fläschchen mit inaktivierten MEF 28 aufzutauen.
  5. Platzieren MEFs in 10 ml MEF Medien (DMEM + 1x NEAA + 10% dFCS). Spin bei 200 xg für 5 Minuten zu pelletieren. Resuspendieren in MEF Medien. Absaugen Gelatine aus 6 - Well - Platte und fügen 1,87 x 10 5 MEFs pro Vertiefung der Gelatine beschichtete 6 - Well - Platte. O / N bei 37 ° C inkubieren, oder für mindestens 24 Stunden.
  6. Transfer 2 ml BEGM enthaltenden Zellen transduziert pro Vertiefung in zwei Vertiefungen einer zuvor beschichteten 6-Well-Platte und Inkubation O / N. Am nächsten Tag, ersetzen BEGM mit 2,5 ml pro Vertiefung von Standard hESC Medien mit 4 ng / ml basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor. Feed-Zellen mit frischen hESC Medien +/- SPT täglich für 10 Tage
    HINWEIS: Es ist möglich , einen Cocktail aus kleinen Molekülen (SB431542, PD0325901 und Thiazovivin (SPT) Cocktail) hinzuzufügen , für NECs 23 , um die Effizienz und die Kinetik der Reprogrammierung zu verbessern.
  7. Nach zehn Tagen weiterhin täglich mit hESC Medien ohne SPT zu ernähren. Feed-Kulturen täglich bis hESC artige Kolonienerscheinen (5A, P0 Kolonie). Identifizieren Kolonien mutmaßliche iPSCs durch ihren hohen Kern: Zytoplasma-Verhältnis und prominenten Nukleolen.
  8. Manuelles Verbrauch und Transfer Kolonien mit hESC förmige Morphologie zu trennen Brunnen für Kultur und Expansion als separate Leitungen in einem Zubringer freies System. Abgeschnittene Kolonien sollten sich schnell an diese Bedingungen angepasst werden.
    1. Nach dem Plattieren exzidiert Kolonien werden diese diskreten putative iPSC Linien nun Passage betrachtet 1 (p1). Futterkulturen täglich mit mTeSR1. Passage und erweitern iPSC Linien unter Verwendung von Standardverfahren. Es kann mehrere Tage bis zu einer Woche dauern, p1 Kolonien, die Größe zu erreichen, an dem sie agiert werden soll.

7. Die Aufrechterhaltung iPSCs in Kultur

  1. Düngung und bewerten Kulturen täglich. Manuelle Verbrauchsbereiche mit einem sterilen Glaspipette oder Mikropipette durch Schaben Spitze offenkundige Differenzierung zeigen. Ändern Medien nach der täglichen Kommissionierung.
  2. Passage-Zellen nach der Angleichungpro Vertiefung einer 6-Well-Platte (die Hälfte der Fütterung Volumen), dann bei 37 ° C für ca. 4 min vorsichtig absaugen Medien, 1 ml warmem Dispase (1 mg / ml) hinzu: dig alle vier Tage. Die Ränder der Kolonien beginnen, zu heben, die um die Kolonie wie ein weißer Umriss aussieht. aspirieren vorsichtig die Dispase und wasche 3x mit erwärmtem DMEM / F12.
  3. 2 ml mTeSR1 und verwenden Sie einen Zellheber, die Kolonien von der Platte zu heben. Verwenden Sie eine 5 ml serologische Pipette oder P1000 Mikro sanft um die Zellen zu verreiben, bis die Kolonien in kleinere Cluster gebrochen werden.
    1. Vermeiden Sie sehr kleine Cluster oder einzelnen Zellen produzieren, als das Überleben und die anschließende Proliferation wird suboptimal sein. Wenn Kolonien wieder Plattierung, ein 1: 4 bis 1: 6 Split wird eine optimale Kolonie Dichte aufrechtzuerhalten. Sanft Kolonien und Medien von der Platte zu entfernen und zu neuen, Matrigel beschichteten Vertiefungen hinzuzufügen.

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Ergebnisse

Der erste Teil der Nase, der Nasenvorhof genannt wird , ist der Bereich von Knorpel umgeben 29. Die Bürste muss glatt gehen vorbei diesem Bereich der Nase, über die Nasenklappe (Ostium internum oder das "schwarze Loch" auf der Rückseite des Nare zu sehen ist ), und die Probe wird von der unteren Nasenmuschel (Abbildung 1) erhalten. Die Nasenmuscheln sind knöcherne Strukturen, die die Oberfläche der Nase 29, so dass sie eine ideale Lage für...

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Diskussion

Nasale Epithelzellen (NECs) sind eine leicht zugängliche Plattform für Atemwegserkrankungen zu studieren und NEC-iPS - Zellen bieten einen spannenden Weg die Entwicklung der Krankheit, Behandlung und Therapie 1,31,32 zu erkunden. NECs kann leicht ohne stressig oder potenziell schädlichen Verfahren 6,23 erhalten werden. Unserer Erfahrung nach der Probenahme der Nasenschleimhaut, wie in diesem Protokoll beschrieben wird weniger Stress und besser als die Blutentnahme für Kinder wahrgenommen werden. Da...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren möchten die pluripotente Stammzelle der Einrichtung und dem konfokalen Imaging-Core in Cincinnati Kinderkrankenhaus anzuerkennen. Diese Arbeit wurde von R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) und 2U19AI70235 (GKKH) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 ml konischFisher Scientific14-959-49DProtokoll Schritt 1.1.
BEGMLonzaCC-3170Protokoll Schritt 1.1.
Penn/Strep/FungizidLife Technologies15240-062Protokoll Schritt 1.1.
Penn/StrepLife Technologies15140-122Protokoll Schritt 4.a.
Cytosoft ZytologiebürsteFisher Scientific22-263-357Protokoll Schritt 1.2.
TrypanblauFisher ScientificMT-25-900-CIProtokoll Schritt 2.1.
HämazytometerFisher Scientific02-671-54Protokoll Schritt 2.1.
PBSFisher ScientificBP2438-4Protokoll Schritt 2.2.
Zytologie-Trichter-ClipsFisher Scientific10-357Protokoll Schritt 2.2.
Cytospin-TrichterFisher Scientific23-640-320Protokoll Schritt 2.2.
Cytospin 4Fisher ScientificA78300003Protokoll Schritt 2.2.
Leerer ObjektträgerFisher ScientificS95933Protokoll Schritt 2.2.
hema 3 FärbesetFisher Scientific22-122-911Protokoll Schritt 2.2.
Rinder Dermal Colagen, Typ 1Life TechnologiesA1064401Protokoll Schritt 3.2.
T25 FlascheFisher Scientific08-772-45Protokoll Schritt 3.3.
TrypsinLonzaCC-5012Protokoll Schritt 5.2.
Trypsin-NeutralisationslösungLonzaCC-5002Protokoll Schritt 5.2.
Fötales Kälberserum (FBS), hitzesterilisiert bei 65 μde; C für 30 minSigma-AldrichF2442Protokoll Schritt 5.5.
Dimethylsulfoxid Hybri-Max, steril filtriert, BioReagenz, geeignet für Hybridome, ≥ 99.7%Sigma-AldrichD2650Protokoll Schritt 5.5.
polycistonisches Lentivirus*z.B. MilliporeSCR511Protokoll Schritt 6.4. 
Eine kommerzielle Quelle für die Reprogrammierung von Vektoren ist aufgeführt. Wir verwenden routinemäßig das von Voelkel et al. berichtete 4-in-1-Plasmid (PMID: 20385817), um VSV-G-pseudotypisiertes polycistronisches Reprogrammierungslentivirus im eigenen Haus zu generieren. Dieses Plasmid kann durch Kontaktaufnahme mit  
PolybreneSanta Cruz Biotechnologiesc-134220Protokoll Schritt 6.4.
Bestrahlte CF1 MEFsGlobalStem GSC-6301G-ProtokollSchritt 6.4.
hESC-MedienSiehe Rezept im ProtokollProtokoll Schritt 6.11.
SB431542Stemgent04-0010Protokoll Schritt 6.11.
PD0325901Stemgent04-0006Protokoll Schritt 6.11.
Thiazovivin Stemgent04-0017Protokoll Schritt 6.11.
hESC-qualifiziertes MatrigelBD Biosciences354277Protokoll Schritt 6.13.
Corning-Platte, 6 WellFisher Scientific08-772-1BProtokoll Schritt 6.13.
mTeSR1StemCell5850Protokoll Schritt 6.13.
250 ml Einweg-Filterkolben (0,22 &Mikro; m)FisherSCGP-U02-RE 
dispaseStemCell7923Protokoll Schritt 7.3.
DMEM/F12Life Technologies11320-033Protokoll Schritt 7.3.
ZellheberFisher Scientific08-100-240Protokoll Schritt 7.4.
hESC Media**Protokoll Schritt 6.11.
Komponenten sollten gemischt und anschließend filtriert werden. Medien können bei 4 Grad aufbewahrt werden; C für bis zu zwei Wochen. Beim Erwärmen von Medien nicht bei 37 ° C belassen; C länger als 15 min
DMEM-F12 50/50 MedienInvitrogen  11330-032Endkonzentration
KO-Ersatzserum (KO-SR)Invitrogen10828-0280,2
200 mM L-GlutaminInvitrogen25030-0811 mM
55 mM ß-mercaptoethanol Invitrogen21985-0230,1 mM
100x nicht-essentielle AminosäurenInvitrogen11140-0501x
2 & micro; g/ml Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (b-FGF)Invitrogen13256-0294 ng/ml

Referenzen

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