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Kombinierte optogenetische und Gefrierbruch Replica Immunmarkierung Eingang spezifische Anordnung der Glutamate Receptors in der Maus Amygdala zu untersuchen

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DOI:

10.3791/53853

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15. April 2016

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1Department of Pharmacology, Medical University of Innsbruck, 2Hertie Institute for Clinical Brain Research and Centre for Integrative Neuroscience, University of Tübingen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel zeigt, wie die Expression von Neurotransmitterrezeptoren quantifiziert und das Muster an Synapsen mit identifizierten prä- und postsynaptischen Elementen analysiert werden kann, indem eine Kombination aus viraler Transduktion optogenetischer Werkzeuge und der Freeze-Fracture-Replica-Immunmarkierungstechnik verwendet wird.

Zusammenfassung

Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie hat seit über 40 Jahren eine wichtige Technik in Ultrastrukturforschung gewesen. das Fehlen einer wirksamen Mittel jedoch die molekulare Zusammensetzung von Membranen zu studieren erzeugt einen deutlichen Rückgang in ihrer Nutzung. Kürzlich hat es die Entwicklung wirksamer Weise eine große Wiederbelebung in Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie durch gewesen integrale Membranproteine ​​durch Immunogoldmarkierung offenbaren. Eines dieser Verfahren wird als Detergens-solubilisierten Gefrierbruch-Replica Immunmarkierung (FRIL) bekannt.

Die Kombination der FRIL-Technik mit Optogenetik ermöglicht eine korrelierte Analyse der strukturellen und funktionellen Eigenschaften der zentralen Synapsen. Mit diesem Ansatz ist es möglich, sowohl prä- und postsynaptischen Neuronen, die durch ihre jeweiligen Expression eines markierten Kanalrhodopsin und spezifische molekulare Marker zu identifizieren und zu charakterisieren. Das unverwechselbare Erscheinungsbild der postsynaptischen Membran Spezialisierung der glutamaterge Synapsen ermöglicht es ferner, auf die Kennzeichnung von ionotropen Glutamatrezeptoren, zu quantifizieren und die intrasynaptischen Verteilung dieser Rezeptoren zu analysieren. Hier geben wir einen Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Verfahren erforderlich paired Repliken vorzubereiten und wie sie zu immunolabel. Wir werden auch die Einschränkungen und Einschränkungen der FRIL Technik diskutieren, insbesondere solche mit Vorspannungen Potential Abtastung zugeordnet ist. Die hohe Reproduzierbarkeit und Vielseitigkeit der FRIL-Technik, wenn sie mit Optogenetik kombiniert wird, bietet einen sehr leistungsfähigen Ansatz zur Charakterisierung der verschiedenen Aspekte der synaptischen Transmission bei identifiziert neuronaler Schaltkreise im Gehirn.

Hier haben wir ein Beispiel geben, wie dieser Ansatz wurde verwendet, Einblicke in Struktur-Funktionsbeziehungen von exzitatorischen Synapsen an Neuronen der interkalierten Zellmassen der Maus Amygdala zu gewinnen. Insbesondere haben wir die Expression von ionotropen Glutamatrezeptoren an identifizierten Eingaben untersucht oderiginated vom Thalamus hinteren intralaminären und medialen geniculate Kerne. Diese Synapsen wurde gezeigt, dass sensorische Informationen, die für Angst Lernen Relais und plastischen Veränderungen auf Angstkonditionierung zu unterziehen.

Einleitung

Die Definition der funktionalen Architektur von Biomembranen in Nanometer-Bereich ist in den letzten Jahren durch die Entwicklung einer Anzahl von Techniken, Immunmarkierung geeignet für die Transmissionselektronenmikroskopie in Frage gestellt. Allerdings sind diese Techniken, beispielsweise vor und nach dem Einbetten Immunogold, haben eine Reihe von wichtigen Beschränkungen, die eine schlechte Erkennung von Antigenen und / oder begrenzte quantitative Beurteilung der membrangebundene Proteine ​​umfassen. Diese Einschränkungen werden besonders kritisch bei der Untersuchung der Feinstruktur des Nervensystems, die durch einen hohen Grad an Zell Vielfalt und Synapse Heterogenität gekennzeichnet ist. Diese Heterogenität resultiert sowohl aus strukturellen und funktionellen Vielfalt diktiert durch die prä- und postsynaptischen Elemente und durch die differentielle Expression, Anreicherung oder Interaktion von Signalproteinen, wie Rezeptoren, Transporteure und Effektormoleküle.

Ein neuer Ansatz für die direkte immunolabeling von integralen oder vernetzten Membranproteinen in Detergens-solubilisierten Gefrierbruch - Replikate (FRIL) wurde ursprünglich vor 1 von Fujimoto zwei Jahrzehnten eingeführt. Diese ursprüngliche Verfahren hatte jedoch mehrere Einschränkungen, dh starke Fragmentierung von Repliken, die mit individuell zugeordneten Zellen in komplexen Geweben sinnvolle Korrelationen von markierten Molekülen behindert wie das Gehirn. Vor ungefähr 10 Jahren, Shigemoto und Fukazawa verbessert schrittweise die Technik 2. Dies wurde an den Boulder Laboratorien der Colorado State University durch die Bemühungen von einer anderen Gruppe von Wissenschaftlern parallel, der auch deutlich die Technik verbessert, insbesondere für die Untersuchung von gap junctions 3.

Die Verbesserung der Gefrier-Fracturing-Protokolle und Maschinen, sowie die Einführung von Schnellgefrieren (unter hohem Druck), erlaubt es nun Ermittler ungebrochene Repliken von Exemplaren der relativ großen Größe zu erzeugen, und hallogh hochwertige Bilder der meisten zellulären Komponenten ohne die Einschränkungen und Artefakte, die durch starke chemische Fixierungen hergestellt.

Die FRIL Technik bietet den großen Vorteil einer sehr quantitative in - situ - Identifizierung von einem oder mehreren Proteinen (gleichzeitig) in histologisch kartiert und zytologisch identifizierten Zellen in komplexen Geweben, wie dem Gehirn, mit dem zusätzlichen Vorteil einer Draufsicht auf prä- und postsynaptischen Elemente in einem einzigen Replik. Daher ist der FRIL-Technik trotz seiner vielen technischen Hürden, hält das Versprechen für eine Reihe von sehr bedeutenden wissenschaftlichen Durchbruch, insbesondere zur Korrelation der strukturellen und funktionellen Eigenschaften der einzelnen Synapsen. Während der letzten Jahrzehnte hat sich eine große Menge an Informationen wurden auf die Struktur erhalten, molekularen Aufbau und physiologische Funktion von Synapsen; noch Synapsen sind morphologisch und molekular sehr unterschiedlich in Abhängigkeit von der Vor- und postsynaptischen pamieten Neuronen 4. Nur für eine Handvoll Synapse Typen waren Struktur-Funktions - Studien bisher 5-7 erreicht. Dies war vor allem auf technische Zwänge, die eine genaue Identifizierung der Art der prä-und postsynaptischen Elemente verhindert.

Ultrastrukturelle Analyse über verschiedene synaptische Kontakte sowohl in Bezug auf die synaptische Größe und Inhalt in Neurotransmitterrezeptoren 6, kritische Einblicke in die Variabilität der postsynaptischen Membran Spezialisierungen vorgesehen , die einen großen Einfluss auf die Festigkeit und Plastizität der synaptischen Transmission aufweist. Weiterhin gibt eine große Anzahl von Studien , dass die Anzahl von ionotropen Glutamat - Rezeptoren auf verschiedenen Arten von Synapse ausgedrückt in einem afferent- und zielabhängig 7-10 reguliert wird.

Hier wird ein Verfahren erläutert, dass die Analyse der Struktur und der Rezeptor Zusammensetzung der postsynaptischen Membran Spezialisierungen ermöglicht mit definierend präsynaptischen Elemente und Funktion. Dieser Ansatz nutzt den Vorteil der präsynaptischen Expression kürzlich lichtempfindlichen Algenproteine, wie Channelrhodopsin2 (ChR2), entwickelt, und der FRIL-Technik das Muster der postsynaptischen Expression von α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic zu analysieren Säure (AMPA-Rs) und N-Methyl-D-Aspartat (NMDA-Rs) Glutamatrezeptoren. Dies wird an den Synapsen nachgewiesen durch Axone gebildet Ursprung aus den hinteren Thalamus medialen geniculate Kerne (PIN / MGn) auf Neuronen der Einlagerungen Zellmassen der Amygdala (ITC). ITC Neuronen sind kleine GABAergen Zellen stachelig in Cluster 11 rund um die basolaterale Amygdala - Komplex (BLA) organisiert, 12. ITC Neuronen sind dafür bekannt, exzitatorischen Eingänge von BLA Haupt Neuronen empfangen und den zentralen Kern (CEA) zu zielen, also als hemmender Gate funktioniert für den Informationsfluss zwischen dem BLA und CeA 12-15.

Vor kurzem haben wir gezeigt, dass ITC Neuronen befindet sich in der medio-dorsale Cluster zwischen BLA und CeA erhalten auch direkte und konvergente erregenden Eingänge von sensorischen Thalamus und zeitlichen kortikalen Regionen, die so modifiziert sind auf Angst während Pavlovian auditorischen Angstkonditionierung 16 zu lernen. Angst Anlage ist eine der am besten verstanden, Formen des assoziativen Lernens in Bezug auf die Mechanismen des Gehirns. In Angstkonditionierung, einem zunächst neutral konditionierten Reiz (CS, zum Beispiel ein Ton) mit einem aversiven unkonditionierten Stimulus (US, zum Beispiel ein mildes Fuß - Schock) , was zu einem CS-US - Verband gepaart und Angstreaktion 17 konditioniert, 18. Erregende Eingänge von beiden Thalamus und Neokortex Bereiche, die Information , die die CS und US tragen, wurden jeweils bekannt auf pyramidalen Neuronen des lateralen Kern der Amygdala (LA) zu konvergieren und 19 Plastizität zu unterziehen. Unsere früheren Arbeiten zeigten, dass sensorische Informationen auch an ITC Neuronen weitergegeben parallel ist 16.

Als ein erster Schritt zu einer mechanistischen molekulare Analyse der einzelnen sensorischen Input auf ITC Neuronen Synapsen, verwendeten wir ein Adeno-assoziierten Virus (AAV) ChR2 mit dem gelben fluoreszierenden Protein (YFP) markiert auszudrücken. Die AAV wurde in die PIN / MGn injiziert und die Axonterminalen wurden durch ihre Expression von ChR2-YFP identifiziert. Wir haben beide von der FRIL-Technik erzeugt Flächen, die die Dichte der postsynaptischen AMPA-Rs und NMDA-Rs an Synapsen mit ITC Neuronen, die durch PIN / MGn Axonterminalen gebildet zu beurteilen.

Protokoll

Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden vom Regierungspräsidium Tübingen, Bundesland Baden-Württemberg, Deutschland, und von der Österreichischen Tierversuche Ethikrat und wurden in Übereinstimmung mit der EU-Richtlinie über die Verwendung von Tieren in der Forschung genehmigt.

1. Stereotaktische Injektionen von AAV-Channelrhodopsin2-YFP

HINWEIS: Stereotactic Injektionen wurden nach durchgeführt zu einem zuvor veröffentlichten Protokoll 20.

  1. Bereiten Sie sterile Werkzeuge, indem sie bei 180 ° C für 1,5 Stunden erhitzt.
  2. Ziehen Sie scharf (~ 50 & mgr; m Durchmesser) Glaspipetten für Injektionen eine horizontale Mikroelektroden-Abzieher-Set mit den folgenden Parametern: Wärme = Rampenwert - 20, Pull = 0, Geschwindigkeit = 100, Time = 200, Druck = 200.
    HINWEIS: Rampenwert muss für jede Menge gekauft Glaspipetten bestimmt werden gemäß den Anweisungen von der Mikropipette Abzieher Hersteller zur Verfügung gestellt.
  3. Premix 1 ul Viruslösung und 0,2 ul 0,1% Fast Green-Lösung (für eine bessere Sichtbarkeit der Lösung in der Glaspipette) in sterile Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS; 25 mM, 0,9% NaCl, pH 7,4). Füllen Sie die Glaspipette mit einer 10 & mgr; l-Pipette und Gel-fil Tipps. Für das virale Konstrukt verwenden rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (Serotyp 2/9).
  4. Anesthetize Maus ein kleines Tier Anästhesiegerät (3% Isofluran in Sauerstoff für Induktion) verwendet wird. Benutzen. Für diese Studie verwenden 3 Wildtyp-Mäusen im Alter von ~ 6 Wochen.
  5. Shave Kopf zwischen den Ohren und Augen und desinfizieren mit einem PVP-Jod-basierte Lösung.
  6. Tragen Sie eine Augensalbe zum Austrocknen der Augen während der Narkose zu verhindern. Subkutan injizieren Maus mit analgetischen (Meloxicam-basierte, 0,1 ml einer 5 mg / ml Lösung).
  7. Bewegen Sie die Maus in stereotaktischen Rahmen und halten Anästhesie über eine Gasanästhesiegerät (2% Isofluran in Sauerstoff für die Wartung). Überprüfen Narkose Tiefe durch das Fehlen eines Gliedes RückzugReflex, bevor Sie fortfahren.
  8. Pflegen sterilen Bedingungen so gut wie möglich während des gesamten chirurgischen Eingriffs. Tragen Sie eine Einweg-Gesichtsmaske, einen OP-Kittel und Handschuhe.
  9. Machen Sie einen Hautschnitt von ca. 1 cm auf der Oberseite des Kopfes mit einer Schere 20. Ziehen Sie die Haut an der Seite stumpfen Pinzette, fix mit Klammern Schädeloberfläche und sauber Schädel mit H 2 O 2 zu belichten.
  10. Mark Injektionsstellen auf dem Schädel eine feine Spitze Permanentmarker verwenden. Bohren Sie ein kleines Loch (ca. 1 mm Durchmesser) in den Schädel an der markierten Stelle. Für einseitige PIN / MGn Injektion in diesem Gestüt, verwenden Sie die folgenden Koordinaten: von Bregma (mm): posterior 3,0, lateral ± 1,8, ventralen 3.8.
  11. Berg gefüllt Glaspipette auf stereotaktischen Rahmen verbunden mit einer Druckeinspritzvorrichtung und bringen die Pipettenposition Bregma.
  12. Brechen Sie die Spitze der Glaspipette mit feiner gerader Spitze Pinzette. Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze ist offen von applyinga wenige Druckimpulse und die Beobachtung der Extrusion von Tropfen Virus-Lösung.
  13. Gehen Sie zu den gewünschten Injektions Koordinaten und injizieren die Hälfte der Pipetteninhalt (~ 0,5 ul) mit den folgenden Einstellungen auf der Druckinjektionsvorrichtung: Druck 20 psi, mittlere Pulslänge 30 ms, die durchschnittliche Anzahl von Impulsen 50.
  14. Lassen Sie Pipette in Platz für ca. 1 min, bevor sie langsam (1 mm / min) zurückgezogen wird es.
  15. Saubere Schädel mit PBS (pH 7,4) und Klemmen entfernen. Ziehen Sie die Haut zusammen, und vernähen den Einschnitt (3-4 Knoten). Desinfektionsmittel anwenden (Povidon-Iod bezogen) um die Wunde.
  16. Stoppen Sie die Anästhesie und lassen die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis sie vollständig wach. Halten Mäuse einzeln untergebracht. Postoperativ weiterhin um den Gesundheitszustand zu überwachen; ggf. verabreichen Analgetikum.
  17. Halten Sie Tiere für 4 Wochen vor dem Gehirn Fixierung auf ein angemessenes Maß an viralen Expression gewährleisten.

2. Probenvorbereitung

  1. Gehirn - Fixierung </ Strong>
    1. Herstellung des Fixiermittels
      1. Für 1 l Fixiermittel, 10 g Paraformaldehyd wiegen und fügen Sie ihn in 300 ml entsalztem H 2 O. Hitze auf 55-60 ° C für ~ 10 min unter ständigem Rühren.
      2. Schalten Sie die Hitze und fügen Sie 7 - 8 Tropfen 4 N NaOH. Die Lösung sollte klar in ~ 10 min werden.
      3. Lassen Sie es auf RT abkühlen, 150 ml einer gesättigten Lösung von Pikrinsäure hinzufügen und bringen es auf 500 ml mit entionisiertem H 2 O
      4. Hinzufügen 500 ml 0,2 M Phosphatpuffer (PB). Filter mit Filterpapier. PH-Wert auf 7,4 mit NaOH.
      5. Kühlen Sie die Fixiermittel bis 6 ºC, lagern Sie es in dunklen Glasflaschen für nicht mehr als einen Tag lang bei 6 ºC.
    2. Transcardiac Perfusion
      1. Anästhesieren Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Thiopental (120 mg / kg Körpergewicht). Stellen Sie sicher, dass das Tier tief durch Überprüfung des Pedals Rückzug refl narkotisiertex, die abwesend sein sollte. Legen Sie das Tier auf dem Rücken auf einer Perfusions-Tabelle mit den vier Extremitäten gebunden.
      2. Öffnen Sie die Bauchwand in Längsrichtung mit stumpfen Enden Schere und machen zwei zusätzliche Schnitte seitlich entlang der kaudalen Rand des Brustkorbs, um die Membran aus. Schneiden Sie die Membran entfernt und schneiden Sie die Brustwand an der osteocartilageneous Grenze auf beiden Seiten. Heben Sie das Schwanzende des zentralen Platte von Brustwand des Brustbeins mit dem Herz zu belichten.
      3. Entfernen Sie die Herzbeutel, machen einen kleinen präzisen Schnitt in der Spitze des linken Ventrikels die Kanüle der Perfusionsgerät zugeben. Verwenden Sie einen stumpfen Kanüle mit einem Innendurchmesser von 0,6 mm. Übergeben Sie die Kanüle sanft durch die Ventrikel, bis die Spitze die aufsteigende Aorta erscheint in und sichern Sie die Kanüle mit einer Klemme. Um das Blut und perfusates, um aus dem Blutstrom zu ermöglichen, einen Schnitt im rechten Vorhof machen.
      4. Perfuse Mäusen transkardial einer peristaltischen Pumpe mit einer Fließgeschwindigkeitvon 5 ml / min zunächst mit PBS (25 mM, 0,9% NaCl, pH 7,4) für etwa 1 min, gefolgt von eisgekühltem Fixiermittel für 7 min.
      5. mit der Maus den Kopf mit einer Schere Nach der Fixierung durchtrennen und dann schneiden Sie die Haut durch die Mittellinie vom Hals bis zur Nase. Entfernen Sie den Muskel vollständig den Schädel freizulegen.
      6. Mit einer scharfen Schere, machen einen Längsschnitt durch den Hinterhaupts und interparietal Knochen aus dem Foramen magnum beginnen. Mit einer feinen Pinzette diese Knochen entfernen Sie das ganze Kleinhirns zu belichten. Dann machen Sie einen weiteren Längsschnitt durch die parietalen und frontalen Knochen bis zum Nasenbein und entfernen Sie sie mit einer Pinzette das ganze Gehirn aufzudecken.
      7. Spachtel Mit dem Gehirn zu entfernen, ohne es zu beschädigen, und es in eiskaltem 0,1 M PB schalten.
  2. Sectioning und Beschneiden der Proben
    1. Schneiden Sie einen koronalen Block von ca. 5 - 6 mm mit Rasierklingen den Bereich von Interesse enthält. Kleben Sie es auf den Inhaberdie vibroslicer mit einem Sekundenkleber. Richten Sie den Gewebeblock, so dass der Neokortex die vibrierender Klinge zugewandt ist. Scheibe Koronalschnitte, enthält die Amygdala, bei 140 & mgr; m mit dem vibroslicer (1A) in eiskaltem 0,1 M PB, und sammeln sie in einem 6-Well - Platte in dem gleichen Puffer.
    2. Unter einem Stereomikroskop, um die Region von Interesse trimmen (hier die medio-dorsale paracapsular Cluster in der ITC, siehe Abbildung 1B) von der Scheibe. Dies geschieht in einer Petrischale, beschichtet mit Silikonelastomer und gefüllt mit 0,1 M PB, eine ophthalmische Skalpell. Stellen Sie sicher , dass die zugeschnittenen Blöcke in das Loch des Abstandshalters passen (ca. 1,5 mm) (1B).
    3. Verschieben Sie die getrimmten Blöcke in Kryokonservierung-Lösung (30% Glycerin in 0,1 M PB) O / N bei 6 ºC.

3. Hochdruck Freezing

HINWEIS: Die FRIL besteht aus 6 wesentlichen Schritte (Abbildung 2): 1) Schockgefrieren mit hohem Druck (bei 2.300 - 2.600 bar) der Probe. 2) Fracturing der Probe. Die Bruchebene folgt im allgemeinen den zentralen hydrophoben Kern von gefrorenen Membranen, um sie in zwei Halbmembran Blättchen Aufspalten: eine Hälfte, die dem Plasma (P-face) benachbart liegt und eine Hälfte, die an die extrazelluläre oder exoplasmic Raum benachbart liegt (E- Gesicht). 3) Die Replikation der Probe durch Vakuum-Abscheidung von Platin und Kohlenstoff. 4) Detergent-Verdauung des Gewebes. 5) Immunogoldmarkierung. 6) Analyse der Nachbildung ein Transmissionselektronenmikroskop.

  1. Herstellung von Kupferträger
    ANMERKUNG: Um durch die aufeinanderfolgenden Stufen des FRIL Verfahren behandelt werden, müssen Proben auf Metall (Gold oder Kupfer) Träger montiert. Diese Träger variieren in Größe und Form entsprechend dem Modus des Brechens und der Art der Maschinen. Hier verwendeten wir Kupferträger (1B, E) und einem aufklappbaren "double Nachbildungstabelle"; (siehe Abbildung 3B), die beim Öffnen einen Zug - Bruch durch die gefrorene Probe erzeugt (Abbildung 2). Dies ermöglicht es, beide Seiten der gebrochenen Probe zu erhalten und zu replizieren.
    1. Polnischen Kupferträger mit Beschlägen Entferner ein Blatt Gämse Haut verwenden.
    2. Platz Träger in einem Glastopf und sauber zweimal mit einem nicht-ionischen Detergens (pH ~ 1,5) in einem Beschallen Wasserbad, dann waschen Sie ausgiebig in Leitungswasser, gefolgt von entsalztem Wasser und dann spülen zweimal mit Ethanol.
    3. Beschallen die Kupferträger in Aceton für 15 min.
    4. Legen Sie die Träger auf Filterpapier trocknen.
    5. Bringen Sie einen Ring von doppelseitigen Klebeband auf einen Kupferträger (1C), die als die Halte gut für den getrimmten Block (Halteträger) dienen.
  2. Das Einfrieren der Probe
    HINWEIS: Die beim Umgang mit flüssigem Stickstoff mit Sorgfalt und tragen eine geeignete Schutzbrille.
    1. Schalten Sie den Hochdruck freiZing Einheit (1F) mindestens 1,5 Stunden vor dem Muster Einfrieren beginnen.
    2. Starten Sie Heizung durch die "LUFTERHITZER" Taste drücken, und backen Sie heraus für 50 min. Eingestellt Lufttemperatur auf 80 ° C.
    3. Schließen Sie den Stickstofftank an der Hochdruckgefriereinheit und drücken Sie die "nitrogen", um das Innere Dewar mit flüssigem Stickstoff zu füllen. Die "nitrogen LEVEL" leuchtet. Starten Kühlung durch die "Kühlung" Taste drücken.
    4. Drücken Sie die "DRIVE IN" Taste, wenn die "nitrogen LEVEL" erlischt. Überprüfen Sie, ob das Hydrauliksystem den Kolben hin und her 3-mal bewegt.
    5. Drücken Sie die Taste "AUTO" und die "nitrogen" -Taste. Sobald "READY" leuchtet, ist der Hochdruckgefriereinheit für Hochdruck-Gefrieren bereit.
    6. Platzieren eines getrimmten Block in das Loch des doppelseitigen Klebebandes (1B) unter Verwendung eines Platindrahtschleife , die in ag geschmolzen wurdelass Pipette.
    7. Entfernen Sie den Überschuss der Cryoschutzstofflösung mit Filterpapier oder einer Bürste.
      Hinweis: Dieses Verfahren ist auch wichtig, um Luftblasen zu entfernen, um das Gewebe bilden können und die Verzerrung der Gewebeform und / oder Ultrastruktur führen könnte.
    8. Unter einem Stereomikroskop, decken den Halteträger mit einem anderen Träger, so daß der Gewebeblock zwischen den beiden Trägern angeordnet ist.
    9. Setzen Sie den Träger-Sandwich in den Probenhalter des Hochdruckgefriereinheit (1D). Setzen Sie den Probenhalter in den Hochdruckgefriereinheit (Spitze nach unten) und befestigen Sie ihn in den Probenhalter durch Verschrauben.
    10. Starten Sie den Gefrierzyklus durch die "Jet-Auto" -Taste drücken. Arbeiten so schnell wie möglich, entfernen Sie den Probenhalter und versenken die Spitze mit flüssigem Stickstoff in einem isolierten Kasten. Tauchen Sie die Spitzen von zwei Zangenpaaren in den flüssigen Stickstoff, um sie abzukühlen.
    11. Entfernen Sie vorsichtig the Carrier-Sandwich aus dem Probenhalter und legen Sie sie in ein vorgekühltes Cryovial. Stellen Sie sicher, dass die Träger nur mit flüssigem Stickstoff gekühlten Zange behandelt werden. Kryoröhrchen sollte der Stickstoff strömt aus dem Fläschchen (1G) zu ermöglichen , perforiert werden.
    12. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.6 bis 3.2.11, bis alle gewünschten Proben eingefroren wurden. Mehrfachträger-Sandwiches die gleiche Art der Probe enthalten, können in der gleichen Phiole gelagert werden.
    13. Bewahren Sie die Kryovials die Träger in einem Kryotank , bis die Replikation (Abbildung 1H) enthält.

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Abbildung 1. Gewebepräparation und Hochdruck - Freezing. (A) Vibroslicer Abschnitt verwendet , um das Gewebe.   (B) Eine resultierende koronalen Mausgehirn Abschnitt die Amygdala gezeigt nebeneinander mit AC enthältopper Träger mit einem Ring von doppelseitigen Klebeband versehen. Die gestrichelte Box zeigt den Bereich von Interesse, dass die mediale paracapsular Cluster des ITC enthält. Der Durchmesser des Lochs in dem doppelseitigen Klebeband beträgt etwa 1,5 mm. (C) Werkzeuge zur Herstellung von Kupferträger. Von oben links im Uhrzeigersinn: doppelseitiges Klebeband, Pinzette, Puncher, Kupfer Träger, und eine Schere. (D) Einsetzen des Träger-Sandwich in den Probenhalter für Hochdruck - Gefrieren. Der Träger-Sandwich wird in die Öffnung des Probenhalters angeordnet. (E) Kupferträger ohne und mit einem Ring von doppelseitigen Klebeband und der "Träger-Sandwich".   (F) Hochdruckgefriereinheit mit unter Druck stehenden Behälter mit flüssigem Stickstoff , um es füttern. (G) A Cryovial die gefrorenen Gewebe auf Lager. Beachten Sie die Löcher in der oberen Mittelposition des Fläschchens ermöglicht Stickstoffgas aus dem Fläschchen (Pfeilspitze) zu fließen. (H) Kryotank das gefrorene Gewebe zu speichern. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

4. Gefrierbruch und Replikation

  1. Herstellung der Elektronenstrahlkanonen
    1. Vor dem Einsetzen der Elektronenstrahlkanonen, entfernen Sie das Schild mit dem "Leitblech". Setzen Sie die "Einstellehre" zur Zentrierung des Fadens in die Spannzange durch die untere Kathodenabdeckung.
      HINWEIS: Der größere Durchmesser Ende der Einstellehre ist für die Kohlenstoffpistole verwendet, während das Ende mit kleinerem Durchmesser für die Platin-gun ist.
    2. Schieben Sie den neuen Faden über die Lehre, bis "der Druckplättchen" können die Enden des Fadens klemmen, um sicherzustellen, dass die Glühwendel nicht in einem Winkel liegt.
    3. Entfernen Sie die Einstellehre und legen Sie die Kohlestab. Fix it durch die Co Anziehenllet chuck des Verdampfers Stangenhalters, so dass die Höhe des Endes der Stange in der Mitte der zweiten Spule von der Unterseite ist. Für die Platin gun, sollte die Höhe des Endes des Platinstab in der Mitte der zweiten Glühwendel von oben sein.
    4. Ersetzen Sie die Ablenkplatte und legen Sie mit Gewehren in die Gefrierbrucheinheit. Reinigen Sie die Geschütze mit einem Sand-Blaster nach Gebrauch.

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Abbildung 2. Darstellung der wichtigsten Schritte der FRIL - Technik.
Überblick über die verschiedenen Schritte zur Herstellung und Analyse von Replikat erforderlich. (1) Hochdruck-Gefrieren von Gewebe. (2) Fracturing. Während des gefrorenen Gewebes Fracturing wird die Lipiddoppelschicht der Plasmamembran in zwei Hälften an der hydrophoben Grenzfläche. Proteine, die in der Plasmamembran zugeordnet sind entweder auf dem exoplasmic (E-face) oder protoplasmic Membranen (P-face). (3) Die Replikation. Die Verdampfung von Kohlenstoff (C) auffängt Lipide und Proteine ​​auf der Oberfläche des gebrochenen Gewebes. Das Material wird mit 2 nm Platin / Kohlenstoff beschichtet bei einem 60 ° -Winkel Abschattung und dann mit einer weiteren 15 nm Kohlenstoffschicht, welche die Struktur der Replik (C-Schicht, Pt-Shadowing) stärkt. (4) Solubilisierung. Das Gewebe nicht durch die Replik Membran eingeschlossen wird dann mit SDS-Lösung in Lösung gebracht. (5) Labeling. Proteine ​​von Interesse können auf Replik sichtbar gemacht werden mit Hilfe eines komplexen aus spezifischen primären Antikörpern (Primary Ab) und Sekundärantikörper (Secondary Ab), konjugiert mit einem Goldpartikel (Au). Die Verwendung unterschiedlicher Größen von Goldpartikeln ermöglicht den Nachweis von mehr als einem Protein auf der gleichen Replik. (6) Nach der Immunmarkierung, Repliken werden auf Kupfermaschengittern gesammelt und mit einem Transmissionselektronenmikroskop bei 80 analysiert -. 100 kV Bitte click hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Stellen Sie das Gerät von Gefrierbruch
    1. Schalten Sie das Gefrierbrucheinheit (3A) durch NETZ zu 1. Für eine detaillierte Beschreibung der Gefrierbruch und Replikationsverfahren Drehen, siehe Betriebsanleitung des Herstellers.
    2. Vor dem Abkühlen des Gefrierbruch-Vorrichtung, backen das gesamte Kühlsystem des Gerätes mit Warmluft aus. Drücken Sie die "auftauen" -Taste in der MTC 010 - Gerät (Temperatursteuerungseinheit) (3A) und lassen Sie den Auflauf aus Prozessdurchlauf für 45 min.
    3. Aktivieren Sie die Vakuumstation. Die Gefrierbrucheinheit arbeitet in der Regel in einem Vakuumbereich von ~ 10 -6 - 10 -7 mbar.
    4. Füllen Stickstofftank und schließen Sie es an der Gefrierbrucheinheit. Überprüfen Sie, ob der Ventilhalter trocken und sauber ist auch die Eingabe des Tanks vor dem Einsetzen des Ventilhalters (Feuchtigkeit kann stören VACUUm und Anzeige von N 2 Befüllung des Tanks).
    5. Beginnen Kühlung durch die Temperatur auf -115 ° C einstellen. Die Kühlung dauert etwa 45 min.
    6. Legen Sie die Elektronenstrahlkanonen und stellen Strom und Spannung die folgenden Parameter für die Verdampfung zu erreichen:
      Carbon-Pistole: Drehung auf, Position 90 °, Geschwindigkeit der Kohlenstoffansammlung 0.1 - 0.2 nm / s
      Kohlenstoff-Platin-Pistole: Drehung ab, Position 60 °, Akkumulationsrate von 0,06 bis 0,1 nm / s
      HINWEIS: Wenn eine Waffe zum ersten Mal nach dem Austausch des Kohlenstoff oder Platinstab, Entgasen für 3 Minuten vor dem Gebrauch verwendet wird.
  2. Fracturing und Replikation
    1. Legen Sie gefrorene Träger-Sandwiches in Doppel Replikattabelle sicherstellen, dass alle Manipulationen in flüssigem Stickstoff durchgeführt werden.
    2. Übertragen Doppel Replik Tisch zu einem Dewar-Gefäß und befestigen Sie es mit dem Probentisch Empfänger in einem Winkel von 45 °. Der flüssige Stickstoff Ebene sollte immer über dem Doppel Replik Tabelle sein.
    3. Suchen Sie sich die Doppel-Replik-Tabelle mit dem Tabellen Manipulator und legen Sie sie in die Gefrierbrucheinheit auf dem kalten Stadium. Wartezeit von ca. 20 min die Temperatur des Doppelnachbildungstabelle zu ermöglichen, bis -115 ° C einzustellen.
    4. Überprüfen Sie, ob das Vakuum unter 10 -6 mbar und die Temperatur -115 ° C.
    5. Bruch des Gewebes durch manuelle Drehung gegen den Uhrzeigersinn des Rads an der Haube über dem Doppel replica Tisch verbunden ist. Wenn die Verkleidung dreht, zwingt es die doppelte Replik Tabelle zu öffnen, um das Gewebe zu brechen.
    6. Drücken Sie die "Hochspannung" in der EVM 030 Gerät (Elektronenstrahlverdampfungssteuereinheit) der Gefrierbrucheinheit (3A).
    7. Replizieren der freiliegenden Oberflächen des gebrochenen Gewebes (3C) durch Verdampfung von Kohlenstoff (rotierend) mittels einer Elektronenstrahlkanone in einem 90 ° -Winkel zu einer Dicke von 5 nm positioniert, gefolgt von einer unidirektionalen shadoFlügel mit einer Platin-Kohlenstoff bei einem Winkel von 60º zu einer Dicke von 2 nm. Schließlich eine 15 nm dicke Schicht aus Kohlenstoff, der aus einem 90 ° Winkel (rotierend) gelten.
    8. Verwenden Sie die folgenden Parameter für die Verdunstung:
      1. Kohlenstoff: Drehung auf, Position 90 °; Geschwindigkeit 0,1 bis 0,2 nm / sec; 5 nm
      2. Kohlenstoff-Platin: Position 60 °; Geschwindigkeit von 0,06 bis 0,1 nm / sec; 2 nm
      3. Kohlenstoff: Drehung auf, Position 90 °; Geschwindigkeit von 0,3 bis 0,5 nm / s; 15 nm
    9. Entfernen Sie die replizierten Proben aus dem Gefrierbrucheinheit und sie auf einem keramischen 12-Well - Platte (4A) , gefüllt mit TBS (Tris - gepufferte Salzlösung, pH 7,4).
    10. Unter Verwendung einer Platinöse Gießwalzdraht, entfernen Sie das replizierte Gewebe aus dem Probenträger (4A).
    11. Wiederholen Sie die Schritte 4.3.1 bis 4.3.10, bis alle Proben repliziert wurden.

figure-protocol-3 r /> Abbildung 3. Die Gefriert Fracturing und Replikation.
(A) Das Gerät Gefrierbruch. Die Maschine enthält mehrere Steuergeräte und einen Monitor. Proben werden in die Kammer durch eine Öffnung auf der linken Seite der Kammer eingeführt. Ein unter Druck stehendes Flüssigstickstoffbehälter ist mit dem Gefrierbrucheinheit verbunden, um die Stufe zu kühlen. Bilder unten zeigen vergrößerte Ansichten von zwei der Einheiten (UPC 010 und MDC 010) und der Monitorparameter beim Verdampfen der zweiten Kohlenstoffschicht anzeigt.   (B) Eröffnet (links) und geschlossen (rechts) Blick auf die Doppel - Replik - Tabelle. Die "Carrier-Sandwiches" in die Schlitze der Tabelle eingefügt (durch Pfeile). Die Kleinwaffen verhindern "Träger-Sandwiches" aus während der Manipulation herausfallen. (C) A gebrochen und repliziert Probe. Replicas erscheinen als dünne schwarze Filme auf der Oberseite des gebrochenen Gewebes.53 / 53853fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. SDS-Verdauung der Replik
    1. Transfer Replik auf eine 4 ml-Glasfläschchen, gefüllt mit 1 ml SDS-Verdauungspuffer (2,5% Natriumlaurylsulfat, 20% Saccharose in 15 mM Tris, pH 8,3). Digest für 18 Stunden bei 80 ° C unter Schütteln (45 Hub / min).
    2. Transfer Repliken in ein neues Röhrchen gefüllt mit SDS-Verdauungspuffer und lagern bei RT.

5. Immunmarkierung

HINWEIS: Alle Inkubationen werden bei RT unter leichtem Schütteln durchgeführt, mit Ausnahme von Inkubationen mit Antikörpern.

  1. Waschen Sie die Replik für 10 Minuten in frischem SDS-Verdauungspuffer.
  2. Waschen Sie die Replik einmal mit 2,5% BSA (Rinderserumalbumin) in TBS für 5 min und dann 3 x 10 min mit 0,1% BSA in TBS.
  3. Block nicht-spezifische Bindungsstellen in TBS mit 5% BSA für 1 Std.
  4. Bewerben primären AntiKörper in 2% BSA-TBS verdünnt. Führen Inkubationen in einem 30 ul Tropfen (4B) in einer feuchten Kammer bei 15 ° C für 72 Stunden (4C).
    1. Für diese Studie Prozess sowohl Repliken aus dem gebrochenen Gewebe. Inkubieren einer Replik mit einem Meerschweinchen polyklonalen Antikörper gegen die Aminosäuren 717-754 des Maus-GluR1 gemeinsam für alle AMPA-R-Untereinheiten (Verdünnung: 1: 200) oder einem monoklonalen Maus-Antikörper gegen ein rekombinantes Fusionsprotein erhöht abdeckt Aminosäuren 660 - 811 der NR1-Untereinheit des NMDA-R (Verdünnung: 1: 500), und einem polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen das grün fluoreszierende Protein erhöht (Verdünnung: 1: 300).
    2. Inkubiere die andere Replik mit einem polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen ein synthetisches Peptid gerichtet entsprechenden Säuren 384 bis Aminosäure - 398 der Ratten-μ-Opioid-Rezeptor (Verdünnung: 1: 500).
  5. Waschen in TBS mit 0,05% BSA (3 x 5 min.).
  6. Bewerben Sekundärantikörper. Für diese Studie use Gold (5 nm für ionotrope Glutamatrezeptoren, 10 für μ-Opioid-Rezeptoren und / oder 15 nm für ChR2-YFP) konjugierten Antikörper verdünnt in TBS mit 2% BSA. Verdünnen Sekundärantikörper 01.30 und Inkubation in einem 30 ul Tropfen bei 15 ° CO / N.
  7. Waschen 3 x 5 min in 0,05% BSA-TBS bei RT.
  8. Waschen 2 x 5 min in Reinstwasser.
  9. Berg Replik auf Formvar beschichtetes 100-Linie , die parallel bar Gitter (4D).

6. Replica Analyse

  1. Bild Repliken mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) bei 80 oder 100 kV. Erwerben Sie digitale Bilder durch eine CCD (charged coupled device) Kamera.
  2. Offline finden Regionen auf die Bilder von beiden Repliken entsprechenden Verwendung Sehenswürdigkeiten (4E). Analysieren digitalen Bild J. Bestimmen postsynaptischen Bereich und die Anzahl der Immunogold-markierten Teilchen gegen den Rezeptor analysiert.

figure-protocol-4
Abbildung 4. Immunmarkierung von Replica.
(A) Werkzeuge zum Bearbeiten und Waschen der Repliken. Ein Keramik-12-Well-Platte (oben rechts) und 2 Arten von Glaspipetten (oben links). Die Glaspipette mit runder Spitze (unten links) wird verwendet, Replik zu übertragen, und die Pipette mit Platinstab (unten Mitte) wird verwendet, Repliken zu entfalten. Eine Replik in Waschpuffer (unten rechts). (B) Immunmarkierung von Repliken in Tropfen durchgeführt (30 & mgr; l) , die auf einem kleinen Stück Parafilm in einer Vertiefung einer Gewebekultur 6-Well - Platte. Beachten Sie, dass eine Replik von einem Tropfen Puffer, der Antikörper bedeckt ist. Um zu verhindern, Verdampfung, einem angefeuchteten Stück Seidenpapier ist um den inneren Rand des Bohrlochs ausgestattet. (C) Inkubator für die Immunmarkierung Schritt. Inkubationen werden bei 15ºC durchgeführt. (D) Eine Replik montiert auf ein Formvar beschichteten 100-Linie parallel bar-Netz. (E) geringer Vergrößerung Mikroskopische Aufnahmen von einem Paar von Repliken. Die gepunkteten Quadrate zeigen drei typische Sehenswürdigkeiten einen Ort in den entsprechenden Repliken zu identifizieren. Maßstabsbalken: 10 & mgr; m. Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM gezeigt Bitte klicken hier , um eine größere Version dieser Figur.

Ergebnisse

Die FRIL Technik, wenn mit der Expression von optogenetische Aktoren mikrobiellen Ursprungs 21 kombiniert, das heißt, die Kanäle in der Plasmamembran integriert und wirksam anterograd entlang Axone transportiert, ermöglicht bei einer definierten Untergruppe quantitativ die postsynaptischen Expression von AMPA-Rs und NMDA-Rs zu prüfen , von Synapsen. Dies wird hier für Axone gezeigt aus verschiedenen Thalamuskernen Ursprung (zB PIN / MGn) auf ITC Neuronen in der Amygdala. Dieser Ansatz ermöglicht eine molekulare Analyse der einzelnen Sinnes Synapsen auf ITC Neuronen, einer Gruppe von Zellen, die bisher auf eine detaillierte anatomische und molekulare Charakterisierung refraktären waren.

Vier Wochen nach der stereotaktische Injektion des rAAV-ChR2-YFP in die PIN / MGN ChR2-YFP-positive Axone dicht auf den LA innervated, die amygdalostriatal Übergangsbereich (Astria) und die mediale paracapsular I TC - Cluster in der Amygdala, ein Muster vollständig im Einklang mit früheren Studien Tracing 16, 22. Wir haben auch intensiv Gold Immunmarkierung für die ChR2-YFP auf dem P-Gesicht von Axonen und Terminals in Gefrierbruch - Replik von rAAV-ChR2-YFP- erkannt injizierten Mäusen (5A), nicht aber in Nachbildungen von nicht-injizierten Mäusen. Der postsynaptischen Membran Spezialisierung der glutamatergen Synapsen in einem Replikat kann 7 durch die P-Fläche seines präsynaptischen Plasmamembran als ein Cluster von intramembranären Teilchen (IMPs) auf der E-Fläche der Plasmamembran 2, 23, und wird oft begleitet beachten (5B-C). Erlaubt diese Funktionen , um die postsynaptische Spezialisierung der glutamatergen Synapsen durch PIN / MGn Axonterminalen (Abbildung 5 und 6) gebildet , zu identifizieren. Wir markierten AMPA-Rs mit einem Antikörper, der alle vier Untereinheiten (GluA1-4) erkennt, während NMDA-Rs einen Antikörper gegen die essentiellen NR1-Untereinheit detektiert wurden.

ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Wegen des Mangels an Werkzeugen auf dem gleichen Replik zu erkennen, ob diese Synapsen mit dendritischen Dornen oder Wellen von ITC Neuronen wurden, gekennzeichnet wir die entsprechende Replik Gesicht für μ -Opioid - Rezeptoren, wie ITC Neuronen exprimieren postsynaptisch hohe Niveaus dieser Rezeptoren 24. Dies erforderte die Identifizierung der gleichen postsynaptischen Profile in den beiden Replikaten (5C-F und 6A-D) eine Strategie verwendet , die Landmarken (4E) beschäftigt .

figure-results-1
Abbildung 5. Der Nachweis von ChR2-YFP und Ionotropic Glutamate Receptors auf Replikat von Immunogold Partikel. (A) Ein Quer gebrochen Axonterminal (hellblau) und kleine Teile seiner P-Gesicht , markiert mit 15 nm Goldpartikeln Nachweis ChR2-YFP. Innerhalb des Terminals, wobei die Membran of zahlreiche synaptische Vesikel (sv) beobachtet werden. Notieren Sie sich die Spezifität der Immunmarkierung zu einem großen Teil an der Plasmamembran beschränkt. Kennzeichnung für ChR2 identifiziert das Terminal als von der PIN / MGn. Das Terminal bildet eine asymmetrische Synapse mit einer Wirbelsäule. Der postsynaptischen Membran Spezialisierung (PSD) an der E-Fläche zeigt eine charakteristische Gruppe von intramembranären Teilchen und mit 5 nm Goldpartikel offenbaren AMPA-Rs bezeichnet. (B) Die P-Gesicht eines ChR2-exprimierenden Axon (beschriftet mit 15 nm Goldpartikel) ist an der Grenze gezeigt zwei Dendriten, einer von ihnen besitzen zwei mit 5 nm Goldpartikeln markiert PSDs enthüllt NMDA-Rs. (CD) gegenüberliegenden Flächen der prä- und postsynaptischen Membranen eines PIN / MGn-ITC Synapse. (C) Das P-Gesicht des Terminals drückt ChR2 (beschriftet mit 15 nm Goldpartikel) und erstreckt sich über die E-Gesicht von zwei dendritischen Wellen, einer von ihnen mit zwei PSDs markiert für AMPA-Rs (5 nm Goldpartikel). ( D) für μ-Opioid - Rezeptoren (10 nm Goldpartikel) Die entsprechende P-Fläche der beiden Dendriten bezeichnet. (EF) vergrößerte Ansichten der Flächen durch die gestrichelte Linie dargestellt. Maßstabsbalken:. 500 nm Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Immunoparticles für AMPA-Rs in den PIN / MGn-ITC Synapsen waren über die IMP Cluster gefunden, um eine homogene Verteilung innerhalb der postsynaptischen Spezialisierung (5E) hindeutet. A signifikant höher (ungepaarter t-Test p <0,018) Dichte von AMPA-R Markierung wurde in PIN / MGn beobachtet Synapsen auf ITC Stacheln (715 ± 38 Goldteilchen / & mgr; m 2, n = 32) im Vergleich zu Synapsen auf ITC Dendriten (590 ± 44 Goldteilchen / & mgr; m 2, n = 32). Insgesamt zeigten sich die Dichte von AMPA-Rs im PIN / MGn-ITC Synapsen eine relativ niedrigeVarianz (Variationskoeffizient CV = 0,37), die mit einer homogenen Verteilung.

Immunoparticles für NMDA-Rs in den PIN / MGn-ITC Synapsen häufig ungleichmäßig innerhalb postsynaptischen IMP Cluster (5B) verteilt beobachtet wurden. Die Dichte des NMDA-R Markierung war ähnlich (ungepaarter t-Test p = 0,39) zwischen PIN / MGn Synapsen auf ITC Stacheln (1070 ± 153 Goldteilchen / & mgr; m 2, n = 8) und ITC Dendriten (812 ± 183 Goldteilchen / & mgr; m 2, n = 9). Anders als für die AMPA-Rs beobachtet wurde, wurde die Dichte des NMDA-Rs in PIN / MGn-ITC Synapsen sehr variabel (CV = 0,54).

figure-results-2
Abbildung 6. AMPA-Rs und NMDA-Rs Immunmarkierung bei Identifizierte PIN / MGn-ITC - Synapse.
(AB) gegenüberliegende Flächen der prä- und postsynaptischen Membranen eines PIN / MGn-ITCSynapse machte auf einen dendritischen Dorn in dem die P-Seite des Klemmen ChR2 drückt (mit 15 nm Goldpartikel markiert) und die PSD auf eine dendritische Wirbelsäule für AMPA-Rs (5 nm Goldpartikel) markiert. (CD) vergrößerte Ansichten der Bereiche durch die gestrichelte Linie dargestellt. Diese Bereiche wurden etwa 45 ° gegen den Uhrzeigersinn zu ermöglichen, eine bessere Sicht auf die PSD gedreht. (E) Scatterplots der Anzahl von AMPA-R - Partikel im Vergleich zu synaptischen Bereich in ITC Stacheln und Dendriten. In beiden Strukturen ist eine positive Korrelation beobachtet. (F) Scatterplots der Anzahl von NMDA-R Partikel gegen synaptischen Bereich in ITC Stacheln und Dendriten. Eine signifikante positive Korrelation wurde nur in dendritischen Dornen detektiert. Maßstabsbalken:. 500 nm Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

weildie P-Fläche der präsynaptischen Plasmamembran oft teilweise die postsynaptischen IMP Cluster überlagert, wir den synaptischen Bereich von nur 30% der Synapsen schätzen konnte (Stacheln: mittlere Bereich 0,032 & mgr; m 2, Bereich: 0,007 bis 0,063 & mgr; m 2, n = 8; Dendriten: 0,047 & mgr; m 2, Bereich: 0,024 bis 0,166 & mgr; m 2, n = 11). Diese waren in einem ähnlichen Bereich wie zuvor analysiert telencephalic glutamatergen Synapsen 25.

In beiden Stacheln und Dendriten, wurde die Zahl der Gold immunoparticles für AMPA-Rs in einzelnen Synapsen positiv mit dem synaptischen Bereich korreliert (Spearman, Stacheln: r = 0,88, Dendriten: r = 0,60, p <0,0001) (6E). Umgekehrt wurde die Zahl der Gold immunoparticles für NMDA-Rs Bezeichnungen mit den synaptischen Bereich in Stacheln (Spearman, Stacheln: r = 0,90, p <0,002) zu korrelieren , aber nicht in Dendriten (r = 0,21, p = 0,29) (Figur 6F ).

Diskussion

Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie hat seit über 40 Jahren eine wichtige Technik in Ultrastrukturforschung gewesen. das Fehlen einer wirksamen Mittel jedoch die molekulare Zusammensetzung von Membranen zu studieren erzeugt einen deutlichen Rückgang in ihrer Nutzung. In jüngster Zeit hat es eine große Wiederbelebung in Gefrierbruch - Elektronenmikroskopie war aufgrund der Entwicklung wirksamer Weise zu integrale Membranproteine ​​durch Immunogoldmarkierung zeigen 1, 2, nämlich der FRIL - Technik.

Die FRIL Technik besitzt mehrere Vorteile gegenüber anderen Methoden Immunogoldmarkierung ultra. Erstens sind Proteine ​​leicht zugänglich an Antikörper, die Empfindlichkeit zu erhöhen. Zweitens Exposition von großer Teil der Plasmamembran Spezialisierungen wie der postsynaptischen Membran, auf der zweidimensionalen Oberfläche des Replika ermöglicht die Inspektion der räumlichen Verteilung und physikalische Kontiguität der Moleküle von Interesse ohne aufwendige und zeitraubende Rekonstruktion serial ultradünne Schnitte. Drittens erhöht die Verfügbarkeit der beiden Hälften der Plasmamembran, die Anzahl von Proteinen, die für jede einzelne Struktur gekennzeichnet werden können, sofern geeignete Antikörper zur Verfügung stehen. Beim Brechen wird die hydrophobe Seite der geteilten Membran mit Kohlenstoff-Platin beschichtet, die verbleibenden Proteindomänen auf der gebrochenen Oberfläche verschanzt. Dies verhindert den Zugang von Antikörpern gegen Antigene in diesen Domänen. Zum Beispiel auf dem P-Gesicht einer Replik nur Epitope der plasmatischen Raum mit Blick kann nur durch Antikörper, während auf der E-Gesicht erkannt werden Epitope der exoplasmic Raum zugewandten kann durch Antikörper (siehe Abbildung 2) gebunden sein.

Auf der anderen Seite leidet der FRIL - Technik auch gewisse Einschränkungen 2. Frakturen zufällig auftreten, könnte es schwierig sein, bestimmte Zellen oder Strukturen zu zielen. Dies kann auch zu einer Stichprobenverzerrung führen, beispielsweise in Synapse Sammlung, die unterschiedliche Wahrscheinlichkeit fra gegebenencturing entlang der Membran von Strukturen mit unterschiedlichen Krümmung (zB Stacheln gegen Wellen). Außerdem ist die Zuordnung von Membranproteinen zu einer der beiden Flächen nicht vorhersagbar. Daher sollte die Verteilung eines Proteins an das P-face oder E-face, insbesondere für quantitative Studien werden sorgfältig untersucht Antikörper reaktiv intrazellulären und extrazellulären Domänen verwenden. Schließlich kann die Identifizierung in der Nachbildung bestimmter Strukturen, wie präsynaptischen Axonterminalen, schwierig sein, wenn nur auf morphologischen Merkmalen basieren. die Verwendung spezifischer Antikörper für Proteine ​​Markers oder der Transduktion von markierten integrale Membranproteine ​​oder Kanäle unter Verwendung von viralen Vektoren zusätzliche Werkzeuge bietet Identifizierung der gebrochenen Membranen zu erleichtern jedoch. Zum Beispiel nahm diese Studie die Vorteile der Transduktion von ChR2-YFP in Thalamus Neuronen ihre axonalen efferents in der Amygdala oder der Etikettierung μ-Opioid-Rezeptoren zu identifizieren postsynaptischen mir zu offenbarenmbranes von ITC Neuronen.

Um in Bezug auf Gewebefixierung durchführen sollte die FRIL Technik erfolgreich, besondere Sorgfalt getroffen werden. Starke Gewebefixierung (> 2% Paraformaldehyd) kann in einer hohen Rate von Querbrüchen und einer Abnahme in Etikettierungs Empfindlichkeit führen. Auf der anderen Seite, schwach Fixierungen machen das Gewebe Handhabung und Zubereitung (zB Schneiden von Abschnitten) schwierig. Es ist auch wichtig zu steuern, dass die Dicke der getrimmten Blöcke entspricht der Dicke des doppelseitigen Klebebands. Wenn die Dicke der Probe niedriger ist als die des Bandes, die Oberfläche des Gewebes nicht an die Oberfläche der beiden Metallträger befestigen kann folglich die gefrorenen Probe wird nicht zerbrochen. Wenn das Gewebe dicker ist, wird es mit unvermeidbare strukturelle Verzerrungen zusammengedrückt werden, wenn das Sandwich aus den beiden Kupferträger hergestellt wird. Die Temperatur, bei der die Probe gebrochen wird (in diesem Protokoll -115 ° C) spielt auch eine wichtige Rolleauf die Struktur der Replik. Höhere Temperaturen können eine höhere Rate von Artefakten, wie beispielsweise die Kondensation von Wasserdampf auf der Oberfläche des Gewebes erzeugen, bevor oder während der Verdampfung. Niedrigere Temperaturen (<-125 ° C) kann während des Fracturing-off von Material das Risiko der Spaltung erhöhen. Dieses Material kann auf die Oberfläche der Probe fallen oder ihm in Verbindung zu bleiben. Diese Flocken von Material sind auch beschichtet und Kontrast auf das Bild dunkle Flecken zu erzeugen. bei niedrigeren Temperaturen beeinflussen können Fracturing auch die Häufigkeit von Kreuzbrüchen vor allem für kleine feine Strukturen wie dendritischen Dornen. Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Herstellung der Repliken ist das Detergens-Verdauung. Wenn die Verdauung nicht vollständig ist, wird das unverdaute Gewebe als dunkle Flecken auf der Replik, an der TEM die Analyse der Struktur Verwechselung. Darüber hinaus kann die unverdauten Gewebe unspezifisch Falle oder binden Antikörper, die Erhöhung der Hintergrundmarkierung. Auf der anderen Seite ist die Verwendung von Detergenss für Gewebe Verdauung können die Moleküle zu denaturieren, um die Replik zugeordnet ihre Sekundär- und Tertiärstrukturen zu verändern. Daher ist für bestimmte Antigene kann es notwendig sein, um allmählich die Konzentration von SDS mit zusätzlichen Waschschritten verdünnt.

Für Immunmarkierung ermöglicht die Verfügbarkeit der verschiedenen Größen von Goldteilchen an Sekundärantikörper konjugiert gleichzeitig zu erfassen, sondern nur qualitativ, multiple Proteine, auch in bestimmten Mikrodomänen der Plasmamembran, wie beispielsweise die postsynaptischen Spezialisierung. Jedoch aufgrund sterischer Hinderung, sind quantitative Studien zum Nachweis von nur einem Molekül begrenzt. Die Größe der Goldpartikel können auch die Markierungsausbeute beeinflussen.

Für die Auslegung der Kennzeichnung in FRIL, sollte es im Auge behalten werden, dass die Immun Teilchen irgendwo innerhalb einer Halbkugel mit einem Radius von 20 bis 25 nm von der Antigen aufgrund der flexiblen komplexe Form angeordnet werden kanned durch die primären und sekundären Antikörper 26. Für weitere Informationen über die Theorie und Praxis der FRIL und verwandte Techniken, verweisen wir den Leser auch auf andere methodische Artikel 27, 28.

Die FRIL Technik wurde für die hochauflösende quantitative Analysen von Glutamatrezeptorlokalisierung in verschiedenen Synapsenpopulationen 29, 30. Darüber hinaus kann die Erfassungsempfindlichkeit der FRIL Technik für die AMPA-Rs wurde geschätzt , so hoch wie ein Immunogold Teilchen pro eine funktionelle AMPA kürzlich verwendete -R Kanal 29. Somit ist dieser Ansatz insgesamt sehr nützlich, um die Muster der postsynaptischen Expression von AMPA-Rs und NMDA-Rs an zentralen Synapsen zu quantifizieren und zu analysieren. Hier haben wir gezeigt, seine Anwendbarkeit bei PIN / MGn-ITC Synapsen, eine Website, die meisten wahrscheinlich wichtig für die Weiterleitung US Informationen während der Angstkonditionierung. Verwendung von einem Antikörper gegen die extrazelluläre hochkonservierten Aminosäurereste des AMPA-Rezeptor-Untereinheiten GluA1-GluA4, fanden wir eine gleichmäßige Verteilung von Goldpartikeln in IMP Clustern postsynaptischen Membran Spezialisierungen entspricht. Die Dichte von AMPA-Rs in ITC Stacheln war signifikant höher im Vergleich zu Welle Synapsen gezielt durch PIN / MGn Thalamus Afferenzen. An beiden Wirbelsäule und Welle Synapsen, eine positive Korrelation zwischen Kennzeichnung für AMPA-Rs und postsynaptischen Bereich erkannt wurde, ein gemeinsames Merkmal andere glutamatergen Synapsen 25. Die geringe Abweichung in der Dichte von AMPA-Rs im PIN / MGn-ITC Synapsen zeigt eine homogene Verteilung ähnlich wie bei anderen Synapsen durch Thalamus efferents 7 ausgebildet, unterscheidet sich aber von kortikalen Synapsen 25. Im Gegensatz dazu war die Dichte des NMDA-Rs variabler und nicht zwischen Wirbelsäule und Welle Synapsen was darauf hindeutet, eine andere Regelung als AMPA-Rs unterscheiden. In der Zukunft wird nicht nur die hohe Reproduzierbarkeit der FRIL-Technik ermöglichen die basale molekulare Zusammensetzung von zentralen Synapsen zu beurteilen, sondern kann Erkennung von c erleichternHanges in ionotropen Glutamat - Rezeptor - Zahlen und subsynaptischen Verteilung nach Angst Lernen ergänzt ex-vivo - Aufnahmen von prä- und postsynaptischen Eigenschaften dieser Eingänge.

Abschließend könnte dieser Ansatz von anderen Forschern verwendet werden, um Einblicke in Struktur-Funktionsbeziehungen von Eingangsspezifischen Synapsen in vielen anderen neuronalen Schaltungen, bei denen die Herkunft der Eingänge zu entwirren und die Art und Zusammensetzung der postsynaptischen Elemente von entscheidender Bedeutung ist aber problematisch .

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Förderung erfolgte durch den FWF-Grant Nr. P-22969-B11 des österreichischen Wissenschaftsfonds an F. Ferraguti, durch die Gemeinnützige Hertie-Stiftung und das Werner Reichardt Zentrum für Integrative Neurowissenschaften sowie durch die DFG (CIN-Exc. 307) an I. Ehrlich.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Surgery
Stereotaktischer RahmenStoelting, USA51670kann durch einen anderen stereotaktischen Rahmen für Mäuse ersetzt
Stereotaktischer Rahmen MausadapterStoelting, USA51625
Gasanästhesiemaske für MäuseStoelting, USA50264nicht mehr lieferbar, ersetzt durch Art.-Nr. 51609M
Druckinjektionsgerät, Toohey SpritzerToohey Company, USAT25-2-900andere Druckinjektionsgeräte (z.B. Picospritzer) können verwendet werden
Kwik Fill GlaskapillarenWorld Precision Instruments, Deutschland1B150F-4
Anästhesiegerät, IsoFloEickemeyer, Deutschland213261
DC Temperaturregler und HeizkissenFHC, USA40-90-8D
Horizontaler Mikropipettenabzieher Modell P-1000Sutter Instruments, USAP-1000
Sterilisator für chirurgische Werkzeuge, Sterilisator 75Melag, Deutschland08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (Serotyp 2/9)Penn Vector Core, USAAV-9-26973P
schnell grünRoth, Deutschland0301.1
Isofluran-Anästhetikum, Isofuran CP (1 ml/ml)CP Pharma, Deutschland
Antiseptikum, Betadin (Providon-Jod)Purdure Products, USABSOL32kann durch andere Desinfektionsmittel ersetzt
werden Analgetikum, Metacam Lösung (5 mg/ml Meloxicam)Boehringer Ingelheim, Deutschlandkann durch andere Analgetika ersetzt werden
Bepanthen AugensalbeBayer, Deutschland0191kann durch andere Augensalben ersetzt werden
Bohrer NM3000 (SNKG1341 und SNIH1681)Nouvag, Schweiz
Sutranox NahtnadelFine Science Tools, Deutschland12050-01
Geflochtene SeidennahtFine Science Tools, Deutschland18020-60
Name<>Unternehmen<strong>Katalognummer<strong>Kommentare
Gewebepräparat
Paraformaldehyd EM gradeAgar Scientific Ltd., Vereinigtes KönigreichAGR1018
Gesättigte PikrinsäurelösungSigma-Aldrich, USAP6744-1GA
Na2HPO4-2H20Merck Millipore, Deutschland1065860500
NaH2PO4-2H2O Merck Millipore, Deutschland1063451000
NaClMerck Millipore, Deutschland1064041000
4N NaOHCarl Roth, DeutschlandT198.1
ThiopentalSandoz, Österreich5.133
GlycerolSigma-Aldrich, USAG5516-500ML
GenPure ReinstwassersystemThermo Fisher Scientific, USA
SchlauchpumpeISMATEC, DeutschlandISM 930C
FilterpapierMACHEREY-NAGEL, DeutschlandMN 615 1/4
Vibroslicer, VT1000SLeica Microsystems, Österreich
OphthalmicSkalpell Alcon Laboratories, USAkann durch andere Ophthalmic Skalpelle ersetzt werden
PerfusionskanüleVieweg, DeutschlandF560088-1kann durch ähnliche Artikel anderer Firmen ersetzt werden
NameCompany<>KatalognummerKommentare
High-pressure  Gefrieren
Kupfer TrägerIngenieurbüro M. Wohlwend, CH528
Sidol PolishHenkel, Deutschlandkann durch gleichen Artikel anderer Firmen ersetzt werden
SämischlederHaushaltsfachhandel Locher
1,5mmStubai, Österreichkann durch gleichen Artikel anderer Hersteller ersetzt
Denaturiertes EthanolDonauchem, Österreichkann durch gleichen Artikel anderer Hersteller ersetzt
werden AcetonRoth, Deutschland9372.5ACHTUNG!
Hochdruck-Gefriermaschine HPM 010BalTec, CH; jetzt Leica MicrosystemsHPM010nicht mehr produziert, ersetzt durch LeicaEM HPM100
StereomikroskopOlympus, JapanSZX10
FlüssigstickstoffACHTUNG!
Kryo-FläschchenRoth, DeutschlandE309.1können durch denselben Artikel anderer Hersteller ersetzt
werden CryoCaneNalge Nunc International,USA5015-0001kann durch denselben Artikel anderer Hersteller ersetzt
werden CryoSleeveNalge Nunc International,USA5016-0001kann durch denselben Artikel anderer Hersteller ersetzt werden
Flüssigstickstoff-LagerbehälterCryopal, FrankreichGT38kann durch den gleichen Artikel anderer Hersteller ersetzt werden
Nichtionisches Reinigungsmittel (Lavocid)Werner & Mertz Professional, Deutschland
Name<>Unternehmen<>KatalognummerKommentare
>Gefrierbruch und Replikation
Sandstrahler, Mikromat 200-1JOKE Joisten & Kettenbaum, DeutschlandSANDURET 2-Kkann durch den gleichen Artikel anderer Hersteller ersetzt werden
Siliziumcarbid SIC 360, Körnung 25 - 21µJOKE Joisten & Kettenbaum, Deutschland955932
Freeze Fracture System BAF 060BalTec, CH; jetzt Leica MicrosystemsBAF060
Keramik 12 Well-PlatteGrö pel, Österreich14511kann durch denselben Artikel anderer Firmen ersetzt
Trizma baseSIGMA, USAT1503kann durch denselben Artikel anderer Firmen ersetzt
Trizma hydrochloridSIGMA, USAT3253kann durch denselben Artikel anderer Firmen ersetzt
NatriumchloridMerck, Deutschland1.064.041.000kann durch denselben Artikel anderer Firmen
ersetzt werdenSDS, NatriumlaurylsulfatRoth, Deutschland5136.1VORSICHT! ;   Kann durch denselben Artikel anderer Hersteller ersetzt werden
SaccharoseMerck, Deutschland1.076.871.000Kann durch denselben Artikel anderer Hersteller ersetzt
werden TRISRoth, Deutschland5429.3Kann durch denselben Artikel anderer Hersteller ersetzt
werden Universal Hybridization OvenBinder, Germany7001-0050kann durch denselben Artikel anderer Hersteller ersetzt
NameCompanyKatalognummerComments
Immunolabelling
BSASIGMA, USAA9647kann ersetzt werden durch denselben Artikel von anderen Firmen
Anti-GFP AntikörperMolekulare Sonden, USAA11122
Anti-pan-AMPAR AntikörperFrontier Institute, Japanpan AMPAR-GP-Af580-1
Anti-NMDAR1 Antikörper, Klon 54.1Merck Millipore, DeutschlandMAB363
Opioidrezeptor-Mu (MOR) AntikörperImmunoStar, USA24216
EM Anti-Meerschweinchen für Ziege, 5 nm; SekundärantikörperBBInternational, UKEM. GAG5
EM Anti-Kaninchen für Ziegen, 15 nm; SekundärantikörperBBInternational, UKEM. GAR15
Esel-Anti-Kaninchen, 10 nm, SekundärantikörperAURION, NiederlandeDAR 10 nm
Kupfergitter, 100 parallele Stangen Agar scientific, UKG2012C
InkubatorMajor Science, USAMO-RCkann durch denselben Artikel von anderen Unternehmen ersetzt werden
Pioloform Pulver  Agar scientific, UKR1275
ChloroformRoth, Deutschland3313.1VORSICHT! ;   kann durch denselben Artikel anderer Firmen ersetzt werden
Name><>UnternehmenKatalognummer<strong>Kommentare
EM Analyse
Philips CM120 TEMPhilips/FEI
Morada CCD-KameraSoft Imaging Systems, Deutschland
iTEM Ver. 5.2, BildgebungssoftwareSoft Imaging Systems, Deutschland
werden 50131235strong werden werden werden werden werden

Referenzen

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