Systembiologie der Stoffwechselregulation von Estrogen Receptor Signaling bei Brustkrebs

Zusammenfassung

Die Integration von Daten aus genomweiten Sequenzierungsexperimenten und Metabolomik-Experimenten ist eine Herausforderung. In dieser Arbeit berichten wir zum ersten Mal über die Generierung, Analyse und Integration von Transkriptom-, Cistrom- und Metabolomdaten von Brustkrebszellen, die mit Östradiol behandelt wurden.

Zusammenfassung

Mit dem Aufkommen der -omics nähert sich unser Verständnis der chronischen Krankheiten wie Krebs und metabolische Syndrom hat sich verbessert. Allerdings effektive Abbau von den Informationen in den großen Datenmengen, die von Genexpression Microarrays, deep sequencing Experimente oder metabolischen Profils erhalten werden ist wichtig, zu entdecken und dann effektiv die kritischen Regulatoren der erkrankten Zelle Phänotypen Ziel. Estrogen Receptor α (ERa) ist einer der Master-Transkriptionsfaktoren, die Gen-Programme regulieren, die für Östrogen-responsiven Brustkrebs wichtig sind. Um Rolle von ERa Signalisierung bei Brustkrebs Stoffwechsel zu verstehen, verwendeten wir transkriptomischen, cistromic und Metabolom-Daten aus MCF-7 mit Östradiol behandelten Zellen. In diesem Bericht beschrieben wir Generation von Proben für die RNA-Seq, ChIP-Seq und Metabolomik Experimente und die integrative Computeranalyse der erhaltenen Daten. Dieser Ansatz ist nützlich bei der Abgrenzung Roman Maulwurfdere Mechanismen und genregulatorischen Schaltungen, die durch einen bestimmten Transkriptionsfaktor, der Auswirkungen auf den Stoffwechsel von normalen oder erkrankten Zellen reguliert werden.

Einleitung

Östrogene sind wichtige Regulatoren von vielen physiologischen Prozessen in beiden Frauen und Männern einschließlich der reproduktiven Gewebe, metabolischen Gewebe, Gehirn und Knochen ^1. Neben positiven Auswirkungen in diesen Geweben, treiben Östrogene auch Krebserkrankungen, die aus Brust und reproduktive Gewebe entstehen. Östrogene vor allem durch ERs arbeiten zelltypspezifische Effekte zu induzieren. Tief Sequenzierung von Transkripten von ERa geregelt unter Verwendung von RNA-Seq und genomweite ERa DNA-Bindungsstellen-Analyse ChIP-Seq Verwendung erwies sich als nützlich, um zu verstehen, wie ERa in verschiedenen Geweben und Krebsarten arbeitet, die aus....

Protokoll

1. Herstellung von RNA-Proben Seq

1. Zellkultur und Behandlung
   1. Kultur die MCF7 - Zellen in einer verbesserten MEM (IMEM) und Phenol-rot - Medium mit 10% Hitze inaktiv FBS, 1% Penicillin / Streptomycin bei 37 ° C in befeuchteten 5% CO ₂ -Atmosphäre.
      Hinweis: Der gleiche Zelllinie und Zellkulturbedingung wird während der gesamten Studie verwendet.
   2. Seed 100.000 MCF7-Zellen pro Well in 6-Well-Platten. Haben Sie für jede Behandlung Triplikaten. Am Tag 3 , das Medium zu entfernen und 2 ml frisches Medium hinzu , mit oder ohne 10 ^-8 M E2 zu jeder Vertiefung. Inkubieren der Platten für 24 h in 37 ° C in befeuchteter 5% ....

Ergebnisse

Transcriptomics
Zur Analyse differentiell exprimierten Gene durch E2-Behandlung, wählten wir einen RNA-Seq-Experiment durchzuführen. Darüber hinaus Ebenen Informationen über mRNA zur Bereitstellung, RNA-Seq-Daten können auch in nicht-kodierende RNA (lange nicht-kodierenden RNAs, microRNAs) und alternative Spleißen Ereignisse zu überwachen Änderungen verwendet werden. Wir haben keine Informationen über die Analyse von nicht-kodierenden RNAs oder alternativ Gene transkribiert, da Ra.......

Diskussion

In dieser Arbeit haben wir beschrieben, Erzeugungs- und integrative Analyse von RNA-Seq, ChIP-Seq und metabolomics Daten von MCF-7-Zellen, die mit E2 behandelt werden. Wir entwickelten eine Reihe von Protokollen, die effizientesten Methoden und benutzerfreundlichen Soft-Ware zu verwenden strategizing, die biologisch relevante Entdeckung produzieren. Um unser Wissen, unsere ist die erste Studie -omics Daten aus drei verschiedenen Analysen und identifiziert neue Stoffwechselwege, die ERa direkt geregelt in Brustkrebszelle.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Triglycerid-Mix	Sigma	17810-1AMP-S
Ölsäure	Sigma	O1257-10MG	Ölsäure-wasserlösliches Pulver
TRIzol Technologien für die Lebensdauer von Reagenzien		15596-026
Dynabeads Protein A	Lebenstechnologien	10006D
Dynabeads Protein G	Lebenstechnologien	10007D
QIAquick PCR-Aufreinigungskit	QIAGEN	28106	DNA-Isolierung der Eingangsprobe
ZYMO ChIP-DNA-Isolationskit	Zymo Forschung	D5205	ChIP DNA Reinigen & Konzentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA-Assay-Kit	Invitrogen	P7589	DNA-Quantifizierung
RNase-freies DNase-Set	QIAGEN	79254	RNA-Aufreinigung
DEPC-behandeltes Wasser	LIFE TECH	Dnase/RNASE-freies
Modell 120 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB120110	Mit 1/8 Sonde
Fisher Scientific Schallgehäuse	Fisher Scientific	FB-432-A	Zur Schalldämmung
Eppendorf Tuben 5,0 ml	Eppendorf	0030 119.401	200 Tuben (2 Beutel à 100 Stück)
Zufällige Grundierungsmischung	NEB	S1330S
DNTP MIX	NEB	N0447S
M-MuLV Reverse Transkriptase	NEB	M0253S
FastStart SYBR Green Master	ROCHE	4673484001
Agarose	Fisher	BP160100	1,5 % Agarosegel;
Qubit RNA HS Assay Kit	Technologien für die Lebensdauer	Q32852	RNA-Quantifizierung (100 Assays)
Formaldehyd	Sigma	F8775
Proteasehemmer Tabletten	Roche	4693116001	Jede Tablette reicht für 10 ml Lysepuffer
PhosSTOP Phosphatasehemmer Cocktail Tabletten	Roche	4906845001	Jede Tablette reicht für 10 ml Lysepuffer
Qubit Assay Kits	Lebenstechnologien	Q32850	Für 100 Assays
Automatisierter Zellzähler	ORFLO	MXZ000
Röhrchen-Rotator	VWR	10136-084
Victor X5 Multilple Plattenlesegerät	PerkinElmer	2030-0050
Mikrozentrifuge 5417R	Eppendorf	22621807
Magnetstativ	Diagenode	B04000001
Schnelles Real-Time-PCR-System	Angewandte Wissenschaft

462224 4351405