本文阐述了如何通过光遗传学工具的病毒转导与冰冻断裂复型免疫标记技术相结合，对具有已鉴定的突触前和突触后成分的突触处神经递质受体的表达进行定量，并分析其分布模式。
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摘要
摘要
冰冻断裂电子显微技术在超微结构研究中已有40多年的历史，是一项重要的研究手段。然而，由于缺乏有效的方法来研究膜的分子组成，该技术的使用曾显著减少。近年来，随着能够通过免疫金标记揭示整合膜蛋白的有效方法的发展，冰冻断裂电子显微技术得到了重大复兴。其中一种方法称为去垢剂溶解冰冻断裂复型免疫标记法（FRIL）。
将FRIL技术与光遗传学相结合，可实现对中枢突触结构与功能特性的关联分析。利用该方法，可通过标记的通道视紫红质和特异性分子标记物的表达，分别鉴定并表征突触前和突触后神经元。谷氨酸能突触突触后膜特化结构的独特形态，使得在标记离子型谷氨酸受体后，能够定量分析这些受体在突触内的分布情况。本文将逐步描述制备成对复型样品及其免疫标记所需的操作流程。同时，我们也将讨论FRIL技术的注意事项与局限性，特别是与潜在取样偏差相关的问题。FRIL技术具有高度可重复性和广泛适用性，当其与光遗传学结合时，为在脑内已知神经微环路中表征突触传递的多个方面提供了一种极为强大的研究手段。
本文举例说明了该方法如何被用于研究小鼠杏仁核内侧间质细胞群神经元兴奋性突触的结构与功能关系。具体而言，我们研究了源自丘脑后内侧板内核和内侧膝状体核的特定输入中离子型谷氨酸受体的表达情况。这些突触被证实可传递与恐惧学习相关的感觉信息，并在恐惧条件反射过程中发生可塑性变化。
引言
近年来，随着多种适用于透射电子显微镜的免疫标记技术的发展，对生物膜在纳米尺度上功能结构的解析面临新的挑战。然而，这些技术 例如， 免疫金标技术（包括包埋前和包埋后标记）存在若干重要局限性，例如抗原检测效率低和/或对膜结合蛋白的定量评估受限。这些局限性在神经系统精细结构的研究中尤为突出，因为神经系统具有高度的细胞多样性和突触异质性。这种异质性源于突触前和突触后成分在结构与功能上的差异，以及信号蛋白（如受体、转运蛋白和效应分子）在表达水平、富集程度或相互作用方面的差异。
二十年前，Fujimoto 首次提出了一种直接对去垢剂溶解的冰冻断裂复型（FRIL）中整合性或交联膜蛋白进行免疫标记的新方法。 1. 然而，这一原始方法存在若干局限性， 即， 复制品严重碎片化，阻碍了在脑等复杂组织中将标记分子与单个定位细胞进行有意义的相关性分析。大约10年前，Shigemoto和Fukazawa逐步改进了该技术 2这一进展与科罗拉多州立大学博尔德实验室的另一组科学家所开展的工作相呼应，他们也显著改进了该技术，特别是在间隙连接的研究方面。 3.
随着冷冻断裂技术方案和设备的改进，以及快速冷冻（高压下）技术的引入，研究人员现在能够制备出较大尺寸且高质量的完整复型样品，并获得大多数细胞组分的高分辨率图像，从而避免了强化学固定所带来的局限性和人工假象。
FRIL 技术具有高度定量化的显著优势 原位 在复杂组织（如脑组织）中，对经过组织学定位和细胞学鉴定的细胞内一种或多种蛋白质进行（同时）鉴定，此外还可通过单个复制品获得突触前和突触后结构元件的平面视图。因此，尽管冷冻断裂复制免疫标记技术（FRIL）面临诸多技术挑战，仍有望在多个重要科学领域实现突破，尤其在关联单个突触的结构与功能特性方面具有重要意义。在过去的几十年中，研究人员已获得了大量关于突触结构、分子组成及其生理功能的信息；然而，突触在形态和分子水平上具有高度异质性，其特征取决于突触前和突触后神经元的类型。 4迄今为止，仅有少数几种突触类型完成了结构与功能的研究 5-7这主要是由于技术限制，无法精确鉴定突触前和突触后成分的性质。
超微结构分析在突触后膜特化结构的多样性方面提供了关键见解，揭示了不同突触连接在突触大小以及神经递质受体含量方面的差异6，这些差异对突触传递的强度和可塑性具有重要影响。此外，大量研究表明，在不同类型突触处表达的离子型谷氨酸受体数量受到传入纤维和靶细胞依赖性方式的调控7-10。
本文介绍了一种方法，可用于分析具有明确突触前成分和功能的突触后膜特化结构及其受体组成。该方法结合了突触前表达新型光敏感藻类蛋白（如通道视紫红质2，ChR2）的技术与冷冻断裂复制免疫标记法（FRIL），以研究突触后膜上α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA-Rs）和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA-Rs）谷氨酸受体的分布模式。该方法在后丘脑-内侧膝状体核（PIN/MGn）轴突与杏仁核内侧间质细胞群（ITC）神经元之间形成的突触上进行了验证。ITC神经元是小而有棘的GABA能神经元，成簇分布于基底外侧杏仁核复合体（BLA）周围11, 12。已知ITC神经元接收来自BLA主神经元的兴奋性输入，并投射至中央杏仁核（CeA），因此在BLA与CeA之间的信息传递中起抑制性门控作用12-15。
最近，我们证明了位于基底外侧杏仁核（BLA）与中央杏仁核（CeA）之间内侧背侧簇中的小胶质细胞间质神经元（ITC神经元）也直接接收来自感觉丘脑和颞叶皮层区域的兴奋性输入，这些输入在经典条件性听觉恐惧学习过程中会发生改变16。恐惧条件化是脑机制研究中最清楚的联想学习形式之一。在恐惧条件化中，一个原本中性的条件刺激（CS，例如，一种音调）与一种令人厌恶的非条件刺激（US，例如，轻微足底电击）配对，从而形成CS-US关联并引发条件性恐惧反应17, 18。已知分别携带代表CS和US信息的丘脑和新皮层区域的兴奋性输入会汇聚到杏仁核外侧核（LA）的锥体神经元上，并发生可塑性变化19。我们先前的研究揭示，感觉输入信息也会平行地传递至ITC神经元16。
为了对投射到ITC神经元的单个感觉输入突触进行机制性的分子分析，我们使用腺相关病毒（AAV）表达与黄色荧光蛋白（YFP）标记的ChR2。将AAV注射到PIN/MGn区域，并通过ChR2-YFP的表达来鉴定轴突末梢。我们利用FRIL技术获得的两个切面，评估PIN/MGn轴突末梢与ITC神经元形成的突触处突触后AMPA受体（AMPA-Rs）和NMDA受体（NMDA-Rs）的密度。
方案
涉及动物受试者的实验程序已获得德国巴登-符腾堡州蒂宾根地区政府以及奥地利动物实验伦理委员会的批准，并符合欧盟关于实验动物使用的规定。
1. AAV-Channelrhodopsin2-YFP 的立体定位注射
注意：立体定位注射按照先前发表的方案进行20。
- 将工具在 180 ºC 下加热 1.5 小时以进行灭菌。
- 使用水平微电极拉制仪，按照以下参数拉制尖锐（直径约 50 µm）的玻璃移液管用于注射：加热 = 斜坡值 - 20，拉力 = 0，速度 = 100，时间 = 200，压力 = 200。
注意：斜坡值需根据微移液管拉制仪制造商提供的说明，针对每批购买的玻璃移液管单独确定。 - 在无菌磷酸盐缓冲液（PBS；25 mM，0.9% NaCl，pH 7.4）中预混 1 µl 病毒溶液和 0.2 µl 0.1% 快绿溶液（以提高溶液在玻璃移液管中的可见性）。使用 10 µl 移液器和凝胶填充吸头将混合液装入玻璃移液管。病毒载体使用 rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP（血清型 2/9）。
- 使用小型动物麻醉装置（以 3% 异氟烷与氧气混合进行诱导麻醉）对小鼠进行麻醉。本研究使用约 6 周龄的 3 只野生型小鼠。
- 剃除小鼠耳间至眼间的头部毛发，并使用聚维酮碘溶液进行消毒。
- 涂抹眼膏以防止麻醉期间眼睛干燥。皮下注射镇痛药（基于美洛昔康，0.1 ml 的 5 mg/ml 溶液）。
- 将小鼠固定于立体定位仪中，并通过气体麻醉装置维持麻醉（以 2% 异氟烷与氧气混合维持）。在继续操作前，通过检查肢体回缩反射是否消失来确认麻醉深度。
- 在整个手术过程中尽可能保持无菌条件。佩戴一次性口罩、手术服和手套。
- 使用剪刀在小鼠头顶做约 1 cm 的皮肤切口20。用钝头镊子轻轻将皮肤向一侧牵拉，用夹子固定以暴露颅骨表面，并用 H2O2 清洁颅骨。
- 使用细头永久性记号笔在颅骨上标记注射位点。在标记位置钻出一个小孔（直径约 1 mm）。本研究中单侧 PIN/MGn 注射使用以下坐标：从前囟（mm）计，后向 3.0，侧向 ±1.8，腹向 3.8。
- 将装有液体的玻璃移液管安装到连接压力注射装置的立体定位仪上，并将移液管移至前囟位置。
- 使用细直头镊子折断玻璃移液管的尖端。通过施加数次压力脉冲并观察病毒溶液液滴的挤出，确保移液管尖端通畅。
- 将移液管移至目标注射坐标，使用压力注射装置以以下参数注入一半内容物（约 0.5 µl）：压力 20 psi，平均脉冲时长 30 ms，平均脉冲次数 50。
- 注射后保持移液管静置约 1 分钟，然后缓慢（1 mm/min）回撤。
- 用 PBS（pH 7.4）清洁颅骨，取下夹子。轻轻将皮肤拉拢并缝合切口（3–4 个结）。在伤口周围涂抹消毒剂（聚维酮碘基）。
- 停止麻醉，在小鼠完全清醒前不得离开其身边。术后将小鼠单独饲养。持续监测其健康状况；必要时给予镇痛药。
- 在脑组织固定前饲养动物 4 周，以确保病毒表达达到适当水平。
2. 样品制备
- 脑组织固定
- 固定液的配制
- 配制1 L固定液时，称取10 g多聚甲醛，加入300 ml去离子H2O中，于55–60 ºC加热约10分钟，并持续搅拌。
- 停止加热，加入7–8滴4 N NaOH。溶液应在约10分钟内变得澄清。
- 让其冷却至室温，加入150 ml苦味酸饱和溶液，并用去离子H2O定容至500 ml。
- 加入500 ml 0.2 M磷酸盐缓冲液（PB）。用滤纸过滤，用NaOH调节pH至7.4。
- 将固定液冷却至6 ºC，储存于避光玻璃瓶中，于6 ºC保存不超过一天。
- 经心脏灌注
- 通过腹腔注射硫喷妥钠（120 mg/kg体重）麻醉小鼠。通过检测后肢回缩反射确认动物已深度麻醉，该反射应消失。将动物仰卧固定于灌注台上，四肢固定。
- 使用钝头剪刀纵向切开腹壁，并沿肋骨笼尾侧边缘做两个横向切口，暴露膈肌。剪除膈肌，并在两侧软骨-骨交界处剪开胸壁。抬起包含胸骨的胸壁中央部分的尾端，暴露心脏。
- 去除心包膜，在左心室尖端做一小而精确的切口，插入灌注装置的套管。使用内径为0.6 mm的钝头套管，轻柔地将套管穿过心室，直至其尖端进入升主动脉，并用夹子固定套管。为使血液和灌注液从循环系统中流出，在右心房做一切口。
- 使用蠕动泵经心脏灌注小鼠，初始流速为5 ml/min，先用PBS（25 mM，0.9% NaCl，pH 7.4）灌注约1分钟，随后用冰浴冷却的固定液灌注7分钟。
- 固定完成后，用剪刀剪下小鼠头部，然后从颈部至鼻部沿中线切开皮肤。去除肌肉组织以充分暴露颅骨。
- 使用锋利剪刀从枕骨大孔开始，沿枕骨和顶间骨做纵向切口。用精细镊子移除这些骨骼，暴露整个小脑。然后沿顶骨和额骨至鼻骨做另一纵向切口，并用镊子移除骨骼，暴露整个脑组织。
- 使用刮铲小心取出脑组织，避免损伤，将其置于冰浴的0.1 M PB中。
- 固定液的配制
- 样本切片与修整
- 使用剃须刀片切割包含目标区域的约5–6 mm冠状组织块。使用氰基丙烯酸酯胶水将其粘附于振动切片机的样品台上。调整组织块方向，使新皮层朝向振动刀片。在冰浴的0.1 M PB中使用振动切片机（图1A）切割包含杏仁核的140 µm冠状切片，并将切片收集于6孔板中的相同缓冲液中。
- 在体视显微镜下，使用眼科手术刀在涂有硅橡胶弹性体并盛有0.1 M PB的培养皿中，从切片中修整出目标区域（此处为ITC的内侧背侧被膜下簇，见图1B）。确保修整后的组织块可适配于间隔片的孔径（约1.5 mm）（图1B）。
- 将修整后的组织块转移至冷冻保护液（含30%甘油的0.1 M PB）中，于6 ºC过夜保存。
3. 高压冷冻
注意：冷冻断裂复型电镜技术（FRIL）包含6个关键步骤（图2）：1）在高压（2,300 - 2,600 bar）条件下对样品进行快速冷冻。2）样品断裂。断裂面通常沿冷冻膜的中央疏水核心延伸，将膜一分为二，形成两个半层膜：一侧紧邻细胞质（P面），另一侧紧邻细胞外或外质空间（E面）。3）通过真空沉积铂和碳对样品进行复型。4）使用去垢剂消化组织。5）免疫胶体金标记。6）利用透射电子显微镜对复型样品进行观察分析。
- 铜载物台的制备
注意：为了在FRIL程序的各个连续阶段中进行处理，样品需要安装在金属（金或铜）载物台上。这些载物台的尺寸和设计根据断裂方式和所用设备类型的不同而有所差异。本实验中使用铜载物台（图1B,E）和一种铰接式“双复制台”（见图3B），打开时可在冷冻样品上产生拉伸断裂（图2），从而保留并复制断裂样品的两个表面。- 使用麂皮蘸取去污剂对铜载物台进行抛光处理。
- 将载物台放入玻璃容器中，在超声水浴中用非离子型洗涤剂（pH ~1.5）清洗两次，随后用自来水充分冲洗，再用去离子水冲洗，最后用乙醇冲洗两次。
- 将铜载物台在丙酮中超声处理15分钟。
- 将载物台置于滤纸上晾干。
- 在铜载物台上粘贴一圈双面胶带（图1C），用于固定修整好的样品块（称为持样载物台）。
- 样品冷冻
注意：操作液氮时应小心，并佩戴适当的护目镜。- 在开始冷冻样品前至少1.5小时启动高压冷冻仪（图1F）。
- 按下“AIR HEATER”按钮开始加热，烘烤50分钟，将空气温度设定为80 °C。
- 将氮气罐连接至高压冷冻仪，按下“NITROGEN”按钮，向内部杜瓦瓶中充入液氮，此时“NITROGEN LEVEL”指示灯亮起。按下“Cooling”按钮开始冷却。
- 当“NITROGEN LEVEL”指示灯熄灭后，按下“DRIVE IN”按钮，检查液压系统是否使活塞往复运动三次。
- 按下“AUTO”按钮和“NITROGEN”按钮，一旦“READY”指示灯亮起，高压冷冻仪即准备就绪，可进行高压冷冻。
- 使用已熔入玻璃移液管中的铂丝环，将修整好的样品块放置于双面胶带的孔洞中（图1B）。
- 用滤纸或刷子去除多余的冷冻保护液。
注意：此步骤对于去除组织周围可能形成的气泡至关重要，气泡可能导致组织形态和/或超微结构发生扭曲。 - 在体视显微镜下，用另一个载物台覆盖持样载物台，使组织块被夹在两个载物台之间。
- 将载物台夹心结构插入高压冷冻仪的样品架中（图1D），将样品架插入高压冷冻仪（尖端朝下），并通过旋紧固定样品架。
- 按下“Jet-Auto”按钮启动冷冻循环。尽快取出样品架，并将尖端浸入盛有液氮的保温箱中。同时将两对镊子的尖端浸入液氮中进行冷却。
- 小心地从样品架中取出载物台夹心结构，并将其放入预冷的冻存管中。确保仅使用经液氮冷却的镊子操作载物台。冻存管应预先打孔，以便氮气顺利逸出（图1G）。
- 重复步骤3.2.6至3.2.11，直至所有目标样品均完成冷冻。含有相同类型样品的多个载物台夹心结构可存放于同一冻存管中。
- 将装有载物台的冻存管存放于液氮罐中，直至进行复制操作（图1H）。
图1. 组织制备与高压冷冻。 (A用于切片组织的振动切片机。 (B) 显示包含杏仁核的冠状小鼠脑切片与装有双面胶圈的铜载网并列示意图。虚线框标示出包含ITC内侧旁囊簇的兴趣区域。双面胶圈上的孔径直径约为1.5 mm。C) 铜载网制备工具。从左上角开始顺时针方向：双面胶带、镊子、打孔器、铜载网和剪刀。 (D) 将载样夹心结构插入高压冷冻样品载 holder。将载样夹心结构放置于样品载 holder 的孔洞中。E无双面胶带环和带双面胶带环的铜质载片，以及“载片三明治”结构。 (F高压冷冻装置，配备向其供应液氮的加压罐。G用于储存冷冻组织的冻存管。注意冻存管上部中间位置的小孔，可使氮气从管内逸出（箭头所示）。 (H用于储存冷冻组织的液氮罐。 请点击此处以查看此图的放大版本。
4. 冷冻断裂与复型
- 电子束枪的准备
- 在插入电子束枪之前，取下带有“偏转板”的屏蔽罩。通过下部阴极盖将用于灯丝定心的“设定规”插入夹头卡盘中。
注意：设定规的较大直径端用于碳枪，较小直径端用于铂枪。 - 将新灯丝沿规杆滑入，直至“压力片”能够夹紧灯丝两端，确保灯丝线圈不倾斜。
- 取下设定规，插入碳棒。通过拧紧蒸发杆夹持器的夹头卡盘将其固定，确保碳棒末端的高度位于从底部数第二个线圈的中部。对于铂枪，铂棒末端的高度应位于从顶部数第二个灯丝线圈的中部。
- 重新安装偏转板，并将电子束枪插入冷冻断裂装置。使用后用喷砂装置清洁电子束枪。
- 在插入电子束枪之前，取下带有“偏转板”的屏蔽罩。通过下部阴极盖将用于灯丝定心的“设定规”插入夹头卡盘中。
图2. FRIL技术关键步骤示意图。
制备和分析复制品所需各步骤的概述。（1）组织的高压冷冻。（2）断裂。在冷冻组织断裂过程中，质膜的脂双层在疏水界面处分裂为两半。质膜中的蛋白质被分配到外质面（E面）或原质面（P面）上。（3）复制。碳（C）的蒸发将脂质和蛋白质固定在断裂组织的表面。样品先以60°角喷镀2 nm的铂/碳进行投影，然后再覆盖一层15 nm的碳层以增强复制品的结构稳定性（C层，Pt投影）。（4）溶解。未被复制品膜固定的组织成分随后用SDS溶液溶解去除。（5）标记。可通过特异性的一抗（Primary Ab）与连接有金颗粒（Au）的二抗（Secondary Ab）形成的复合物，在复制品上对目标蛋白质进行可视化检测。使用不同尺寸的金颗粒可在同一复制品上同时检测多种蛋白质。（6）免疫标记后，将复制品收集到铜网载网上，使用透射电子显微镜在80 - 100 kV条件下进行观察分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 冷冻断裂装置的设置
- 打开冷冻断裂装置（图3A) 将主电源开关拨至1。有关冷冻断裂和复型步骤的详细说明，请参阅制造商提供的操作说明书。
- 在冷却冷冻断裂装置之前，使用暖风对设备的整个冷却系统进行烘烤。按下MTC 010设备（温度控制单元）上的“Thawing”按钮图3A）并让烘烤过程持续运行45分钟。
- 启动真空站。冷冻断裂装置通常在约10⁻⁶ mbar的真空范围内运行。-6 - 10-7 mbar
- 填充氮气罐并将氮气罐连接至冷冻断裂装置。检查阀座是否干燥，并在插入阀座前清洁氮气罐入口（湿气可能影响真空度及氮气指示）2 注水至储水罐）。
- 开始降温，将温度设置为 -115 °C冷却大约需要45分钟。
- 插入电子束枪，并调节电流和电压，以达到以下蒸发参数：
碳枪：开启旋转，调整位置 90°，碳积累速率为 0.1 - 0.2 nm/sec
碳-铂枪：关闭旋转，调整位置 60°，累积速率 0.06 - 0.1 nm/sec
注意：若在更换碳棒或铂棒后首次使用喷枪，使用前需抽真空脱气3分钟。
- 断裂与复制
- 将冷冻的载样夹心装置插入双复制台，确保所有操作均在液氮中进行。
- 将双复型载网转移至杜瓦瓶，并以一定角度固定在样品台接收器上 45°液氮液面应始终高于双 replica 台。
- 使用台面操作器拾取双复制载台，并将其插入冷冻断裂仪的冷台上。等待约20分钟，使双复制载台的温度降至-115 °C.
- 检查真空度是否低于10-6 毫巴，温度为 -115 °C.
- 通过手动逆时针旋转位于双复型台上方罩壳所连接的转轮来断裂组织。当罩壳转动时，会带动双复型台打开，从而断裂组织。
- 按下冷冻断裂装置的 EVM 030 设备（电子束蒸发控制单元）上的“High tension”按钮图3A).
- 复制断裂组织的暴露表面图3C通过位于其上方的电子束枪蒸发碳（旋转） 90° 5 nm 厚度的倾斜角度，随后以铂-碳进行单向阴影处理 60° 2 nm 厚度的倾斜角。最后，从一个源施加一层 15 nm 厚的碳层 90° 角度（旋转）
- 使用以下参数进行蒸发：
第1个碳：旋转开启，位置 90°；速度 0.1 - 0.2 nm/sec；5 nm
第2个碳-铂：位置 60°；速度 0.06 - 0.1 nm/sec；2 nm
第3个碳原子：开启旋转，定位 90°；速度 0.3 - 0.5 nm/sec；15 nm - 从冷冻断裂装置中取出复制的样品，并将其转移至陶瓷12孔板中（图4A) 加入 TBS（Tris 缓冲盐水，pH 7.4）。
- 使用铂金环丝杆，从样本载体上取下复制的组织图4A).
- 重复步骤 4.3.1 至 4.3.10，直至所有样本均完成重复。
图3. 冷冻断裂与复型。
(A) 冷冻断裂装置。该设备包含多个控制单元和一个显示器。样品通过腔室左侧的端口引入腔内。加压液氮容器连接至冷冻断裂装置，用于冷却样品台。下方图像显示了其中两个单元（UPC 010 和 MDC 010）的放大视图，以及在第二层碳膜蒸发过程中显示参数的显示器。 (B) 双复型台的打开（左）和关闭（右）状态。"载网三明治"被插入到台面的插槽中（箭头所示）。小臂可防止在操作过程中"载网三明治"脱落。(C) 一个经过断裂和复型处理的样品。复型表现为断裂组织上方的薄黑色膜状结构。请点击此处查看该图的放大版本。
- 复制品的SDS消化
- 将复制品转移至装有1 ml SDS消化缓冲液（含2.5%十二烷基硫酸钠、20%蔗糖的15 mM Tris缓冲液，pH 8.3）的4 ml玻璃小瓶中。在80 °C条件下振荡（45次/分钟）消化18小时。
- 将复制品转移至装有SDS消化缓冲液的新离心管中，室温保存。
5. 免疫标记
注意：除抗体孵育外，所有孵育步骤均在室温下轻轻振荡进行。
- 将复制品在新鲜的SDS消化缓冲液中洗涤10分钟。
- 用含2.5% BSA（牛血清白蛋白）的TBS溶液洗涤复制品一次，每次5分钟，随后用含0.1% BSA的TBS溶液洗涤3次，每次10分钟。
- 用含5% BSA的TBS溶液在室温下封闭非特异性结合位点，持续1小时。
- 将一抗用含2% BSA的TBS溶液稀释后加入。在湿润腔室中，于15 °C条件下以30 µl液滴形式孵育72小时（图4B）（图4C）。
- 本研究中，对组织断裂后获得的两个复制品均进行处理。其中一个复制品使用以下抗体孵育：一种针对小鼠GluR1氨基酸717–754区域的豚鼠多克隆抗体（该区域为所有AMPA受体亚基共有，稀释比例为1:200），或一种针对NMDA受体NR1亚基氨基酸660–811区域的重组融合蛋白的小鼠单克隆抗体（稀释比例为1:500），以及一种针对绿色荧光蛋白的兔多克隆抗体（稀释比例为1:300）。
- 另一个复制品则使用一种针对大鼠µ-阿片受体氨基酸384–398区域的合成肽段的兔多克隆抗体（稀释比例为1:500）进行孵育。
- 用含0.05% BSA的TBS溶液洗涤3次，每次5分钟。
- 加入二抗。本研究中使用金标二抗（离子型谷氨酸受体使用5 nm金颗粒，µ-阿片受体使用10 nm金颗粒，和/或ChR2-YFP使用15 nm金颗粒），将其用含2% BSA的TBS溶液按1:30比例稀释，在15 °C条件下以30 µl液滴形式过夜孵育。
- 在室温下用含0.05% BSA的TBS溶液洗涤3次，每次5分钟。
- 用超纯水洗涤2次，每次5分钟。
- 将复制品固定在涂有Formvar的100目平行条形载网（图4D）上。
6. 复制分析
- 使用透射电子显微镜（TEM）在 80 或 100 kV 下对复型样品进行成像。通过 CCD（电荷耦合器件）相机获取数字图像。
- 离线分析时，利用参照标记（图 4E）在两个复型的图像上找到对应的区域。使用 Image J 软件分析数字图像，测定突触后区域面积以及针对所分析受体的免疫胶体金标记颗粒的数量。
图 4. 复型的免疫标记。
(A) 用于操作和清洗复型的工具。一个陶瓷12孔板（右上）和两种类型的玻璃移液管（左上）。带圆头的玻璃移液管（左下）用于转移复型，带铂金丝的移液管（中下）用于展开复型。右下图为在洗涤缓冲液中的一个复型。(B) 复型的免疫标记在组织培养6孔板中进行，将反应液滴（30 µl）置于parafilm小片上。注意复型被含有抗体的缓冲液滴完全覆盖。为防止蒸发，在孔的内边缘放置湿润的滤纸片。(C) 免疫标记步骤所用的培养箱。孵育在15 °C下进行。(D) 一个固定在经formvar包被的100路线条载网上的复型。(E) 一对复型的低倍显微照片。虚线方框标示了三个典型解剖标志，用于在对应复型中识别相同位置。比例尺：10 µm。所有数据均表示为均值 ± 标准误。请点击此处查看该图的放大版本。
结果
FRIL 技术与微生物来源的光遗传学效应蛋白的表达相结合时 21, 即， 整合于质膜并能沿轴突有效进行顺向运输的通道，可实现对特定突触亚群中AMPA受体和NMDA受体突触后表达的定量检测。本文展示了来自不同丘脑核团的轴突中的应用实例。例如， 将PIN/MGn投射至杏仁核内的ITC神经元。该方法能够对单个感觉传入突触在ITC神经元上的连接进行分子水平分析，而ITC神经元群至今仍难以通过详细的解剖学与分子特征进行表征。
在将rAAV-ChR2-YFP立体定位注射至PIN/MGn区四周后，ChR2-YFP阳性轴突密集支配了杏仁核的外侧杏仁核（LA）、杏仁核纹状体过渡区（Astria）以及内侧被囊旁ITC簇，该分布模式与先前的示踪研究结果完全一致16, 22。我们还在注射rAAV-ChR2-YFP小鼠的冰冻断裂复型样本中，在轴突和终末的P面观察到强烈的ChR2-YFP金标免疫反应信号（图5A），而在未注射小鼠的复型样本中则未检测到该信号。在复型样本中，兴奋性谷氨酸能突触的突触后膜特化结构表现为质膜E面上的一簇膜内颗粒（IMPs）2, 23，通常伴随其突触前质膜的P面出现7（图5B-C）。这些特征使我们能够识别由PIN/MGn轴突终末形成的谷氨酸能突触的突触后特化结构（图5和图6）。我们使用一种可识别全部四个亚基（GluA1-4）的抗体标记AMPA受体（AMPA-Rs），而NMDA受体（NMDA-Rs）则通过针对关键NR1亚基的抗体进行检测。
由于缺乏在同一复制品上检测这些突触是与ITC神经元的树突棘还是树突干形成的工具，我们对相应的复制品表面进行了μ-阿片受体标记，因为ITC神经元在突触后表达高水平的这类受体24。这需要利用参照标记（图4E）的策略，在两个复制品中识别相同的突触后结构（图5C-F 和 图6A-D）。
图 5. 通过免疫金颗粒在复型膜上检测 ChR2-YFP 和离子型谷氨酸受体。 （A）一个横断的轴突末梢（浅蓝色）及其部分 P 面被 15 nm 金颗粒标记以检测 ChR2-YFP。在末梢内可见多个突触小泡的膜（sv）。注意免疫标记主要局限于质膜，具有较高的特异性。ChR2 的标记表明该末梢起源于 PIN/MGn。该末梢与一个树突棘形成不对称突触。在 E 面上的突触后膜特化结构（PSD）显示出成簇的膜内颗粒，并被 5 nm 金颗粒标记，显示 AMPA 受体的存在。（B）表达 ChR2 的轴突 P 面（以 15 nm 金颗粒标记）与两个树突相邻，其中一个树突含有两个被 5 nm 金颗粒标记的 PSD，显示 NMDA 受体的存在。（C-D）PIN/MGn-ITC 突触的突触前和突触后膜的相对面。（C）末梢的 P 面表达 ChR2（以 15 nm 金颗粒标记），覆盖在两个树突干的 E 面上，其中一个树突干含有两个被标记 AMPA 受体的 PSD（5 nm 金颗粒）。（D）两个树突相应的 P 面被标记为 μ-阿片受体（10 nm 金颗粒）。（E-F）虚线框区域的放大视图。比例尺：500 nm。 请点击此处查看该图的放大版本。
在PIN/MGn-ITC突触的IMP簇内各处均发现有AMPA受体的免疫标记颗粒，提示其在突触后特化区域呈均匀分布（图5E）。与投射至ITC树突的突触（590±44 个金颗粒/µm2，n = 32）相比，投射至ITC树突棘的PIN/MGn-ITC突触中AMPA受体标记密度显著更高（非配对t检验，p<0.018），达到715±38 个金颗粒/µm2（n = 32）。总体而言，PIN/MGn-ITC突触中AMPA受体的密度变异程度相对较低（变异系数CV = 0.37），符合其均匀分布的特征。
在PIN/MGn-ITC突触的突触后膜致密区（postsynaptic IMP）簇内，常观察到NMDA受体（NMDA-Rs）的免疫颗粒分布不均（图5B）。PIN/MGn传入至ITC树突棘的突触中NMDA受体标记密度（1070±153 个金颗粒/µm2，n=8）与传入至ITC树突的突触（812±183 个金颗粒/µm2，n=9）相比无显著差异（非配对t检验，p=0.39）。与AMPA受体（AMPA-Rs）的观察结果不同，PIN/MGn-ITC突触中NMDA受体的密度变异程度较高（变异系数CV = 0.54）。
图6. 在鉴定出的PIN/MGn-ITC突触处AMPA受体和NMDA受体的免疫标记。
(A-B) PIN/MGn-ITC突触的突触前和突触后膜相对面，该突触形成于树突棘上，其中终末的P面表达ChR2（用15 nm金颗粒标记），而树突棘上的PSD标记了AMPA受体（5 nm金颗粒）。(C-D) 虚线框出区域的放大视图。这些区域已逆时针旋转约45°，以便更清晰地观察PSD。(E) ITC树突棘和树突中AMPA受体颗粒数量与突触面积的散点图。在两种结构中均观察到正相关关系。(F) ITC树突棘和树突中NMDA受体颗粒数量与突触面积的散点图。仅在树突棘中检测到显著的正相关关系。比例尺：500 nm。 请点击此处查看该图的放大版本。
由于突触前质膜的P面常常部分覆盖在突触后IMP簇上，我们仅能估算出30%突触的突触面积（树突棘：平均面积0.032 µm2，范围：0.007至0.063 µm2，n = 8；树突：0.047 µm2，范围：0.024至0.166 µm2，n = 11）。这些数值与先前分析的端脑谷氨酸能突触范围相似25。
在树突棘和树突中，单个突触内AMPA受体的胶体金免疫颗粒数量与突触面积呈正相关（Spearman法，树突棘：r = 0.88，树突：r = 0.60，p<0.0001）（图6E）。相反，NMDA受体的胶体金免疫颗粒数量仅在树突棘中与突触面积相关（Spearman法，树突棘：r = 0.90，p<0.002），而在树突中无此相关性（r = 0.21，p = 0.29）（图6F）。
讨论
冰冻断裂电子显微镜技术在超微结构研究中已有40多年的历史，是一项重要的研究手段。然而，由于缺乏有效的方法来研究膜的分子组成，该技术的使用曾显著减少。近年来，随着通过免疫胶体金标记揭示整合膜蛋白的有效方法的发展，特别是FRIL技术的出现，冰冻断裂电子显微镜技术得到了重大复兴1, 2。
FRIL 技术相较于其他免疫金超微结构方法具有多项优势。首先，蛋白质对抗体的可及性更高，从而提高了检测灵敏度。其次，质膜特化结构（如突触后膜）的大部分区域暴露于复型的二维表面，使得研究人员能够直接观察目标分子的空间分布和物理连续性，而无需进行繁琐且耗时的连续超薄切片三维重建。第三，由于质膜的两个半部分均可利用，只要存在合适的抗体，就可对每个特定结构标记更多的蛋白质。在膜断裂后，裂面的疏水面会被碳-铂镀膜覆盖，从而固定残留在断裂面上的蛋白质结构域，这会阻止抗体与这些结构域中的抗原结合。例如，在复型的 P 面上，只有朝向胞质空间的抗原表位可被抗体识别；而在 E 面上，只有朝向外胞质空间的抗原表位才能与抗体结合（见图 2）。
另一方面，冷冻断裂免疫标记技术（FRIL）也存在某些局限性2。由于断裂是随机发生的，可能难以针对特定细胞或结构进行观察。这还可能导致取样偏差，例如在突触收集过程中，因不同曲率结构（例如树突棘与树突干）的膜发生断裂的概率不同所致。此外，膜蛋白被分配到两个断裂面之一的结果具有不可预测性。因此，特别是在进行定量研究时，应使用可识别胞内和胞外结构域的抗体，仔细验证蛋白在P面或E面上的分布情况。最后，仅依靠形态学特征时，可能难以在复型样品中识别某些结构，例如突触前轴突终末。然而，使用针对标志蛋白的特异性抗体，或通过病毒载体转导带有标签的整合膜蛋白或通道蛋白，可为断裂膜的识别提供额外工具。例如，本研究利用在丘脑神经元中转导ChR2-YFP，以鉴定其在杏仁核中的轴突投射，或通过标记μ-阿片受体以识别ITC神经元的突触后膜。
为了成功实施FRIL技术，需特别注意组织固定。强组织固定（> 2%多聚甲醛）可能导致较高的断裂率并降低标记灵敏度。另一方面，固定不足会使组织处理和制备（例如， 切片难度增加。还需注意控制修整后样品块的厚度与双面胶带的厚度相匹配。若样品厚度小于胶带厚度，组织表面可能无法与两个金属载片表面充分接触，导致冷冻样品无法断裂；若组织过厚，则在两个铜载片形成三明治结构时会受到挤压，不可避免地造成结构变形。样品断裂时的温度（本方案中为 -115 °C）也对复型结构具有重要影响。较高温度可能导致更多伪影产生，例如在蒸发前或蒸发过程中水蒸气在组织表面冷凝；较低温度（< -125 °C）可能会增加断裂过程中材料剥落的风险。这些剥落的材料可能掉落在样品表面，或仍与样品相连。这些材料碎片也会被镀膜和染色，从而在图像上形成暗斑。在较低温度下断裂还可能影响横断裂的频率，特别是对于树突棘等微小精细结构。复型制备中的另一个关键步骤是去污剂消化。如果消化不完全，未消化的组织会在复型上呈现为暗斑，干扰透射电镜下结构的分析。此外，未消化的组织可能非特异性地捕获或结合抗体，导致背景标记增强。另一方面，使用去污剂进行组织消化可能导致与复型相关的分子变性，改变其二级和三级结构。因此，对于某些抗原，可能需要通过增加洗涤步骤逐步稀释SDS的浓度。
进行免疫标记时，使用不同尺寸的金颗粒标记的二抗可同时检测多种蛋白质，即使是在细胞膜的特定微区（如突触后特化结构）中，也能实现检测，但仅限于定性分析。然而，由于空间位阻效应，定量研究通常仅限于检测一种分子。金颗粒的尺寸还可能影响标记效率。
在解释FRIL中的标记时，应考虑到由于一抗和二抗形成的柔性复合物，免疫金颗粒可能位于距抗原20-25 nm半径范围内的半球空间内的任意位置26。有关FRIL及相关技术的理论与实践的进一步信息，我们还建议读者参考其他方法学文章27, 28。
FRIL 技术最近已被用于对不同类型突触中谷氨酸受体定位进行高分辨率的定量分析29, 30。此外，FRIL 技术对 AMPA 受体（AMPA-Rs）的检测灵敏度估计可高达每个功能性 AMPA 受体通道对应一个免疫金颗粒29。因此，该方法总体上非常适用于对中枢突触中 AMPA-Rs 和 NMDA-Rs 的突触后表达模式进行定量与分析。本文中，我们证明了该技术在 PIN/MGn-ITC 突触上的适用性，该位点极有可能在恐惧条件反射过程中传递非条件刺激（US）信息。使用针对 AMPA 受体亚基 GluA1-GluA4 高度保守的胞外氨基酸残基所制备的抗体，我们发现金颗粒在对应于突触后膜特化结构的膜内颗粒（IMP）簇内呈均匀分布。ITC 树突棘突触中 AMPA-Rs 的密度显著高于 PIN/MGn 丘脑传入纤维所支配的轴突干突触。在树突棘和轴突干突触中，均检测到 AMPA-Rs 标记水平与突触后面积之间存在正相关关系，这一特征也见于其他谷氨酸能突触25。PIN/MGn-ITC 突触中 AMPA-Rs 密度的低变异程度表明其分布具有均一性，类似于其他由丘脑传出纤维形成的突触7，但不同于皮层突触25。相反，NMDA-Rs 的密度变异程度更高，且在树突棘与轴突干突触之间无显著差异，提示其调控机制与 AMPA-Rs 不同。未来，FRIL 技术的高度可重复性不仅有助于评估中枢突触的基础分子组成，还可能促进在恐惧学习后对离子型谷氨酸受体数量及其突触下分布变化的检测，从而补充这些传入通路突触前和突触后特性的离体（ex-vivo）电生理记录研究。
总之，这种方法可被其他研究者用于深入探究多种其他神经回路中特定输入性兴奋性突触的结构-功能关系，尤其适用于那些需要区分输入来源以及明确突触后成分的性质与组成、但目前仍存在困难的研究场景。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究由奥地利科学基金 FWF 资助，资助编号为 P-22969-B11（授予 F. Ferraguti），以及由慈善赫蒂基金会、Werner Reichardt 神经科学整合研究中心和德国研究基金会（DFG，CIN-Exc. 307）资助（授予 I. Ehrlich）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 手术 | |||
| 立体定位仪 | Stoelting, USA | 51670 | 可由其他小鼠用立体定位仪替代 |
| 小鼠适配器（用于立体定位仪） | Stoelting, USA | 51625 | |
| 小鼠用气体麻醉面罩 | Stoelting, USA | 50264 | 已停产，由货号 51609M 替代 |
| 压力注射装置，Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | 可使用其他压力注射装置（例如 Picospritzer） |
| Kwik Fill 玻璃毛细管 | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
| 麻醉机，IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
| 直流温度控制器及加热垫 | FHC, USA | 40-90-8D | |
| 水平式微电极拉制仪 P-1000 型 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
| 外科器械灭菌器，Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
| rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP（血清型 2/9） | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
| 快绿染料 | Roth, Germany | 0301.1 | |
| 异氟烷麻醉剂，Isofuran CP（1 ml/ml） | CP Pharma, Germany | ||
| 消毒剂，Betadine（聚维酮碘） | Purdure Products, USA | BSOL32 | 可由其他消毒剂替代 |
| 镇痛药，Metacam 溶液（5 mg/ml 美洛昔康） | Boehringer Ingelheim, Germany | 可由其他镇痛药替代 | |
| Bepanthen 眼膏 | Bayer, Germany | 0191 | 可由其他眼膏替代 |
| 钻机 NM3000（SNKG1341 和 SNIH1681） | Nouvag, Switzerland | ||
| Sutranox 缝合针 | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
| 编织丝线缝合线 | Fine Science Tools, Germany | 18020-60 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 组织制备 | |||
| 电子显微镜级甲醛 | Agar Scientific Ltd., United Kingdom | AGR1018 | |
| 饱和苦味酸溶液 | Sigma-Aldrich, USA | P6744-1GA | |
| Na2HPO4-2H20 | Merck Millipore, Germany | 1065860500 | |
| NaH2PO4-2H2O | Merck Millipore, Germany | 1063451000 | |
| NaCl | Merck Millipore, Germany | 1064041000 | |
| 4N NaOH | Carl Roth, Germany | T198.1 | |
| 硫喷妥钠 | Sandoz, Austria | 5,133 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich, USA | G5516-500ML | |
| GenPure 超纯水系统 | Thermo Fisher Scientific, USA | 50131235 | |
| 蠕动泵 | ISMATEC, Germany | ISM 930C | |
| 滤纸 | MACHEREY-NAGEL, Germany | MN 615 1/4 | |
| 振动切片机，VT1000S | Leica Microsystems, Austria | ||
| 眼科手术刀 | Alcon Laboratories, USA | 可由其他眼科手术刀替代 | |
| 灌注套管 | Vieweg, Germany | F560088-1 | 可由其他公司类似产品替代 |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 高压冷冻 | |||
| 铜载样器 | Engineering Office M. Wohlwend, CH | 528 | |
| Sidol 抛光剂 | Henkel, Germany | 可由其他公司同类产品替代 | |
| 麂皮 | 家用商店 | ||
| 打孔器，1.5 mm | Stubai, Austria | 可由其他公司同类产品替代 | |
| 变性乙醇 | Donauchem, Austria | 可由其他公司同类产品替代 | |
| 丙酮 | Roth, Germany | 9372.5 | 注意！ |
| 高压冷冻机 HPM 010 | BalTec, CH；现为 Leica Microsystems | HPM010 | 已停产，由 LeicaEM HPM100 替代 |
| 体视显微镜 | Olympus, Japan | SZX10 | |
| 液氮 | 注意！ | ||
| 冷冻管 | Roth, Germany | E309.1 | 可由其他公司同类产品替代 |
| CryoCane | Nalge Nunc International,USA | 5015-0001 | 可由其他公司同类产品替代 |
| CryoSleeve | Nalge Nunc International,USA | 5016-0001 | 可由其他公司同类产品替代 |
| 液氮储存罐 | Cryopal, France | GT38 | 可由其他公司同类产品替代 |
| 非离子型去污剂（Lavocid） | Werner & Mertz Professional, Germany | ||
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 冷冻断裂与复型 | |||
| 喷砂机，Mikromat 200-1 | JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany | SANDURET 2-K | 可由其他公司同类产品替代 |
| 碳化硅 SIC 360，粒径 25 - 21µ | JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany | 955932 | |
| 冷冻断裂系统 BAF 060 | BalTec, CH；现为 Leica Microsystems | BAF060 | |
| 陶瓷 12 孔板 | Gröpel, Austria | 14511 | 可由其他公司同类产品替代 |
| Trizma 碱 | SIGMA, USA | T1503 | 可由其他公司同类产品替代 |
| Trizma 盐酸盐 | SIGMA, USA | T3253 | 可由其他公司同类产品替代 |
| 氯化钠 | Merck, Germany | 1,064,041,000 | 可由其他公司同类产品替代 |
| SDS，十二烷基硫酸钠 | Roth, Germany | 5136.1 | 注意！； 可由其他公司同类产品替代 |
| 蔗糖 | Merck, Germany | 1,076,871,000 | 可由其他公司同类产品替代 |
| TRIS | Roth, Germany | 5429.3 | 可由其他公司同类产品替代 |
| 通用杂交炉 | Binder, Germany | 7001-0050 | 可由其他公司同类产品替代 |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 免疫标记 | |||
| BSA | SIGMA, USA | A9647 | 可由其他公司同类产品替代 |
| 抗-GFP 抗体 | Molecular Probes, USA | A11122 | |
| 抗-泛AMPA受体抗体 | Frontier Institute, Japan | pan AMPAR-GP-Af580-1 | |
| 抗-NMDAR1 抗体，克隆号 54.1 | Merck Millipore, Germany | MAB363 | |
| 阿片受体-μ（MOR）抗体 | ImmunoStar, USA | 24216 | |
| 电镜用山羊抗豚鼠二抗，5 nm | BBInternational, UK | EM.GAG5 | |
| 电镜用山羊抗兔二抗，15 nm | BBInternational, UK | EM.GAR15 | |
| 驴抗兔二抗，10 nm | AURION, Netherlands | DAR 10nm | |
| 铜网，100 目平行条纹 | Agar scientific, UK | G2012C | |
| 培养箱 | Major Science, USA | MO-RC | 可由其他公司同类产品替代 |
| 火棉胶粉末 | Agar scientific, UK | R1275 | |
| 氯仿 | Roth, Germany | 3313.1 | 注意！； 可由其他公司同类产品替代 |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 电镜分析 | |||
| Philips CM120 透射电镜 | Philips/FEI | ||
| Morada CCD 相机 | Soft Imaging Systems, Germany | ||
| iTEM Ver. 5.2 图像软件 | Soft Imaging Systems, Germany |
参考文献
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