Introduction
Angeborene Immunzellen bilden einen wesentlichen Teil der Zellen innerhalb der Tumor - Mikroumgebung und wurden mit Tumor Malignität in Patienten und Tiermodellen von Krebs 1 verbunden. Vor kurzem hat es sehr geschätzt werden , dass eine chronische Immunreaktionen eine entscheidende Rolle bei der Förderung der Tumorprogression, Metastasierung und Resistenz gegen Chemotherapien 2 spielen. Makrophagen sind wichtige angeborenen Immunzellen , die direkt gezeigt worden ist, um Tumorzellantwort auf Chemotherapie 3,4 regulieren. Allerdings ist die Rolle der Neutrophilen, wichtige Akteure in der angeborenen Immunsystems, bei der Regulierung der Tumor Reaktion auf Anti-Krebs-Behandlung nicht bekannt. Die Ziele dieser Protokolle sind eine schnelle und glaubwürdige Methode zu verwenden Neutrophilen von CLL Patienten Blutproben zu trennen und HL60-Zellen entlang der granulocytic Weg, um ihre Rolle zu unterscheiden bei der Regulierung der Empfindlichkeit von Lymphomzellen zu Anti-Lymphom-Agenten zu studieren.
5 und wirken als erste Verteidigungslinie gegen Mikroorganismen 6 eindringen. Neutrophile haben eine wesentliche Rolle 7 wirksam angeborenen Immunantwort zusätzlich zu den variablen Effektor - Funktionen in verschiedenen pathologischen Zuständen in steigenden. Daher ist eine schnelle und glaubwürdige Methode Neutrophile von anderen Blutzellen, wie Dichtegradient - Trennverfahren zu isolieren, ist für in vitro - Studien erforderlich. Unter Verwendung dieses Verfahrens zur Isolierung von Neutrophilen erleichtert die weitere Forschung auf Neutrophilen-vermittelten immunologischen Funktionen in vivo und ex vivo.
Die Fähigkeit , reine Populationen von Neutrophilen zu erhalten , ist ein wichtiger erster Schritt für die Untersuchung von Patienten mit immunologischen Erkrankungen 8. Dichtegradienten-Trennungsverfahren ist ein ideales Verfahren, bei dem eine hohe Ausbeute an Zellen erhalten wird. Die method beinhaltet die Zugabe von Dichtegradient-Lösung in den Boden eines Röhrchens verdünnten Humanblut durch Zentrifugation für 35 min bei 300 g ohne Bruch enthält, gefolgt. Der Ring der einkernigen Zellen erscheint an der Schnittstelle und die Neutrophilen liegen unterhalb des ersteren. Diese Verfahren haben erhebliche Vorteile gegenüber anderen verfügbaren Verfahren, wie Neutrophilen - Isolierungs - Kits , die 9 viel teurer sind. Zusätzlich Neutrophilen aus menschlichem Blut durch kommerzielle Kits unter Verwendung von Antikörpern, die an einen Oberflächenmarker spezifisch für humane Neutrophile, erhöhen das Risiko von Zell-Aktivierung oder Differenzierung zu isolieren. Dichtegradienten Trennungsverfahren erlaubt die Isolierung von neutrophilen Granulozyten innerhalb eines kurzen Zeitraums. Innerhalb der gleichen Schritt werden mononukleäre Zellen ebenfalls abgetrennt und gewonnen. Es ist eine grundlegende Technik, bei dem eine hohe Ausbeute an reinen Zellen, um erhaltene funktionelle Integrität zu erzielen.
Um den Tumor microenv zu imitierenironment wurden 3D-Experimente durchgeführt. In Anbetracht der kurzen Halbwertszeit von Neutrophilen in vitro, sind die 3D - Experimente mit frischen menschlichen Neutrophilen nicht schlüssig. Dimethylsulfoxid (DMSO) und Retinsäure (RA) mit Hilfe der Differenzierungsinduktoren Aus diesem Grund promyelocytic (HL60-Zellen) induziert in Neutrophilen-ähnliche Zellen zu differenzieren. Mit differenzierten HL60 - Zellen (HL60 diff) wird verhindert , dass unterschiedliche Reaktionen von Neutrophilen, die aufgrund Isolierung von verschiedenen Spendern.
In - vitro - 3D - Kulturmodelle stellen eine Zwischenstufe zwischen In - vitro - 2D - Modelle und in vivo Modellen. Im 2D-Kultur, breiteten sich die Zellen auf Kunststoff-Oberfläche unnatürliche Zelle Anhänge abgeschiedenen Proteine bilden, die auf dieser synthetischen Oberfläche denaturiert werden. Umgekehrt können die Zellen in 3D-Kulturform natürliche Zell-Zell-Anlagen, da die Zellen und die extrazelluläre Matrix synthetisieren sie das natürliche Material, an dem sie angebracht sind.Aus diesem Grund 3D Kokultur Modellen, insbesondere zwischen Krebszellen und anderen Zelltypen, ist der Beitrag zu Tumorwachstum, Angiogenese und Metastasierung sehr nützlich für die Anzeige. Als Ergebnis machen 3D - Kulturen die Zellkultur , die physiologischen Bedingungen nachahmen , die mit 10 in vivo existieren.
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Protocol
1. Neutrophilen-Isolierung und Co-Kultur mit primären leukämischen Zellen
HINWEIS: Die Verfahren wurden im Rahmen der Genehmigung von Lyon Krankenhaus Ethikkommission bei allen Patienten durchgeführt, informierte Zustimmung zu unterzeichnen.
- Isolierung von primären leukämischen Zellen und Neutrophile
- Sammeln Sie Rohre aus dem peripheren Blut auf EDTA (1,8 mg EDTA pro Milliliter Blut) von Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie diagnostiziert (CLL).
- Ist jeweils mit 15 ml Blut in einen sterilen 50 ml-Röhrchen und verdünnt mit 15 ml RPMI (Verdünnung 1: 1), dann vorsichtig und langsam 15 ml Dichtegradient-Lösung auf den Boden des Rohres, ohne die Phasen zu vermischen. Sicherzustellen, dass der Dichtegradient-Lösung bei RT für die Zubereitung ist.
- Zentrifuge bei 300 × g für 35 min bei RT ohne Bremse. Das Blut sollte in vier verschiedene Phasen trennen , wie in Figur 1A von oben nach unten gezeigt: Thrombozyten und Plasma, mononukleäre Zellen (white Ring), Dichtegradientenlösung, Granulozyten und Erythrozyten.
- Sammeln Sie den weißen Ring, der die primären leukämischen Zellen mit einer Kunststoff-Pasteur-Pipette und an einem neuen 50-ml-Tube darstellt.
- Das Rohr wird mit PBS (enthält Calcium und Magnesium) bis zu 50 ml in total und Zentrifuge bei 300 g für 10 min bei RT.
- bis zu 50 ml in total und Zentrifuge bei 300 g für 10 min bei RT das Pellet mit 5 ml PBS dann PBS hinzu.
- Das Pellet mit komplettem RPMI-Medium (RPMI 1640 mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin) zum Zählen der Lebensfähigkeit der Zellen-Zähler verwendet wird.
- Aspirieren die oberen Phasen der Granulozyten und Erythrozyten-Phase verlassen und PBS summieren sich zu 25 ml dann 3% Dextran in 0,9% NaClup in insgesamt 50 ml hinzu. Mischen Sie die Röhrchen 10 Mal und halten sie für 30 min bei RT ohne sich zu vermischen.
- Sammeln Sie die obere RBC-armen Neutrophilen Schicht eind sie in ein sauberes steriles 50 ml Röhrchen platzieren und die Röhrchen bei 300 g für 10 min bei RT zentrifugiert. bis zu 50 ml insgesamt resuspendieren jedes Pellet mit 5 ml PBS dann Puffer Lyse der Erythrozyten hinzufügen.
- Halten der Rohre in Dunkelheit für 15 min bei RT, dann bei 500 g für 10 min bei RT zentrifugiert. Waschen Sie die Pellets mit PBS (add PBS bis zu 50 ml insgesamt) bei 500 g zentrifugiert werden für 10 min bei RT.
- Resuspendieren der Pellets mit komplettem RPMI-Medium zum Zählen der Lebensfähigkeit der Zellen Zähler verwendet wird. Halten Sie 3 x 10 5 jeder Zelltyp in 50 ul PBS-FBS (4%) in 5 ml Kunststoffröhrchen , die Reinheit ihrer Isolation zu bestimmen , mittels Durchflusszytometrie.
- Analysieren Sie die Morphologische Einsätze der isolierten Zellpopulationen
- Dazu resuspendieren je 3 x 10 4 Neutrophilen und 3 x 10 4 mononukleären Zellen in 150 & mgr; l komplettes RPMI Medium. Montieren Sie die Glasobjektträger, Filterkarten und Probenkammern in der Cytospin Zentrifuge, um sicherzustellen, dass ter Zentrifuge ist gut ausbalanciert.
- Platzieren Sie jede Zelltyp in die Probenkammer und Zyto-Zentrifuge bei 750 × g für 10 min bei RT Entfernen Sie die Folien, Filterkarten und Probenkammern aus der Zentrifuge. Disassemblieren vorsichtig, um nicht die Zellen auf dem Objektträger zu beschädigen. Entsorgen Filterkarten und Probenkammern.
- Stain die Zellen mit Giemsa-Kit und halten Sie die Folien für 1 Stunde trocknen lassen. Untersuchen Sie die Zellen unter dem Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung.
- Testen Sie die Reinheit der isolierten Zellen durch FACS
- Beschriften der isolierten primären leukämischen Zellen , die mit anti-human CD19 - Antikörper , konjugiert an APC (5 & mgr; l / 10 6 Zellen). Beschriften der gereinigten Neutrophilen mit einer Mischung aus anti-human - Antikörper aufgelistet in Tabelle 1 (5 & mgr; l / 10 6 Zellen). Inkubieren der Zellen in Dunkelheit für 30 min bei 4 o C.
- Waschen Sie die Zellen mit 500 ul PBS-FBS (4%) der Zentrifuge die Röhrchen bei 300 g für 5 min bei RT.
- Resuspendieren jedes Pellet in 200 & mgr; l PBS-FBS (4%).
- Analysieren Sie mit einem Durchflusszytometer, mit dem folgenden optischen Konfiguration: 488-nm-Laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP ), PE (575/26 BP); 633-nm-Laser: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). Sicherstellen, dass die Farbkompensation.
- Cokultur von primären leukämischen Zellen mit Autologe Neutrophile
- Seed 2 x 10 5 Zellen / ml der primären leukämischen Zellen allein oder mit autologem Neutrophilen im Verhältnis 1:10 in komplettem RPMI - Medium. Dazu Zellzahlen durch Verdünnen von Zellsuspensionen einzustellen und mit 2 x 10 5 Zellen / ml der primären leukämischen Zellen zu 2 x 10 6 Zellen / ml Neutrophilen. Vorsichtig mischen.
- Zugeben von 25 & mgr; M Bruton-Tyrosinkinase (Btk) -Inhibitor (Ibrutinib) zu den Zellen. Inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Zellernte und FACS Analyse
- Collect die Zellen in 5 ml Kunststoffröhrchen für die FACS-Analyse und zentrifugiert bei 300 g für 5 min bei RT die Rohre. Waschen der Pellets mit 1 ml PBS-FBS (4%), dann bei 300 g für 5 min bei RT zentrifugiert.
- Resuspendieren Pellets in Annexin V und PI kommerziellen Kits und die Zellen in Dunkelheit für 10 min bei RT inkubiert. Analysieren Sie mit einem Durchflusszytometer die Gating - Strategie von 2A mit und der folgenden optischen Konfiguration: 488 - nm - Laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). Sicherstellen, dass die Farbkompensation.
2. Differenzierung von HL60-Zellen entlang der Granulozytäre Pathway und ihre Cokultur mit RL-Lymphom B-Zellen in 3D-Modell
- Differenzierung von humanen promyelocytic (HL60) Zellen in Neutrophilen-ähnliche Zellen
- Einstellen HL60 Zellzahl bis 3 x 10 5 Zellen / ml fügen Sie dann 1 uM Retinsäure (RA) und 1,25% DMSO deren Differenzierung zu induzieren. Samen je 3 x 10 5 2 bei 37 ° C für 48 Stunden inkubiert.
- Später wurden die Zellen und Zentrifuge bei 300 g für 5 min bei RT sammeln. Resuspendieren der Zellen mit komplettem RPMI-Medium zum Zählen der Lebensfähigkeit der Zellen Zähler verwendet wird.
- Dann Zellsuspension in komplettem RPMI - Medium verdünnt auf HL60 Zellzahl bis 3 x 10 5 Zellen / ml und induzieren wieder ihre Differenzierung durch Zugabe von 1 & mgr; M Retinsäure (RA) und 1,25% DMSO einzustellen. Samen je 3 x 10 5 HL60 - Zellen pro Well in 48-Well - Platte und Inkubation für weitere 48 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Analyse von HL60 Differenzierung (HL60 diff)
- Sammeln Sie die Zellen und Zentrifugieren der Röhrchen bei 300 g für 5 min bei RT. Das Pellet mit komplettem RPMI-Medium zum Zählen der Lebensfähigkeit der Zellen Zähler verwendet wird.
- Um die Änderungen in der Zelloberflächenmarker-Expression mittels Durchflusszytometrie analysiert. Legen Sie jedes 3 x 10 5 5 Zellen HL60 diff in 5 ml Kunststoffröhrchen für die FACS - Analyse und zentrifugieren die Röhrchen bei 300 g für 5 min bei RT.
- Resuspendieren der Pellets in 50 & mgr; l PBS-FBS (4%). Beschriften der Zellen mit anti-Mensch - CD11b konjugiert AF700 oder anti-human CD38 , konjugiert an APC (5 & mgr; l / 10 6 Zellen). Inkubieren der Zellen in Dunkelheit für 30 min bei 4 o C.
- Waschen mit 500 ul PBS-FBS (4%), dann bei 300 g für 5 min bei RT zentrifugiert. Resuspendieren der Pellets in 200 ul PBS-FBS (4%).
- Analysieren Sie auf Durchflusszytometer mit der Gating - Strategie von 3A und die folgende optische Konfiguration: 488 - nm - Laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP); 633-nm-Laser: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
- Um die morphologischen Veränderungen in HL60 diff zu testen, zu immobilisieren , die Zellen auf Glasobjektträger für die mikroskopische Untersuchung.
- Um dies zu tun, resuspendieren jedes 3 x 10
- Platzieren Sie jede Zelltyp in die Probenkammer und Zyto-Zentrifuge bei 1500 Umdrehungen pro Minute für 10 Minuten bei RT. Entfernen Sie die Folien, Filterkarten und Probenkammern aus der Zentrifuge. Disassemblieren vorsichtig, um nicht die Zellen auf dem Objektträger zu beschädigen. Entsorgen Filterkarten und Probenkammern.
- Stain die Zellen mit Giemsa-Kit und halten Sie die Folien für 1 Stunde trocknen lassen. Untersuchen Sie die Zellen unter dem Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung.
- Um dies zu tun, resuspendieren jedes 3 x 10
- 3-dimensionale (3D) Kultur
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Materialien, die in diesem Experiment verwendet werden, sind kalt und das Experiment auf Eis stattfindet.- Resuspendieren je 5 x 10 4 RL - Zellen, entweder allein oder mit HL60 diff gemischt diff 1:10 mit 300 Matrix ul Basalmembran 1 ml Pipettenspitze mit einer sterilen Schere , um die Öffnung zu etwa 2 bis 3 mm zu erweitern geschnitten werden. Vermeiden Blasen während dieses Schritts.
- Samen je 300 ul Zellsuspension / Well in 24-Well-Platte. Vermeiden Blasen während dieses Schritts. Die Platte für 30 Minuten bei 37 ° C mit 5% CO 2 dann 1 addieren ml RPMI - Medium für jede Vertiefung und Inkubation für 7 Tage bei 37 ° C mit 5% CO 2 abzuschließen. Ändern Sie das Medium alle zwei Tage. In 10 nM Vincristin am Tag 5.
- FACS - Analyse
- Nach 7 Tagen Kultur absaugen Medium und waschen Sie jede Vertiefung mit 1 ml eiskaltem PBS zweimal. 3 ml / Vertiefung von eiskaltem PBS-EDTA (5 mM). Nehmen Sie das Gel aus dem Boden des Bohrlochs durch Abkratzen der Unterseite von 200 ul Pipettenspitze. Schütteln Sie die Platte vorsichtig auf Eis für 30 min.
- Übertragen Zellsuspension in sterile 15-ml-Röhrchen und schütteln die Röhrchen sanft auf ice für weitere 30 min. Überprüfen Sie, ob das Auftreten von homogenen Zellsuspension. (Wenn es nicht der Fall ist, dann schütteln die Zellen für längere Zeit oder mehr hinzufügen PBS-EDTA).
- Zentrifugiere die Röhrchen bei 300 xg für 10 min bei RT. Waschen Sie die Pellets mit PBS dann bei 300 g für 10 min bei RT zentrifugiert werden.
- Resuspendieren mit PBS-FBS (4%) und Etikett mit anti-human - CD19 - Antikörper an PE-Cy7 konjugiert und Anti-Human - CD38 - Antikörper konjugiert an APC (5 & mgr; l / 10 6 Zellen). In dunklen Inkubieren für 30 Minuten bei 4 ° C.
- Waschen mit 500 ul PBS-FBS (4%), dann Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min bei RT. Resuspendieren der Zellen mit Annexin V und PI kommerziellen Kits.
- Analysieren Sie auf Durchflusszytometer mit der Gating - Strategie von 4A und die folgende optische Konfiguration: 488 - nm - Laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633-nm-Laser: APC (660/20 BP). Sicherstellen, dass die Farbkompensation.
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Representative Results
Dichtegradiententrennung hier beschriebenen Verfahren liefert primären leukämischen Zellen und unstimulierte aus dem Blut von CLL - Patienten isoliert Neutrophilen 1A die verschiedenen Blutschichten nach Dichtegradientenzentrifugation (von oben nach unten darstellt , die erhalten. Blutplättchen und Plasma, weißen Ring der einkernigen Zellen darstellt, Dichtegradientenlösung, Granulozyten und Erythrozyten). 1B und 1C zeigen die Unterschiede in den morphologischen Erscheinungs zwischen Neutrophilen (mehrlappigen Kerne Zellen) und mononukleäre Zellen sind.
In 1D Die Ergebnisse stellen die Vorwärtsstreuung (FSC) vs Seitenstreuung (SSC) Plot von primären leukämischen Zellen (einkernigen Zellen). Kennzeichnung dieser Population mit anti-human CD19 , konjugiert an APC zeigt eine vollständige Verschiebung nach rechts des Histogramms (Abbildung 1E) mit nur einemSpitze, die zeigt, dass diese Bevölkerung für CD19 und rein positiv ist. Neutrophile sind auch ≥90% rein , wie mittels Durchflusszytometrie überprüft , nachdem die isolierten Neutrophilen mit einer Mischung aus Fluorochrom-konjugierten monoklonalen Antikörper Kennzeichnung in Tabelle 1 aufgelistet. 1F stellt FSC vs SSC Streudiagramm der isolierten Neutrophilen , die für CD45 - positiv sind (Abbildung 1G), positiv für CD15 und negativ für CD14 (Abbildung 1H), positiv für CD15 und CD16 (1I), positiv für CD16 und negativ für CD56 (Abbildung 1J).
Abbildung 1. Analyse der Morphologische Einsätze und Reinheit der primären leukämischen Zellen und Neutrophile , isoliert aus dem Blut des Patienten. (A) Schematische Darstellung repräsentiert verschiedene Blutschichten nach Dichte gradient Zentrifugierung. (BC) Giemsa - Färbung stellt die morphologischen Unterschiede zwischen (B) Neutrophile und (C) primären leukämischen Zellen (mononukleäre Zellen). Die Fotos werden von Mikroskop mit 100 - facher Vergrößerung aufgenommen wurden. (D) Zukunftsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) Plot stellt die isolierte primäre leukämische Zellpopulation. (E) Isolierte primären leukämischen Zellen wurden mit anti-CD19-APC markiert und für die Expression von CD19 analysiert. Die rote Linie zeigt die unmarkierten Zellen und die blaue Linie zeigt an mit Anti-CD19-APC markierten Zellen. (F) FSC vs SSC Streudiagramm stellt die isolierten neutrophilen Population. (GJ) Isolierte Neutrophile wurden in Tabelle mit einer Mischung aus Antikörpern markiert 1 und für die Expression von (G) CD45, (H) CD14 und CD15, (I) CD15 und CD16, (J) CD16 ein analysiertesd CD56. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Antigene | Fluorochrom | Klon |
| CD14 | APC-Vio770 (Cy-7) | TÜK4 |
| CD15 | APC | VIMC6 |
| CD16 | FITC | VEP13 |
| CD45 | PerCP-Vio700 (Cy5.5) | 5B1 |
| CD56 | PE | AF12-7H3 |
Tabelle 1 fluorochromkonjugierten Gereinigte monoklonale Antikörper verwendet , um die Reinheit der isolierten Neutrophile zu testen. Alle Antikörper von Miltenyi Biotech erhalten wurden.
2A stellt die Tore von Neutrophilen und primären leukämischen Zellen. Neutrophile sind viel genauer als die primären leukämischen Zellen, so dass sie mit höheren SSC erscheinen. Gating auf der primären leukämischen Zellen kokultiviert mit Neutrophilen in Gegenwart von Ibrutinib zeigen die Ergebnisse höherer Prozentsatz an alive - Zellen (2C, 84,8%) im Vergleich zu den Zellen, die allein (2B, 53,1%). Die Box Graph in 2D zeigt , dass die Verklee der Lebensfähigkeit von Zellen Ibrutinib induziert wurde durch die Anwesenheit von Neutrophilen (40,1 ± 3,1 vs 60,1 ± 3,5, p <0,001, 19 Patienten) signifikant gehemmt.
Abbildung 2. Die autologe Neutrophile Primäre leukämischen Zellen gegen Ibrutinib. Blut schützen , wurde von Patienten mit der Diagnose chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) gesammelt. Primären leukämischen Zellen wurden isoliert und kultiviert, allein oder zusammen mit autologem Neutrophile (N) bei primären leukämischen Zellen: NRATIO 01.10 für 24 h in Gegenwart oder Abwesenheit von 25 uM Ibrutinib. Der Prozentsatz von lebenden primären leukämischen Zellen (ANHANG IV V negativ / PI negativ) durch Doppelfärbung mit Annexin V-FITC und PI, gefolgt von Durchflusszytometrie - Analyse. (A) Zukunftsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) gemessen wurde , Plot stellt die Tore von Neutrophilen und primären leukämischen Zellen. (B) Bi-dimensionalen - Dot-Blot zeigt mit 25 uM Ibrutinib leukämischen Zellen am Leben und apoptotische primären allein kultiviert und behandelt den prozentualen Anteil. (C) Bi-dimensionalen - Dot-Blot zeigt den prozentualen Anteil am Leben und apoptotische primären leukämischen Zellen zeigt Co- kultiviert mit Neutrophilen und mit 25 & mgr; M Ibrutinib behandelt. (D) Box - Plot stellt den Prozentsatz der lebenden primären leukämischen Zellen von 19 Patienten. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. *** p <0,001 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Die kurze Halbwertszeit von Neutrophilen in vitro macht ihre Verwendung in 3D - Kultur ineffektiv. Differenzierung von HL60-Zellen entlang dem Weg granulocytic wurde durch Differenzierungsinduktoren induziert. Zwei verschiedene Parameter (Zelloberflächenmarker Ausdruck und morphologische changes) wurden verwendet, um die Differenzierung von HL60 zu messen. FSC vs SSC Streudiagramm in 3A zeigen , dass HL60 - Zellen sind größer im Vergleich zu HL60 diff Zellen mit höheren FSC. Beschriftung der Zellen (HL60 oder HL60 diff) mit Anti-Human - CD11b Antikörper gegen AF700 konjugiert und anti-human CD38antibody konjugiert an APC zeigt eine Zunahme der CD11b und CD38 - Expression (3B) auf die Differenzierung , die ein Hinweis auf granulocytic Differenzierung ist. HL60 diff Zellen zeigen auch morphologische Veränderungen nachgewiesen durch das Auftreten von mehrlappigen Kerne (3C).
Abbildung 3. Strukturparameter von Differentiated HL60 - Zellen. (A) Zukunftsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) Plots darstellen HL60 und differenzierten HL60 - Zellen (HL60 diff). (B) HL60 und HL60 diff - Zellen wurden mit anti-CD11b-AF700 oder anti-CD38-APC mittels Durchflusszytometrie Analyse gefolgt markiert. Nach Gating auf jeder Zellpopulation im FSC-A vs. SSC-A Streudiagramm (A) wurden die Zellen für die Ausdrücke von CD11b oder CD38 analysiert. (C) HL60 - Zellen zeigen morphologische Veränderungen im Einklang mit Differenzierung zu Granulozyten. Fotos wurden mit einem Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung. Bold schwarzer Pfeil zeigen die Multi-gelappten Kern. Graphen sind repräsentativ für fünf unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Zum Testen der Wirkung von HL60 - Zellen auf diff Regulieren RL Zellantwort auf Vincristin in 3D - Modell, RL - Zellen wurden alleine oder mit HL60 diff in Basalmembran - Matrix in der Gegenwart oder Abwesenheit von Vincristin bei 10 n kultiviertM. Mit Hilfe der Gating - Strategie in 4A gezeigt ist , sind beide Populationen basierend auf CD19 und CD38 Expression diskriminiert; RL Zellen positiv für CD19 und HL60 diff Zellen positiv für CD38. Gating auf RL - Zellen co-kultiviert mit HL60 diff - Zellen in Anwesenheit von Vincristin, zeigen die Ergebnisse , höherer Prozentsatz der lebenden Zellen (4C, 35,9%) im Vergleich zu RL - Zellen, die allein (4B, 19,7%). Das Balkendiagramm in 4D zeigt einen signifikanten Anstieg des Anteils der am Leben RL - Zellen (CD19 positive Annexin V negativ / PI negativ) in Gegenwart von HL60 diff - Zellen (19,5 ± 0,2 vs 33,1 ± 1,0, p <0,001).
Abbildung 4. Neutrophilen-like HL60 diff Zellen schützen RL - Lymphom - Zellen gegen Vincristin in 3D - Kultur. RL Zellen für 7 Tage in Basalmembranmatrix HL60 diff Verhältnis 1.10: Es wurden allein oder zusammen mit HL60 diff Zellen bei RL kultiviert. Am Tag 5, Vincristin (VCR) wurde bei einer Konzentration von 10 nM zugegeben. Sphäroide wurden an Tag dissoziiert 7 und die Zellen wurden mit anti-CD19-PECy7 und Anti-CD38-APC dann mit Annexin V-FITC und PI gefolgt von durchflusszytometrischen Analyse. (A) Vorwärtsstreu (FSC) und Seitenstreuung resuspendiert markiertem (SSC) Plot stellt die Tore der RL - Zellen und HL60 diff - Zellen. (B) Bi-dimensionalen - dot-Blot zeigt den prozentualen Anteil am leben und apoptotischen Zellen RL allein kultiviert und mit 10 nM Vincristin. (C) Bi-dimensionale punkt- Blot zeigt den prozentualen Anteil am leben und apoptotische RL Zellen co-kultiviert mit HL60 diff und mit 10 nM Vincristin behandelt. (D) das Balkendiagramm den Prozentsatz der am leben RL Zellen darstellt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. *** P ≤0.001.jove.com/files/ftp_upload/53846/53846fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hier beschrieben, eine wirksame, einfach, schnell und preiswert Protokoll zur Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem Blut mit hoher Reinheit Dichtegradientenzentrifugation Ansatzes und innerhalb der gleichen Schritt mononukleären Zellen werden ebenfalls abgetrennt und gewonnen. Die isolierten Zellpopulationen sind ≥90% rein.
Es sind mehrere Verfahren für neutrophile Isolierung aus menschlichem Blut zur Verfügung. Diese umfassen ähnliche Verfahren unter Verwendung von diskontinuierlichen Gradienten 11,12 oder unter Verwendung von kommerziellen Kits für die Neutrophilen - Isolierung durch positive Immun magnetische Selektion während denen Neutrophile sind immuno-magnetische markiert mit spezifischen Antikörper wie anti-human CD16 dann durch Bindung des CD16- angereicherten Neutrophile positive Zellen auf einem Magnetsäule 13. Kommerzielle Kits mit negativen immuno-magnetische Auswahl stehen ebenfalls zur Verfügung, während der das Vollblut oder Granulozyten-Suspension werden mit einem Cocktail aus Antikörpern markiert, die auf andere Zellen binden Than Neutrophilen 9 (dh Antikörper - Komplexe , die RBCs, Blutplättchen und unerwünschte Zellen, wie CD2, CD3, CD9, CD19, CD36, CD56, Glycophorin A und Dextran-beschichtete magnetische Partikel Label), dann angereichert Neutrophilen durch Elutionszeit als Antikörper- negative Fraktion von Zellen, die auf der Magnetspalte nicht bindet. Zusätzlich kann durch Fluoreszenz - aktivierte Neutrophile , isoliert werden 14 Zellsortierung.
Einige Techniken wurden hohe Ausbeuten an reinen Neutrophilen zu schaffen gezeigt, wie positive Immun magnetische Auswahl. Jedoch weist dieses Verfahren Nachteile im Vergleich zu Dichtegradientenzentrifugation Methoden aufgrund der Markierungsmittel, die auf der Oberfläche von Neutrophilen bindet, und dies könnte möglicherweise ihre Funktion verändern, indem ihre Aktivierung oder die Differenzierung zu induzieren. Auch mit dem positiven Immuno-magnetische Auswahlmethode, die Antikörper-markierten Neutrophilen binden auf einer magnetischen Säule zur Trennung und kann dies auch ihre Funktion beeinflussen.Fluorescence Activated Cell Sorting hat eine weitere Einschränkung insofern, als dieses Verfahren mehr Zeit benötigt, um die Zellen zu sammeln, die sich negativ auf das Überleben von Neutrophilen aufgrund ihrer kurzen Halbwertszeit beeinflussen können.
Dichtegradientenzentrifugation Verfahren sind sehr vergleichbar und die Neutrophilen-Reinheit 90% unter Verwendung beider Verfahren nicht übersteigen kann, aber die erstere ist eine Zwei-Schicht-Gradienten, die im Vergleich zu Schichtung Gradienten Lösung technisch weniger anspruchsvoll ist, die von 40% bestehen, 60% und 80% vol / vol in PBS. Es wurde von Swamydas et al erwähnt. 15 , daß ein Vermischen der Gradientenlösung Schnittstellen häufig Ort aufgrund der geringen Dichteunterschiede zwischen den drei Schichten erfolgt. In Bezug auf die negativen immuno-magnetische Auswahl Ansätze haben sie auch berichtet worden , 9 zur Isolierung von Neutrophilen mit hoher Reinheit und Lebensfähigkeit wirksam zu sein. Ihr Vorteil gegenüber positive Immun magnetische Auswahl und Fluorescence Activated Cell Sorting ist, dass Neutrophilesind nicht mit Markierungsmittel und nicht binden an magnetische Säule, wodurch vermieden Zellaktivierung, aber diese Methode ist viel teurer und zeitaufwendig im Vergleich zu Dichtegradienten-Methode markiert.
Neutrophile laufen normalerweise schnelle spontane Apoptose sowohl in vitro als auch in vivo 16,17. HL60promyelocyticcells behalten viele Eigenschaften der humanen Leukozyten - Vorläufern, wie dem Potential Differenzierung in 18 Neutrophile zu unterziehen. Im Gegensatz zu Neutrophilen, tun HL60 diff Zellen nicht schnell Apoptose und diese Zellen unter Verwendung löst sich die Mühe, die unterschiedliche Reaktionen von Neutrophilen aufgrund ihrer Isolation von verschiedenen Spendern.
Vor kurzem werden 3D-Kulturen reifer und relevant für die menschliche und tierische Physiologie und ein attraktives Modell für verschiedene biologische Forschung vor allem auf dem Gebiet der Krebs. Die Musterverschiebung von 2D zu 3D Kultur schreitet schnell voran since letzteren ist auffälliger während 19 verschiedenen pathologischen Zuständen wie Krebs zu studieren. Es gibt eine zunehmende Bewusstsein für die Nachteile der 2D - Kultur , in der zu einer Zelle der Umgebung eine dritte Dimension hinzuzufügen wichtig ist , um 20 einen genaueren Blick auf die Bedeutung der zellulären Interaktionen zu nehmen und die Unterschiede in der Zellverhalten und Eigenschaften zu studieren. 3D - Kultur schafft einen lebenden Organismus eine Umgebung , ähnlich den in (z. B. Mensch) , was zu mehr relevante Forschung. Jedoch beinhaltet 3D-Kultur das komplexe Zusammenspiel zwischen den verschiedenen Partnern wie Zellen, extrazelluläre Matrix und interstitielle Flüssigkeiten, die in der 2D-Kultur nicht vorhanden tun. So werden sich die Anstrengungen erforderlich, um Verfahren Kalibrierung zu etablieren und auf eine gute Laborpraxis sowie eine effektive Versorgung zählen vor allem die Handelsmarken, die ausgiebig getestet und überwacht werden.
Der Tumor-Mikroumgebungviele Immunzellpopulationen einschließlich besteht aus mehreren Zelltypen, die in teilnehmen und tumorigenesis, Metastasierung und das Ansprechen auf Anti - Krebs - Mittel 21,22 regulieren. Mehrere Studien haben gezeigt , dass in Tumoren eine Zunahme der neutrophilen Infiltration signifikant mit erworbener Resistenz gegen mehrere Antikrebsmittel wie Anti-VEGF - Therapie 23,24 korreliert. Darüber hinaus Erhebung in der Neutrophilen - Vorbehandlung bei Patienten mit metastasiertem Nierenzellkarzinom zählen 25, sowie das Vorhandensein eines hohen intratumorale Neutrophile bei Patienten mit verschiedenen soliden Tumoren, 26 wurden als prognostische Faktoren für das Überleben schlechte vorgeschlagen. Unsere Studie legt nahe, dass Neutrophile eine Rolle spielen können Lymphom B-Zellen von Krebsmittel-induzierte Apoptose zu schützen.
Zusammenfassend beschrieben die zuverlässige und reproduzierbare Verfahren hier kann von jedem Labor eingesetzt werden Neutrophile und mononuklearen Zellen von Summen zu sammelnein Blut. Darüber hinaus präsentiert die Differenzierung von HL60-Zellen entlang der granulocytic Weg, um einige Neurophil Probleme wie die schnelle spontane Apoptose zu vermeiden. Diese Ansätze wurden verwendet, um die Rolle der neutrophilen Granulozyten auf die Empfindlichkeit von Lymphomzellen zu Anti-Lymphom-Agenten zu studieren, wo Neutrophile eine schützende Wirkung auf Lymphomzellen gegen diese Agenten zeigen mit Hilfe von 2D-und 3D-Kultursystemen. Diese Ansätze können für eine Vielzahl von Neutrophilen funktionelle Studien verwendet werden, die das Verständnis der neutrophilen Rolle in der Krebsbiologie vertiefen sollen. Insbesondere kann dieses Verfahren das Übersprechen zwischen Neutrophilen und Tumorzellen oder zwischen Neutrophilen und anderen Komponenten der Mikroumgebung besser zu nutzen verstehen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) | Life technologies | 25030-024 | |
| Penicillin streptomycin (Pen Strep) | Life technologies | 15140-122 | |
| Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) | CliniSciences | A3001 | |
| Vincristine | EG labo | ||
| BD Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment |
| Red cell lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll (Pancoll) | PAN Biotech | P04-60500 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Euromedex | S3014 | |
| Annexing V-FLOUS staining kit | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
| LSRII flow cytometry | BD Biosciences | ||
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA microscope | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter | Nexcelom Bioscience |
References
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