This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.
Fryse-fraktur elektronmikroskopi har været et stort teknik i ultrastrukturel forskning i over 40 år. Men manglen på effektive midler til at studere den molekylære sammensætning af membraner produceret et markant fald i brugen. For nylig har der været en stor vækkelse i fryse-fraktur-elektronmikroskopiske takket være udviklingen af effektive måder at afsløre integrale membranproteiner ved immunoguld mærkning. En af disse metoder er kendt som vaskemiddel-opløst Freeze-fraktur Replica immunolabeling (FRIL).
Kombinationen af FRIL teknik med optogenetics giver en korreleret analyse af de strukturelle og funktionelle egenskaber af centrale synapser. Ved hjælp af denne metode er det muligt at identificere og karakterisere både præ- og postsynaptiske neuroner ved deres respektive udtryk for en kodet channelrhodopsin og specifikke molekylære markører. Det karakteristiske udseende postsynaptiske membran specialisering af glutamaterge synapser muliggør endvidere, ved mærkning af ionotrope glutamatreceptorer, at kvantificere og analysere intrasynaptic fordeling af disse receptorer. Her giver vi en trin-for-trin beskrivelse af de procedurer, der er nødvendige for at forberede parret replikaer, og hvordan man immunolabel dem. Vi vil også diskutere de forbehold og begrænsninger FRIL teknik, især dem der er forbundet med potentielle prøveudtagning bias. Den høje reproducerbarhed og alsidighed FRIL teknik, når det kombineres med optogenetics, tilbyder en meget kraftfuld tilgang til karakterisering af forskellige aspekter af synaptisk transmission på identificerede neuronale mikrokredsløb i hjernen.
Her giver vi et eksempel, hvordan denne fremgangsmåde blev anvendt til at opnå indsigt i struktur-funktionsforhold af excitatoriske synapser på neuroner i det indlejrede cellemasser af muse amygdala. Især har vi undersøgt ekspressionen af ionotrope glutamatreceptorer på identificerede indgange elleriginated fra thalamiske posterior intralaminære og mediale geniculate kerner. Disse synapser viste sig at viderebringe sensorisk information relevant for frygt læring og at undergå plast ændringer på frygt condition.
Definitionen af den funktionelle arkitektur biomembraner på nanometer skala er blevet udfordret i de seneste år med udviklingen af en række immunolabeling teknikker egnet til transmission elektronmikroskopi. Men disse teknikker, fx før og efter embedding immunogold, har en række vigtige begrænsninger, der indbefatter dårlig detektion af antigener og / eller begrænset kvantitativ vurdering af membranbundne proteiner. Disse begrænsninger bliver særlig kritisk i forbindelse med undersøgelsen af den fine struktur af nervesystemet, som er kendetegnet ved en høj grad af celle mangfoldighed og synapse heterogenitet. Denne uensartethed skyldes både strukturel og funktionel diversitet dikteret af præ- og postsynaptiske elementer og ved den differentielle ekspression, berigelse eller interaktion af signalproteiner, såsom receptorer, transportører og effektormolekyler.
En ny tilgang til direkte immunolabeLing af integrerede eller tværbunden membranproteiner i vaskemiddel-opløst fryse-fraktur replikaer (FRIL) blev oprindeligt introduceret af Fujimoto to årtier siden en. Denne oprindelige metode havde imidlertid flere begrænsninger, dvs. alvorlig fragmentering af replikaer, som har begrænset meningsfulde korrelationer af mærkede molekyler med individuelt kortlagte celler i komplekse væv, såsom hjernen. Ca. 10 år siden, Shigemoto og Fukazawa gradvist forbedret teknik 2. Dette blev modsvaret af indsatsen fra en anden gruppe af forskere ved de Boulder laboratorier Colorado State University, der også væsentligt forbedret den teknik, især for studiet af gap junctions 3.
Forbedringen i fryse-frakturering protokoller og maskiner, samt indførelsen af hurtig nedfrysning (under højt tryk), nu giver efterforskerne til at producere ubrudt kopier af eksemplarer af relativt store størrelse og high kvalitet billeder af de fleste cellulære komponenter uden de begrænsninger og artefakter produceret af stærke kemiske optagelser.
Den FRIL teknik giver den store fordel af en yderst kvantitativ in situ identifikation af et eller flere proteiner (samtidig) i histologisk kortlagt og cytologisk identificerede celler i komplekse væv, såsom hjernen, med den yderligere fordel, en plan afbildning af præ- og postsynaptiske elementer i en enkelt kopi. Derfor FRIL teknik, på trods af sine mange tekniske forhindringer, giver løfte om en række meget betydelige videnskabelige gennembrud, især for korrelationen af strukturelle og funktionelle egenskaber af de enkelte synapser. I løbet af de sidste årtier, har en hel del oplysninger er indhentet på strukturen, molekylære fyldes op, og fysiologiske funktion af synapser; endnu synapser er morfologisk og molekylært meget forskelligartede afhængigt før og postsynaptiske paleje neuroner 4. Kun for en håndfuld af synapse typer var struktur og funktion undersøgelser gennemført hidtil 5-7. Det var for det meste på grund af tekniske begrænser, der forhindrede en præcis identifikation af arten af de præ- og postsynaptiske elementer.
Ultrastrukturelle analyse har givet kritiske indsigt i variabiliteten af postsynaptiske membran specialiseringer tværs distinkte synaptiske kontakter både hvad angår synaptisk størrelse og indhold i neurotransmitterreceptorer 6, som har en stor indflydelse på styrke og plasticitet synaptisk transmission. Ydermere er en stor mængde forskning antyder, at antallet af ionotrope glutamatreceptorer udtrykt ved forskellige typer af synapse reguleres i en afferent- og target-afhængig måde 7-10.
Her er en metode skitseret, der tillader analyse af strukturen og receptor sammensætning af postsynaptiske membran specialiseringer med Acceptér definered præsynaptiske elementer og funktion. Denne fremgangsmåde drager fordel af præsynaptisk ekspression af nyligt udviklede lysfølsomme alge- proteiner, såsom channelrhodopsin2 (CHR2), og af FRIL teknik til at analysere mønsteret af postsynaptiske ekspression af α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA-R) og N-methyl-D-aspartat (NMDA-R'er) glutamatreceptorer. Dette demonstreres ved synapser dannet af axoner oprindelse fra den bageste thalamiske-mediale geniculate kerner (PIN / MGN) på neuroner i det indlejrede cellemasser af amygdala (ITC). ITC neuroner er små tornede GABAerge celler organiseret i klynger omkring basolaterale amygdaloidkomplekset (BLA) 11, 12. ITC neuroner er kendt for at modtage stimulerende input fra BLA vigtigste neuroner og målrette den centrale kerne (CEA), og dermed fungerer som en hæmmende gate for informationsstrømmen mellem BLA og CEA 12-15.
For nylig demonstrerede vi, at detC neuroner beliggende i den medio-dorsale klynge mellem BLA og CEA får også direkte og konvergente excitatoriske input fra sensoriske thalamiske og tidsmæssige kortikale regioner, som er modificeret på frygt læring under pavlovsk auditive frygt condition 16. Frygt condition er en af de bedst forståede former for associativ læring i form af hjernen mekanismer. I frygt condition, en oprindelig neutral betinget stimulus (CS, fx en tone) er parret med et afskrækningsmiddel ubetinget stimulus (US, fx en mild mund chok), hvilket resulterer i en CS-amerikansk forening og betinget frygt reaktion 17, 18. Excitatorisk input fra både thalamiske og neocorticale områder, som bærer information, der repræsenterer CS og USA henholdsvis var kendt for at konvergere på pyramideformede neuroner i den laterale kerne af amygdala (LA) og til at gennemgå plasticitet 19. Vores tidligere arbejde viste, at sanseindtryk oplysninger også i parallel videresendes til ITC neuroner <sop> 16.
Som et første skridt i retning af en mekanistisk molekylær analyse af individuelle sanseindtryk synapser på ITC neuroner, brugte vi en adenoassocieret virus (AAV) at udtrykke CHR2 mærket med gult fluorescerende protein (YFP). AAV blev injiceret i PIN / MGN og axonterminaler blev identificeret ved deres ekspression af CHR2-YFP. Vi brugte begge sider genereret af FRIL teknik til at vurdere tætheden af postsynaptiske AMPA-R og NMDA-R'er på synapser dannet med ITC neuroner ved PIN / MGN Axon terminaler.
Fryse-fraktur elektronmikroskopi har været et stort teknik i ultrastrukturel forskning i over 40 år. Men manglen på effektive midler til at studere den molekylære sammensætning af membraner produceret et markant fald i brugen. For nylig har der været en stor vækkelse i fryse-fraktur-elektronmikroskopi som følge af udviklingen af effektive måder at afsløre integrale membranproteiner ved immunguld mærkning 1, 2, nemlig FRIL teknik.
Den FRIL teknik har adskillige fordele frem for andre immunogold ultrastrukturelle metoder. Første, proteiner er let tilgængelige for antistoffer forøgelse af følsomheden. Sekund, eksponering af stor del af plasmamembran specialiseringer, såsom den postsynaptiske membran på den todimensionale overflade af replika tillader inspektion af den rumlige fordeling og fysisk grænseforholdet af molekyler af interesse uden besværlig og tidskrævende genopbygning af alvoral ultratynde sektioner. Tredje, tilgængeligheden af begge halvdele af plasmamembranen øger antallet af proteiner, der kan mærkes for hver enkelt struktur, forudsat egnede antistoffer er tilgængelige. Ved frakturering, er den hydrofobe forside af den opdelte membran belagt med carbon-platin, der befæster proteindomæner forbliver på brudfladen. Dette forhindrer adgang af antistoffer til antigener på disse områder. For eksempel på P-flade af en replika kan detekteres kun epitoper overfor protoplasmisk rum med antistoffer, hvorimod på E-ansigt kun epitoper overfor exoplasmic rum kan bindes af antistoffer (se figur 2).
På den anden side, den FRIL teknik lider også af visse begrænsninger 2. Som frakturer opstår tilfældigt, kan det være svært at målrette specifikke celler eller strukturer. Dette kan også føre til en sampling bias, fx i synapse indsamling betragtning af den forskellige sandsynlighed for FRActuring langs membranen af strukturer med forskellig krumning (f.eks, pigge versus aksler). Endvidere tildeling af membranproteiner til en af de to flader er uforudsigelig. Derfor fordelingen af et protein til P-ansigt eller E-ansigt, især for kvantitative undersøgelser, bør undersøges nøje ved anvendelse af antistoffer reaktive mod intracellulære og ekstracellulære domæner. Endelig identifikation i replika af visse strukturer, såsom præsynaptiske Axon terminaler, kan være svært, når kun baseret på morfologiske træk. Men anvendelsen af specifikke antistoffer for markørproteiner eller transduktionen af taggede integrale membranproteiner eller kanaler ved hjælp virale vektorer tilbyder yderligere værktøjer lettere at identificere de frakturerede membraner. For eksempel denne undersøgelse benyttede transduktion af CHR2-YFP i thalamiske neuroner til at identificere deres axonale efferents i amygdala eller mærkning af μ-opioidreceptorer at afsløre postsynaptiske migmbranes af ITC neuroner.
For at kunne udføre den FRIL teknik med succes, skal der tages særlig omhu vedrørende vævsfiksering. Stærk vævsfiksering (> 2% paraformaldehyd) kan resultere i en høj grad af tværgående frakturer og et fald i følsomhed mærkning. På den anden side, svage fikseringer gøre vævet håndtering og tilberedning (fx skæring af sektioner) vanskelig. Det er også vigtigt at kontrollere, at tykkelsen af de trimmede klodser passer tykkelsen af det dobbeltsidede tape. Hvis tykkelsen af prøven er lavere end den af båndet, kan overfladerne af væv ikke vedhæfte til overfladen af de to metal bærere er dermed de frosne prøve ikke brækket. Hvis vævet er tykkere, vil det blive komprimeret med uundgåelige strukturelle forvridninger, når sandwichen af de to kobber bærere er lavet. Den temperatur, ved hvilken prøven er brækket (i denne protokol, -115 ° C) spiller også en vigtig rollepå strukturen af replika. Højere temperaturer kan frembringe en højere artefakter, såsom kondensering af vanddamp på overfladen af vævet før eller under fordampning. Lavere temperaturer (<-125 ° C) kan øge risikoen for fraspaltning af materiale under frakturering. Dette materiale kan falde på overfladen af prøven eller holde forbindelsen til det. Disse flager af materiale er også belagt og kontrast producerer mørke pletter på billedet. Briste ved lavere temperaturer kan også påvirke hyppigheden af cross-frakturer især for små fine strukturer såsom dendritiske pigge. En yderligere afgørende skridt i forberedelsen af replikaer er vaskemiddel-fordøjelse. Hvis fordøjelsen er ufuldstændig, vises ufordøjet væv som mørke pletter på replika, confounding analysen af strukturen på TEM. Desuden ufordøjet væv kan uspecifikt fælde eller binder antistoffer, hvilket øger mærkningen baggrunden. På den anden side er anvendelsen af detergents for vævsfordøjelse kan denaturere molekylerne forbundet til replika ændre deres sekundære og tertiære strukturer. Derfor, for visse antigener kan det være nødvendigt gradvist at fortynde koncentrationen af SDS med yderligere vasketrin.
For immunolabeling, tilgængeligheden af forskellige størrelser af guldpartikler konjugeret til sekundære antistoffer gør det muligt at detektere på samme tid, men kun kvalitativt multiple proteiner, selv i særlige mikrodomæner af plasmamembranen, såsom den postsynaptiske specialisering. Men på grund af sterisk hindring, kvantitative undersøgelser er generelt begrænset til påvisning af blot ét molekyle. Størrelsen af guldpartikler og kan også påvirke effekten mærkning.
Ved fortolkningen af mærkningen i FRIL, skal det holdes for øje, at immunoguld partiklen kan placeres hvor som helst inden for en halvkugle med en radius på 20-25 nm fra antigenet på grund af den fleksible komplekse formulared af den primære og sekundære antistof 26. For yderligere information om teori og praksis af FRIL og relaterede teknikker, henviser vi læseren også til andre metodologiske artikler 27, 28.
Den FRIL Teknikken er for nylig blevet anvendt til høj opløsning kvantitative analyser af glutamat receptor lokalisering i diverse synapse populationer 29, 30. Desuden påvisning følsomheden af FRIL teknik til AMPA-R'er blev anslået så højt som en immunguld partikel pr en funktionel AMPA -R kanal 29. Således er denne tilgang er generelt meget nyttigt at kvantificere og analysere mønstret af postsynaptiske udtryk for AMPA-R og NMDA-R'er på centrale synapser. Her demonstrerede vi dens anvendelighed på PIN / MGN-ITC synapser, et websted sandsynligvis vigtigt for genudlægning amerikanske oplysninger under frygt condition. Anvendelse af et antistof dannet mod de stærkt konserverede ekstracellulære aminosyrerester af AMPA receptor-underenheder GluA1-GluA4, fandt vi en jævn fordeling af guldpartikler inden IMP klynger svarende til postsynaptiske membran specialiseringer. Tætheden af AMPA-R'er i ITC pigge var signifikant højere i forhold til aksel synapser målrettet med PIN / MGN thalamiske afferenter. På begge rygsøjlen og akslen synapser, blev en positiv korrelation mellem mærkning af AMPA-R'er og postsynaptiske område opdaget, en funktion fælles for andre glutamaterge synapser 25. Den lave varians i tætheden af AMPA-R'er i PIN / MGN-ITC synapser indikerer en homogen fordeling ligner andre synapser dannet af thalamiske efferents 7, men forskellig fra kortikale synapser 25. Omvendt tætheden af NMDA-R'er var mere variabel og var ikke forskellig mellem rygsøjlen og akslen synapser tyder en anden regulering end AMPA-R'er. I fremtiden vil den høje reproducerbarhed FRIL teknik ikke kun tillader at vurdere basale molekylære sammensætning af centrale synapser, men kan lette afsløringen af cNDRINGER i ionotrope glutamat receptor numre og subsynaptic fordeling efter frygt læring, der supplerer ex-vivo optagelser af præ- og postsynaptiske egenskaber af disse indgange.
Afslutningsvis kan denne fremgangsmåde bruges af andre forskere at få indblik i mellem struktur og funktion af input-specifikke excitatoriske synapser i mange andre neurale kredsløb, hvor udrede oprindelsen af indgangene og arten og sammensætningen af postsynaptiske elementer er afgørende, men problematisk .
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the Austrian Science Fund FWF grant No. P-22969-B11 to F. Ferraguti, and by the Charitable Hertie Foundation and the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience and by the DFG (CIN-Exc. 307) to I. Ehrlich.
Surgery | |||
Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
Steretoxic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | |
Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
DC Temperature Controler and heating pad | FHC, USA | 40-90-8D | |
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) | Purdure Products, USA | BSOL32 | can be replaced by other disinfectants |
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
Bepanthen eye ointment | Bayer, Germany | 0191 | can be replaced by other eye ointments |
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) | Nouvag, Switzerland | ||
Sutranox Suture Needle | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
Braided Silk Suture | Fine Science Tools, Germany | 18020-60 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue preparation | |||
Paraformaldehyde EM grade | Agar Scientific Ltd., United Kingdom | AGR1018 | |
Saturated picric acid solution | Sigma-Aldrich, USA | P6744-1GA | |
Na2HPO4-2H20 | Merck Millipore, Germany | 1065860500 | |
NaH2PO4-2H2O | Merck Millipore, Germany | 1063451000 | |
NaCl | Merck Millipore, Germany | 1064041000 | |
4N NaOH | Carl Roth, Germany | T198.1 | |
Thiopental | Sandoz, Austria | 5,133 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich, USA | G5516-500ML | |
GenPure ultrapure water system | Thermo Fisher Scientific, USA | 50131235 | |
Peristaltic pump | ISMATEC, Germany | ISM 930C | |
Filter Paper | MACHEREY-NAGEL, Germany | MN 615 1/4 | |
Vibroslicer, VT1000S | Leica Microsystems, Austria | ||
Ophthalmic scalpel | Alcon Laboratories, USA | can be replaced by other ophthalmic scalpels | |
Perfusion cannula | Vieweg, Germany | F560088-1 | can be replaced by similar items from other companies |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
High-pressure Freezing | |||
Copper carriers | Engineering Office M. Wohlwend, CH | 528 | |
Sidol Polish | Henkel, Germany | can be replaced by same item from other companies | |
Chamois skin | Household supply store | ||
Hole punch, 1,5mm | Stubai, Austria | can be replaced by same item from other companies | |
Denatured ethanol | Donauchem, Austria | can be replaced by same item from other companies | |
Aceton | Roth, Germany | 9372.5 | CAUTION! |
High Pressure Freezing Machine HPM 010 | BalTec, CH; now Leica Microsystems | HPM010 | not produced any more, substituted by LeicaEM HPM100 |
Stereo-microscope | Olympus, Japan | SZX10 | |
Liquid nitrogen | CAUTION! | ||
Cryo-vials | Roth, Germany | E309.1 | can be replaced by same item from other companies |
CryoCane | Nalge Nunc International,USA | 5015-0001 | can be replaced by same item from other companies |
CryoSleeve | Nalge Nunc International,USA | 5016-0001 | can be replaced by same item from other companies |
Liquid nitrogen storage vessel | Cryopal, France | GT38 | can be replaced by same item from other companies |
Non-ionic detergent (Lavocid) | Werner & Mertz Professional, Germany | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Freeze-fracture and Replication | |||
Sandblaster, Mikromat 200-1 | JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany | SANDURET 2-K | can be replaced by same item from other companies |
Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 – 21µ | JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany | 955932 | |
Freeze Fracture System BAF 060 | BalTec, CH; now Leica Microsystems | BAF060 | |
Ceramic 12 well plate | Gröpel, Austria | 14511 | can be replaced by same item from other companies |
Trizma base | SIGMA, USA | T1503 | can be replaced by same item from other companies |
Trizma hydrochloride | SIGMA, USA | T3253 | can be replaced by same item from other companies |
Sodium chloride | Merck, Germany | 1,064,041,000 | can be replaced by same item from other companies |
SDS, Sodium lauryl sulfate | Roth, Germany | 5136.1 | CAUTION! ; can be replaced by same item from other companies |
Sucrose | Merck, Germany | 1,076,871,000 | can be replaced by same item from other companies |
TRIS | Roth, Germany | 5429.3 | can be replaced by same item from other companies |
Universal Hybridization Oven | Binder, Germany | 7001-0050 | can be replaced by same item from other companies |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunolabelling | |||
BSA | SIGMA, USA | A9647 | can be replaced by same item from other companies |
Anti-GFP Antibody | Molecular Probes, USA | A11122 | |
Anti-pan-AMPAR Antibody | Frontier Institute, Japan | pan AMPAR-GP-Af580-1 | |
Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1 | Merck Millipore, Germany | MAB363 | |
Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody | ImmunoStar, USA | 24216 | |
EM goat anti-guinea pig, 5nm; secondary antibody | BBInternational, | EM.GAG5 | |
EM goat anti-rabbit, 15nm; secondary antibody | BBInternational, | EM.GAR15 | |
Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody | AURION, Netherlands | DAR 10nm | |
Copper grids, 100 Parallel Bar | Agar scientific, UK | G2012C | |
Incubator | Major Science, USA | MO-RC | can be replaced by same item from other companies |
Pioloform Powder | Agar scientific, UK | R1275 | |
Chloroform | Roth, Germany | 3313.1 | CAUTION! ; can be replaced by same item from other companies |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EM analysis | |||
Philips CM120 TEM | Philips/FEI | ||
Morada CCD camera | Soft Imaging Systems, Germany | ||
iTEM Ver. 5.2, imaging software | Soft Imaging Systems, Germany |