Methodenartikel

Peering am Gehirn Polysomen mit Rasterkraftmikroskopie

DOI:

10.3791/53851

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16. März 2016

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1Laboratory of Biomolecular Sequence and Structure Analysis for Health, Fondazione Bruno Kessler, 2Institute of Biophysics, CNR Unit at Trento

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Obwohl die Ribosomenstruktur umfassend charakterisiert wurde, ist die Organisation von Polysomen noch wenig untersucht. Um diesen Wissensmangel zu überwinden, stellen wir Ihnen hier ein detailliertes Präparationsprotokoll für die genaue Abbildung von Säugetierpolysomen mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) in Luft und Flüssigkeit vor.

Zusammenfassung

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Die Translationsmaschinerie, dh die Polysoms oder Polyribosom, ist eines der größten und komplexesten Cytoplasma - Maschinen in den Zellen. Polysomen, von Ribosomen gebildet, mRNAs, mehrere Proteine ​​und nicht-kodierenden RNAs repräsentieren Plattformen integriert die translationale Kontrollen stattfinden. Während jedoch das Ribosom wurde weitgehend untersucht, die Organisation von Polysomen noch fehlt umfassendes Verständnis. So viel Aufwand ist erforderlich, um Polysoms Organisation und jede neuen Mechanismus der Translationskontrolle aufzuklären, die eingebettet werden können. Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist eine Art von Rastersondenmikroskopie, welche die Erfassung von 3D-Bildern in nanoskaliger Auflösung ermöglicht. Im Vergleich zu der Elektronenmikroskopie (EM) Techniken, einer der wichtigsten Vorteile von AFM ist, dass es Tausende von Bildern sowohl in der Luft als auch in Lösung zu erwerben, so dass die Probe aufrecht erhalten werden unter nahezu physiologischen Bedingungen, ohne dass für die Färbung und Fixierung Proverfahren. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die genaue Reinigung von Polysomen aus Gehirn der Maus und ihre Abscheidung auf Glimmersubstraten beschrieben. Dieses Protokoll ermöglicht Polysomen-Bildgebung in Luft und Flüssigkeit mit AFM und deren Rekonstruktion dreidimensionaler Objekte. Ergänzend zur Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) kann das vorgeschlagene Verfahren günstig für die systematische Analyse Polysomen verwendet werden, und ihre Organisation zu studieren.

Einleitung

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Die Synthese von Protein ist der energieverbrauchenden Prozess in Zellen 1,2. Daher ist es nicht verwunderlich , dass Protein Abundanzen vor allem auf der Translations gesteuert werden , anstatt Transkriptionsebene 3,4,5. Die Polysoms ist die grundlegende Komponente, die die hochmolekularen mRNA Information in funktionelle proteinöse Ablesungen umwandelt. Polysomen werden so weit als makromolekulare Komplexe erkannt , wo mehrere Translations Kontrollen 13.06 konvergieren. Trotz Hunderten von Studien über die Ribosomenstruktur 14- 16, die detaillierte molekulare Einblicke in die Dynamik der Übersetzung und die Topologie von Polysomen hat ein begrenztes Interesse gestoßen. Als Folge davon sind die Organisation des nativen polysomaler Ribonukleoproteinkomplex und seine möglichen Auswirkungen auf die Übersetzung noch ziemlich unklar Fragen. Polysomen kann noch unbekannt bestellt und funktionale Organisationen verbergen, potenziell Spiegelung was Nukleosomen und epigenetische controls haben für die Transkription Feld dargestellt. Tatsächlich erfordert die Untersuchung dieser faszinierenden Hypothese zusätzliche Studien und neue technische Ansätze. In dieser Zeile können zusammenarbeiten , um Strukturtechniken und Rasterkraftmikroskopie fruchtbarer neue Mechanismen entwirren für die Genexpression steuern, ähnlich zu dem, was für die Nukleosomen 17,18 erreicht.

Seit der Entdeckung des Ribosoms 14-16 hat seine Struktur wurde in Prokaryoten 19,20, Hefe 21 und in jüngerer Zeit in der Human 22, die Bereitstellung der molekulare Beschreibung der Mechanismen an der Basis der Proteinsynthese umfassend charakterisiert. Polysomen wurden zunächst auf die Membran des endoplasmatischen Retikulums erkannt, typische 2D geometrische Organisationen 14 bilden. Wie bereits erwähnt, hat Polysoms Montage Gegenstand ständiger Interesse, wie die Ribosomenstruktur nicht gewesen. In der Vergangenheit Polysomen wurden im wesentlichen durch tr studiertansmission EM-basierte Techniken. Erst vor kurzem freigegeben Kryo-EM - Techniken , um die 3D - Rekonstruktion von gereinigtem Polysomen von in - vitro - Translationssysteme 23-26, menschliche Zellysaten 27 oder in den Zellen 28. Diese Techniken angeboten verfeinerte Information über das Ribosom-Ribosomen Organisation in Polysomen 23, 26-28 und eine vorläufige molekulare Beschreibung der Kontaktflächen benachbarter Ribosomen in Weizenkeim Polysomen 24. Somit ermöglicht Kryo-EM-Tomographie die Offenlegung von Ribosomen Ribosomen Wechselwirkungen mit molekularen Detail, aber es ist durch umfangreiche Nachbearbeitung belastet und Rekonstruktion Analysen, erfordern schwere Rechenressourcen für die Datenverarbeitung. Darüber hinaus wird die molekulare Detail von Ribosomen Ribosomen Wechselwirkungen, eine hochaufgelöste Karte des Ribosoms zu erhalten erforderlich, und diese Art von Referenz Ribosom ist nur für wenige Arten. Wichtig ist, dass Kryo-EM-Tomographie freie RNA nachzuweisen nicht in der Lage. d daherErz, werden neue Techniken benötigt, um vollständig die Organisation der Translationsmaschinerie zu verstehen.

Neben Kryo-EM wurde AFM auch als ein nützliches Werkzeug für die direkte Abbildung von Polysomen in niederen Eukaryoten 29-33 und Menschen 27 eingesetzt. Im Vergleich zu EM, erfordert AFM keine Probe Fixierung oder Kennzeichnung. Darüber hinaus können Messungen in der Nähe von physiologischen Bedingungen durchgeführt werden und mit der einzigartigen Möglichkeit , beide Ribosomen und nackter RNA - Stränge 27 eindeutig zu identifizieren. Abbildung einzelner Polysomen kann relativ schnell durchgeführt werden, Tausende von Bildern auf der nano-Auflösung mit wenig Nachbearbeitung Aufwand im Vergleich zu der umfangreichen und schweren Nachbearbeitung Erhalt und Wiederaufbau Analysen durch Kryo-EM-Mikroskopie erforderlich. Folglich stellt AFM Datenverarbeitung und Analyse nicht teuer Workstations benötigen und eine hohe Rechenleistung. Als solches sammelt sich diese Technik Informationen über polysomaler Formen, morphologischen Eigenschaften (wieHöhe, Länge und Breite), Ribosom Dichten, das Vorhandensein von freien RNA und die Anzahl der Ribosomen pro Polysomen 27 mit einem höheren Durchsatz als Kryo-EM. In einer solchen Weise stellt AFM eine leistungsfähige und komplementären Ansatz Techniken zur EM Polysomen zu porträtieren 27.

Hier präsentieren wir eine komplette Pipeline von der Reinigung bis zur Datenanalyse in dem AFM Bild angewendet wird und Mausgehirn Polysomen analysieren. Das vorgeschlagene Protokoll konzentriert sich auf die Reinigung Fragen und auf die genaue Ablagerung von Polysomen auf Glimmersubstraten, die für AFM-Bildgebung verwendet werden. Zusätzlich zu den herkömmlichen Partikelanalyse , die leicht mit gängigen Software ausgeführt werden können , von der AFM - Gemeinschaft verwendet wird , ein ImageJ 34 - Plugin, genannt RiboPick wird zum Zählen der Anzahl von Ribosomen pro Polysoms 27 präsentiert, 35.

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Protokoll

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Die Praktiken verwendet, um die Mausgewebe zu erhalten, wurden zum Schutz der Tiere nach der zugelassenen Stelle (OPBA) der Universität von Trento (Italien), Protokoll Nr. 04-2015, gemäß Art.31 Gesetzesverordnung Nr. 26/2014. Alle Mäuse wurden am Modellorganismus der Einrichtung des Zentrums für Integrative Biologie (CIBIO), Universität Trento, Italien gehalten.

Achtung: Um eine RNA-Abbau der Proben zu vermeiden, bereiten alle Puffer DEPC-behandeltem Wasser zur Minimierung von RNase Kontamination mit.

1. Herstellung von Polysomen von Whole Brains

  1. Sammeln von Gehirngewebe (15 min)
    1. Euthanize Wildtyp - Maus - Stamm C57BL / 6 mit CO 2 Ersticken für 5 min 36. Sezieren vorsichtig das Gehirn aus dem Schädel 36, legen Sie das Gewebe in ein Röhrchen von 1,5 ml und es sofort in flüssigem Stickstoff statt. Bei -80 ° C bis zur Verwendung.
  2. Herstellung von Lysat (30 min)
    1. Pulverisieren der gesamten Hirngewebe mitein Mörser und Stößel unter flüssigem Stickstoff.
    2. Übertragen etwa 25 mg Pulver zu einem kalten Mikrozentrifugenröhrchen und sofort (das Auftauen des pulverisierten Gewebe zu vermeiden) in 0,8 ml Lysepuffer (siehe Tabelle 1) und stören die Zelle durch Auf- und Abpipettieren 25 - mal schneller.
    3. Zentrifugiere die Röhrchen bei 12.000 × g für 1 min bei 4 ° C um Zelltrümmer zu pelletieren.
    4. Den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und halten Sie die Röhrchen auf Eis für 15 min.
    5. Zentrifugiere die Röhrchen bei 12.000 xg für 5 min bei 4 ° C Kerne und Mitochondrien zu pelletieren.
    6. Den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
    7. Lagern Sie den Überstand bei -80 ° C für maximal 6 Monate oder es sofort ab.
  3. Saccharosegradienten Vorbereitung und Zentrifugation (2 h und 30 min)
    1. Wash Ultrazentrifuge Rohre ausgiebig mit RNase-freiem Wasser (Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser (DEPC-Wasser) oder kommerziell) eind 3% H 2 O 2 / DEPC H 2 O Lösung.
    2. Setzen die Röhrchen auf Eis und fügen Sie 5,5 ml kalter 50% iger Saccharoselösung am Boden jedes Röhrchens (Tabelle 1 für Saccharoselösungen sehen). Sorgfältig in den der Inter um eine scharfe Interphase zu erhalten, die 15% Saccharose-Lösung tropfenweise Aufenthalt in der Nähe, bis das Rohr vollständig gefüllt ist. Wenn das Rohr vollständig gefüllt ist, schließen Sie ihn mit einem Gummistopfen in die Luft Blasenbildung zu vermeiden.
    3. In einem kalten Raum lag sanft die Rohre horizontal nach unten und halten ihn in dieser Position für 2 Std. Nach dieser Zeit gerade langsam die Rohre zurück in die vertikale Position und legte sie auf Eis. Die Gradienten können jetzt verwendet werden. Alternativ bereiten die 15-50% Saccharose Gradientenformer einen herkömmlichen Gradienten.
    4. In einem kalten Raum sorgfältig 1,0 ml von der Spitze des Gradienten zu entfernen und die Saccharose - Tropfen für Tropfen mit dem Cytosol - Lysat überlagern (dh der Überstand in Ste erhaltenp 1,2).
    5. die Rohre in die Eimer Schwingbecherrotor vorsichtig absenken. Zentrifugation der Gradienten für 100 Minuten bei 180.000 × g bei 4 ° C eine Ultrazentrifuge.
    6. Nach der Zentrifugation bei 4 ° C für 20 Minuten die Röhrchen in ihren Eimer verlassen die Gradienten zu lassen stabilisieren.
  4. Saccharosegradienten-Fraktionierung (2 h)
    1. Sorgfältig ein Ultrazentrifugenröhrchen aus der Ultrazentrifuge Rotor zu entfernen und sie auf der Sammelvorrichtung von einem Dichtegradienten Fraktionierungssystem montieren. Sammeln 1 ml Fraktionen Überwachen der Extinktion bei 260 nm mit einem UV / VIS - Detektor (siehe 1 oben). Halten Sie die gesammelten Fraktionen auf Eis.
    2. Bereiten Sie Teilmengen von 30 bis 40 & mgr; l der Fraktionen von Interesse, halten sie auf Eis, bevor sie bei -80 ° C bis Verwendung zu speichern. Nicht Aliquots oder Saccharose Fraktionen verwenden , die mehr als zwei Gefrier-Tau - Zyklen unterzogen (Abbildung 1 untere Tafel sehen).

2. Probenvorbereitung für die Rasterkraftmikroskopie (3 Stunden)

  1. Mit Band, die Glimmerplättchen abziehen.
  2. Waschen Sie die Glimmerplättchen 3-4 mal mit DEPC-Wasser und legen Sie sie in eine kleine Petrischale. Dann trocknen Sie die Oberfläche Luft.
  3. Decken Sie den Glimmer mit 200 ul 1 mM NiSO 4 und Inkubation für 3 min bei RT.
  4. Entfernen Sie die Nickellösung und dann trocknen Sie die Oberfläche Luft. Führen Sie alle weiteren Schritte bei 4 ° C durch die Petrischale platziert mit dem Glimmer auf Eis.
  5. Tauwetter ein Aliquot in 1.4.2 auf Eis erhalten und sanft die gesamte Probe tropfen auf dem Glimmer hinzufügen. Mit einer 100-200 ul Spitze, verteilt die Probe auf die gesamte Oberfläche des Glimmer. Inkubieren Sie die Probe auf Eis für 3 min.
  6. Bedecken Sie den Glimmerplättchen tropfenweise mit 200 ul kaltem Puffer-AFM (siehe Tabelle 1) und Inkubation für 1 Stunde auf Eis.
  7. Imaging in Flüssigkeit
    1. Entfernen Sie vorsichtig den Buffer-AFM und waschen Sie die Glimmerplättchen 3-4 Mals mit 200 ul kaltem Puffer-AFM zur Entfernung von überschüssigem Saccharose. Dann waschen Sie die Glimmerplättchen 3 mal mit kaltem Waschlösung (siehe Tabelle 1), die Glimmeroberfläche von einigen Mikroliter Lösung bedeckt bleibt.
    2. Zum 3 (Bildaufnahme) zu verweisen.
  8. Imaging in der Luft
    1. Vorsichtig die Buffer-AFM entfernen und den Glimmer 3-4 mal mit 200 ul kaltem Puffer-AFM waschen Sie die überschüssige Saccharose zu entfernen. Dann waschen Sie die Glimmer 3 mal mit kaltem Waschlösung (siehe Tabelle 1) und lassen Sie das überschüssige Wasser Papier.
    2. Lassen Sie die Probe unter der chemischen Haube teilweise offen mit der Spitze der Petrischale zu trocknen. Nach 2 Stunden, schließen Sie die Petrischale und lagern bei RT. Messen Sie die Probe nach 2-3 Stunden, da sie seit Jahren stabil sind.

3. Bildaufnahme (15 min pro Bild nach der thermischen Stabilisierung)

Anmerkung: Polysomen an immobilisierte Glimmer kann in Luft oder in flüssiger abgebildet werden, AC-Modus.

  1. Bringen Sie den Glimmer an den Probenhalter mit doppelseitigem Klebeband.
  2. Setzen Sie den Probenhalter in der AFM-Bühne Richtungen folgenden Hersteller. Wenn Bildgebung in Flüssigkeit, wenn möglich, versuchen, die Probe bei einer Temperatur unter 25 ° C zu halten Polysomen-Stabilität mit der Zeit zu erhöhen.
  3. Wählen Sie einen Ausleger geeignet für AC-Bildgebung und montieren Sie ihn an der Spitze des Inhabers Richtungen folgenden Hersteller. Hierbei kann die Verwendung Auslegern mit Kraftkonstante zwischen 2-20 N / m für Luft-Bildgebung und etwa 0,1 N / m für flüssige Bildgebung.
  4. Stellen Sie den Laserpunkt auf dem Ausleger und Null die Quadranten Detektorsignale.
  5. Wählen Sie ein opportun Ansteuerfrequenz und Antrieb des Auslegers mit einer Amplitude von 10-20 nm.
  6. Nähern Sie sich die Probe, bis die Spitze die Oberfläche angreift.
  7. Wählen Sie einen Scanbereich von 2x2 um, erwerben mindestens 512x512 Pixel-Bilder (Pixelbreite <4 nm), wählen Sie eine Live-Untergrundsubtraktion-Modus und eine Z-Skala von 20 bis 25 nm.
  8. Überprüfen Sie ter betrachtet für das Vorhandensein von runden Objekten durch die Höhe charakterisiert zwischen 10 und 15 nm, wenn in Luft und 25 und 30 nm, wenn sie in Flüssigkeit und der Breite im Bereich von 25-30 nm zu erwerben. Passen Sie die Soll- und Istwert Parameter bis scharfe Gegenstände sichtbar gemacht werden. Der Hintergrund sollte relativ flach erscheinen in guten Proben, mit einigen 2-4 nm Höhe Objekten (siehe 2A und B).
  9. Wenn das Bild gut aussieht (wie bei Punkt 3.8 angegeben), erwerben mehrere (mindestens zehn) 2x2 Mikron-Scans an unterschiedlichen Probenbereiche.
  10. (Optional). Falls erforderlich, hochauflösende Bilder von ausgewählten Polysomen erwerben (siehe Abbildung 2C).
  11. Anwenden Softwarekorrekturen (Ebene Subtraktion und line-by-line Korrekturalgorithmen) die AFM-Bilder zu entfernen beliebige Neigung und driften Effekte zu korrigieren.

4. Datenanalyse (30 min pro Bild)

  1. Export von Bildern in ImageJ (optional: Anwendung eines Skalierungsfaktors) preferentmathematisch eine verlustfreie Komprimierung Format, zB das TIFF - Format (siehe 3A).
  2. Verwenden Sie das ImageJ Makro Toolset RiboPick.ijm (in der ImageJ Makro / Toolset Unterverzeichnis kopiert werden) an Ribosomen in Polysomen (siehe Abbildung 3B) und berechnen statistische Eigenschaften der Probe zählen (siehe Abbildung 3C).
    1. Starten Sie ein Bild Laden mit dem Werkzeug, das das Programm initialisiert.
    2. Wählen Sie die Ribosomen-Zentren mit dem Standard ImageJ Werkzeug (Shift + Linksklick ermöglicht die Multiselektion von Ribosomen). Markieren Sie die ausgewählten Ribosomen mit dem <mark> Werkzeug. Ribosome Koordinaten werden in einem benutzerdefinierten Textfenster angezeigt.
    3. Fügen Sie mehr Ribosomen an die gleiche Polysoms Wiederholung des Verfahrens an dem Punkt 4.2.2 angegeben.
    4. Entfernen Sie falsch markierte Ribosomen mit der Werkzeug (beginnt mit dem zuletzt hinzugefügten Ribosom zum ersten Entfernen212; im aktuellen Polysoms nur).
    5. Wenn die Polysoms abgeschlossen ist, verwenden Sie die Werkzeug. Da die Polysomen-Nummer als Overlay zu dem Bild hinzugefügt wird, wird das Textfenster aktualisiert.
    6. Mit das Ribosom-Koordinaten-Datei zu schreiben (die Standardeinheiten des Bildes verwendet werden) und ein PNG-Bild, das das aufgenommene Ribosomen und Polysomen zusammenfasst. Das Originalbild wird geschlossen, ohne gespeichert zu werden.

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Ergebnisse

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Saccharosegradienten polysomaler Profilierung der gesamten Gehirn der Maus

Es ist möglich, Polysomen aus einem zellulären Lysat durch polysomaler Profilierung zu reinigen, die Makromoleküle entsprechend ihrem Gewicht und Größe trennt. Mit polysomaler Profilierung zytoplasmatischen Lysate aus kultivierten Zellen oder Geweben erhalten werden, wie in diesem Beispiel, werden auf einem linearen Suc...

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Diskussion

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Da die Struktur der DNA bewiesen wurde von größter Bedeutung sein, den Prozess der Transkription und die Organisation von Chromatin voran unser Verständnis der Transkriptionskontrolle der Genexpression zu beschreiben, ist es wichtig, die Organisation und Struktur der Polysomen zu analysieren, um die wahrheitsgemäße Verständnis zu verbessern der Übersetzung und deren Regulierung.

Mit dem beschriebenen Protokoll wird eine optimale Dichte von Polysomen sanft auf eine flache Oberfläche immobilis...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen an diesem Papier und nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde durch das AXonomIX-Forschungsprojekt unterstützt, das von der Provincia Autonoma di Trento, Italien, finanziert wurde.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CycloheximidSigma01810Präparation von Lysat
DNAseIThermo Scientific89836Präparation von Lysat
RiboLock RNAse InhibitorLife technologiesEO-0381Präparation von Lysat
DEPCSigma40718Präparation von Lysat
Triton X100SigmaT8532Aufbereitung von Lysat
DTTSigma43815Aufbereitung von Lysat
NatriumdesoxycholatSigmaD6750Aufbereitung von Lysat
Mikrozentrifuge Eppendorf5417RPräparation von Lysat
SaccharoseSigmaS5016Saccharosegradientenpräparation
UltrazentrifugeBeckman CoulterOptima LE-80KSaccharosegradientenzentrifugation
Ultrazentrifuge RotorBeckman CoulterSW 41 TiSaccharosegradientenzentrifugation
PolyallomerröhrchenBeckman Coulter331372Saccharosegradientenzentrifugation
Dichtegradientenfraktionierungssystem Teledyne Isco67-9000-176Saccharosegradientenfraktionierung
AFMAsylforschungCypherPolysom Visualisierung

Referenzen

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Polysome PurificationAtomic Force MicroscopyBrain TissueSucrose GradientMica DepositionRibosome ImagingNanoscale ResolutionCryo EM ComplementaryTranslational ControlPolysome Organization

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