Selektive Ernte von Marginating-Lungen-Leukozyten

Zusammenfassung

Marginating-pulmonale Leukozyten weisen im Vergleich zu anderen Leukozytenpopulationen einzigartige Eigenschaften und unterschiedliche immunologische Funktionen auf. Hier beschreiben wir die selektive Entnahme dieser Subpopulation von Lungenleukozyten durch erzwungene Perfusion der Lunge bei Ratten und Mäusen. Marginating-pulmonale Leukozyten scheinen entscheidend für die Bestimmung der Anfälligkeit für durch Blut übertragbare und lungenbedingte Krankheiten zu sein.

Zusammenfassung

Marginating-pulmonale (MP) Leukozyten sind Leukozyten, die am inneren Endothel der Lungenkapillaren haften. Es wurde gezeigt, dass MP-Leukozyten im Vergleich zu Leukozyten anderer Immunkompartimente eine einzigartige Zusammensetzung und Eigenschaften aufweisen. Es gibt Hinweise auf eine höhere Zytotoxizität natürlicher Killerzellen und ein ausgeprägtes pro- und antiinflammatorisches Profil der MP-Leukozytenpopulation im Vergleich zu zirkulierenden oder Milzimmunozyten. Das hierin vorgestellte Verfahren ermöglicht die selektive Entnahme von MP-Leukozyten durch erzwungene Perfusion der Lunge bei Mäusen oder Ratten. Im Gegensatz zu anderen Methoden zur Extraktion von Lungenleukozyten, wie z. B. dem Zerkleinern von Gewebe und dem biologischen Abbau, werden bei dieser Methode ausschließlich Leukozyten aus den Lungenkapillaren gewonnen, die nicht mit parenchymalen, interstitiellen und broncho-alveolären Zellen kontaminiert sind. Darüber hinaus bewahrt die Perfusionstechnik die Integrität und das physiologische Milieu der MP-Leukozyten besser, ohne physiologische Reaktionen aufgrund der Gewebeverarbeitung hervorzurufen. Diese einzigartige MP-Leukozytenpopulation ist strategisch günstig gelegen, um abnormale zirkulierende Zellen zu identifizieren und darauf zu reagieren, da alle zirkulierenden bösartigen Zellen und infizierten Zellen beim Passieren der Lungenkapillaren zurückgehalten werden und physisch mit Endothelzellen und ansässigen Leukozyten interagieren. Daher kann die selektive Entnahme von MP-Leukozyten und ihre Untersuchung unter verschiedenen Bedingungen unser Verständnis ihrer biologischen und klinischen Bedeutung verbessern, insbesondere im Hinblick auf die Kontrolle zirkulierender aberranter Zellen und lungenbedingter Krankheiten.

Einleitung

Leukocyten zu den Kapillaren der Lunge anhaftenden (dh marginating-Lungen (MP) Leukozyten) ¹ gezeigt wurden verschiedene Leukozyten - Zusammensetzung und einzigartige Aktivität aufweisen , verglichen mit Leukozyten von anderen Immun Kompartimente (zB Zirkulations, Milz, Knochenmark) ^{2- 4.} Zum Beispiel, MP-Leukozyten zeigen eine höhere natürliche Killerzellen (NK) Zytotoxizität gegen verschiedene Tumorzellen, im Vergleich zu zirkulierenden und splenic NK-Zellen, sowie differenzierte Boten-RNA (mRNA) Ebenen und erhöhte Sekretion von pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen. Die Zusammensetzung von Zellen ist auch aus der zirkulierenden Leukozyten unterschieden als MP-Leukozyten ein höheres Verhältnis von angeborenen / adaptive Immunität gegenüber zirkulierende Leukozyten (50% vs. 30%, jeweils). Das Ziel des hier vorgestellte Methode selektive Ernte von MP-Leukozyten zu ermöglichen, um diese wichtige und einzigartige Immunfach (Zellpopulation) zu untersuchen und zu eluciDate die Auswirkungen verschiedener Manipulationen (beispielsweise Immunaktivierung) auf diesen spezifischen Zellen.

Um die Bedeutung dieser einzigartigen Bevölkerung zu verstehen, ist es wichtig zu beachten , dass das Immunsystem steuern kann zirkulierenden Tumorzellen, Mikrometastasen und Resterkrankung durch in - vivo - Funktionen der zellvermittelten Immunität (CMI). Diese Fähigkeit ist offensichtlich trotz der Präzedenzfall Versagen des Immunsystems , den Primärtumor zu steuern und durch reichlich in vivo Nachweis von Krebspatienten und Tiermodellen ⁵ unterstützt. Wichtig ist , dass diese Ergebnisse oft nicht mit in vitro und ex vivo - Studien, die berichten , dass die meisten autologe Tumorzellen - Zytotoxizität durch zirkulierende Leukozyten in Blutproben von Menschen und Tieren (gemessen durch Zytotoxizitätsassays) resistent sind ^6,7. Diese Diskrepanz kann auf die in vivo Existenz verschiedener Leukozyten - Populationen, wie der zuvor zurückzuführengenannten MP Leukozytenpopulation und seine Subpopulation von aktivierten NK - Zellen spezifisch ^3. Tatsächlich syngene Tumorzellen (MADB106), das Zirkulieren und splenic Leukozyten resistent erwiesen worden waren, wurden durch MP-NK - Zellen werden lysiert ^3,8 gezeigt. Somit werden die angeblich "NK-resistente 'MADB106 Zellen, die Lungen von fischer344 (F344) -Ratten metastasieren von MP-NK-Zellen kontrolliert, aber nicht durch zirkulierende oder splenic NK-Zellen, die gewöhnlich ihre leichte Zugänglichkeit gegeben sucht.

Gereinigte und aktive MP-Leukozyten sind nicht zugänglich über die Standard - Ernteverfahren von Leukozyten aus den Lungen, die auf das Lungengewebe Schleifen oder biologischen Abbau ⁹ basieren. Unser Ansatz hat zwei wesentliche Vorteile im Vergleich zu Gewebeverarbeitung Ansätze. Zunächst erntet die Perfusion Ansatz selektiv MP-Leukozyten, um sie von anderen Zellen zu trennen, die von der Lunge parenchymal, interstitielle stammen, und bronchoalveoläre compartments. Zweitens besser ist die Perfusion Technik bewahrt die Integrität und das physiologische Milieu von MP-Leukozyten, im Gegensatz zum Schleifen und biologische Verarbeitung Ansätze, die Zellen schädigen, ihre Morphologie zu verändern, und die Produktion und Freisetzung von verschiedenen Faktoren induzieren, die Immunaktivität modulieren und speziell NK unterdrücken Zytotoxizität ^10.

Die Lungen sind eine wichtige Zielorgan für Krebsmetastasen und für verschiedene Infektionskrankheiten. Alle zirkulierenden malignen Zellen und infizierten Zellen gehen durch die Lungenkapillaren, wo sie benötigen, mit Endothelzellen und resident Leukozyten zu verformen und zu interagieren. Unter diesen Bedingungen können zirkulierenden Zellen leicht durch resident MP-Leukozyten ausgerichtet sein. Es scheint also von Vorteil, biologisch aktivierten Leukozyten in diesem Immunraum zu haben, und es ist wichtig, diese einzigartige MP-Population in verschiedenen biologischen, experimentellen und klinischen Einstellungen zu studieren. Es ist erwähnenswert, dass sy zu beachtenstemic Immunaktivierung durch verschiedene biologische-response-modifiers (zB Polyinosin-Polycytidylsäure (Poly I: C) oder Typ-C CpG - Oligodesoxynukleotide (CpG-C - ODN)) wurden MP-Leukozyten mehr als zirkulierende Leukozyten ³ gezeigt , zu aktivieren , ^8,11.

Protokoll

Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Universität Tel Aviv genehmigt.

1. Rat Protokoll

1. Die Vorbereitungen
   1. Vereinbaren 2 Schmetterling 21 G Nadeln. Optional vorbereiten 2 stumpfkantige Schmetterling 21 G Nadeln durch die scharfe Kante der Nadel Einreichung.
   2. Sterilisieren chirurgische Instrumente: 2 Paar Scheren, abgestumpft kantigen Zange, hemostat, Zahngewebe durch Autoklaven bei 121 ° C sterilisiert Zange für mindestens 30 min auf die Schwerkraft (trocken) Einstellung.
   3. Bereiten heparinisiertem PBS (30 units / ml) durch Zugabe von 30 Einheiten Heparin pro ml phosphatgepufferter Salzlösung (1x PBS) -Lösung. Verwenden Sie bei RT. 35 ml ist das Minimalvolumen pro Tier benötigt.
   4. Streamen heparinisiertem PBS in die peristaltische Pumpe Leitungen und den Schmetterling Nadeln Luftblasen zu vermeiden.
2. Perfusion der Lunge und der Sammlung von MP-Leukozyten
   1. Euthanize das Tier durch eine Überdosis von 8% Isofluran. Bestätigen Sie die Euthanasie durch Überwachung der Atmung Aufhören.
   2. Nach Absetzen der Atmung zu öffnen, sofort die Peritonealdialyse und Brust Hohlräume unter Verwendung der sterilen Schere und Zahngewebe Pinzette. Führen Sie eine Mittellinie Bauchschnitt entlang der Bauch zum Xiphoidbasis auf.
   3. Heben Sie das Brustbein mit der Pinzette vorsichtig den Brustkorb auf beiden Seiten schneiden, ohne inneren Organen oder große Blutgefäße Punktierung. Klemmen Sie einen hemostat auf dem Brustbein und rostral den Brustkorb falten Sie die Herz-Lungen-Komplex zu belichten.
   4. Legen Sie eine Schmetterlingsnadel in den rechten Ventrikel des Herzens, und innerhalb von etwa einer Minute sammeln, um die maximale Menge an Blut in eine Spritze (~ 6 ml von einem 250 g Tier).
   5. Klemmen Sie die Hohlvene mit einer hemostat rückwärts Perfusion der Leber zu vermeiden (siehe Diskussion).
   6. Halten Sie die Butterfly-Nadel innerhalb des rechten Ventrikels, während die Spritze ersetzt das Blut mit dem Ablaufrohr des p enthält,eristaltic Pumpe.
   7. Legen Sie eine zweite Butterfly-Nadel in eine 5 ml Ernte Spritze in den linken Ventrikel verbunden ist, das Eindringen der Scheidewand zu vermeiden.
   8. Schalten Sie die peristaltische Pumpe bei einer Geschwindigkeit von etwa 5 ml / min und schonend sammelt in die Spritze die ersten ml Perfusat, die mit Blut kontaminiert sind. Fortfahren, bis das Perfusat Farbe von dunkel färbt sich rot bis hellrot. (Entsorgen Sie das Blut kontaminierte perfuste).
   9. Ohne Einstellung der peristaltischen Pumpe ersetzen schnell die 5 ml Ernte Spritze mit einer 20 ml Spritze und Ernte sammeln 20 ml Lungen Perfusat eine höhere Geschwindigkeit der Perfusion verwendet wird (bis zu 7 ml / min). Kontinuierlich überwacht die Perfusat Strom in die Sammel Spritze, während Vakuumbildung zu vermeiden.
   10. Cease den Fluss der Schlauchpumpe.
3. Leukozyten-Extraktion
   1. Zentrifugieren Sie die Perfusat für 10 Minuten bei 400 × g.
   2. Saugen Sie das Fluid.
   3. 10 ml PBS oder Medium, Zentrifuge bei 400 × g für 10 min, und die Flüssigkeit anzusaugen. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. Die Verwendung von PBS oder Medium hängt von der konsequente Einsatz der Probe.
   4. 20 ml PBS oder Medium, Zentrifuge bei 400 × g für 10 min, und die Flüssigkeit anzusaugen.
   5. Rekonstituieren der Zellen auf die gewünschte Konzentration, bezogen auf die Probenverwendungs ​​(FACS, PCR, etc.).

2. Maus-Protokoll

1. Die Vorbereitungen
   1. Vereinbaren 2 Schmetterling 25 G Nadeln. Optional vorbereiten 2 stumpfkantige Schmetterling 25 G Nadeln durch die scharfe Kante der Nadel Einreichung.
   2. Sterilisieren chirurgische Instrumente: 2 Paar Scheren, abgestumpft kantigen Zange, hemostat, Zahngewebe durch Autoklaven bei 121 ° C sterilisiert Zange für mindestens 30 min auf die Schwerkraft (trocken) Einstellung.
   3. Bereiten heparinisiertem PBS (30 units / ml) durch Zugabe von 30 Einheiten Heparin pro ml 1x PBS-Lösung. Verwenden Sie bei RT. 25 ml ist das Minimalvolumen pro Tier benötigt.
   4. strePBS in die peristaltische Pumpe Leitungen und den Schmetterling Nadeln am heparinisiert Luftblasen zu vermeiden.
2. Perfusion der Lunge und der Sammlung von MP-Leukozyten
   1. Euthanize das Tier durch eine Überdosis von 8% Isofluran. Bestätigen Sie die Euthanasie durch Überwachung der Atmung Aufhören.
   2. Nach Absetzen der Atmung zu öffnen, sofort die Peritonealdialyse und Brust Hohlräume unter Verwendung der sterilen Schere und Zahngewebe Pinzette. Führen Sie eine Mittellinie Bauchschnitt entlang der Bauch zum Xiphoidbasis auf.
   3. Heben Sie das Brustbein mit der Pinzette vorsichtig den Brustkorb auf beiden Seiten schneiden, ohne inneren Organen oder große Blutgefäße Punktierung. Klemmen Sie einen hemostat auf dem Brustbein und rostral den Brustkorb falten Sie die Herz-Lungen-Komplex zu belichten.
   4. Klemmen Sie die Hohlvene mit einer hemostat rückwärts Perfusion der Leber zu vermeiden (siehe Diskussion).
   5. Legen Sie eine Schmetterlingsnadel an das Auslaufrohr der Schlauchpumpe in die richtige ven verbundentricle des Herzens, und eine zweite Schmetterlingsnadel in ein 2 ml Ernte Spritze in den linken Ventrikel des Herzens verbunden ist, avoidingpenetration des interventrikulären Septums.
   6. Schalten Sie die Pumpe mit einer Geschwindigkeit von etwa 2 ml / min und sammeln die ersten Milliliter Blut verunreinigten Perfusat in die Ernte Spritze, bis das Perfusat aus dunkel färbt sich rot bis blass (Entsorgen Sie das Blut kontaminierte perfuste).
   7. Ohne Einstellung der peristaltischen Pumpe ersetzen schnell die 2 ml Ernte Spritze mit einer 10 ml Spritze und Ernte sammeln 10 ml Lungen Perfusat eine höhere Geschwindigkeit der Perfusion verwendet wird (bis zu 4 ml / min). Kontinuierlich überwacht die Perfusat Strom in die Sammel Spritze, während Vakuumbildung zu vermeiden.
   8. Cease den Fluss der Schlauchpumpe.
3. Leukozyten-Extraktion
   1. Zentrifugieren Sie die Perfusat für 10 Minuten bei 400 × g.
   2. Saugen Sie das Fluid.
   3. 10 ml PBS oder Medium, Zentrifuge bei 400xg für 10 min, und die Flüssigkeit anzusaugen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Die Verwendung von PBS oder Medium hängt von der konsequente Einsatz der Probe.
   4. 10 ml PBS oder Medium, Zentrifuge bei 400 × g für 10 min, und die Flüssigkeit anzusaugen.
   5. Rekonstituieren der Zellen auf die gewünschte Konzentration, bezogen auf die Probenverwendungs ​​(FACS, PCR, etc.).

Ergebnisse

Der MP-Fach weisen eine unterschiedliche Leukozyten-Subset Zusammensetzung im Vergleich zu Leukozyten zirkulieren. Verwendung von Durchflußzytometrie-Analyse wurden Leukozyten-Subpopulationen identifiziert und die Zusammensetzung von sowohl zirkulierenden Leukozyten und MP zu charakterisieren quantifiziert. Granulozyten und Lymphozyten wurden basierend auf Vorwärts- und Seitenstreuungen identifiziert. Innerhalb der Lymphozyten wurden NKRP-1 ^helle Zellen NK - Zellen, CD3 ^+...

Diskussion

Das vorgestellte Verfahren ermöglicht hier die selektive Ernte und das Studium der einzigartigen Population von MP-Leukozyten. Im Vergleich zum Zirkulieren oder splenic Leukozyten wird die MP Population durch eine bestimmte Zusammensetzung der Leukozyten - Subpopulationen gekennzeichnet, höhere Aktivierungsstufen, höhere Freisetzung verschiedener Cytokine, und höhere mRNA - Spiegel von pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen ^2,3. Insbesondere haben wir gezeigt , dass die MP-NK - Zellen cytotoxischer als Kre...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Autoclud Peristaltic Pump
Butterfly Nadel	OMG		26G
Butterfly Nadel	OMG		21G*3/4"
Spritze	Pic Lösung		1 ml
Spritze	Pic Lösung		2,5 ml
Spritze	Pic Lösung		5 ml
Spritze	Pic-Lösung		10 ml
Spritze	Pic-Lösung		25 ml
			abgestumpften Kanten
Schere
hämostatisch
Gewebezange
Heparin-Natrium-Schweineschleimhaut (ohne Konservierungsstoffe)	Sigma Aldrich

Pinzette mit