Abstract
एक उपन्यास विच्छेदन और रिकॉर्डिंग तकनीक ऑप्टिकल निगरानी धुंधला और भाले के आकार माउस पंख की त्वचा में बालों के रोम के आसपास के टर्मिनलों के डी-धुंधला के लिए वर्णित है। तैयारी मज़बूती से तंत्रिका टर्मिनलों रहने वाले तेज और styryl pyridinium रंगों बड़े पैमाने पर पुटिका रीसाइक्लिंग के अध्ययन में इस्तेमाल की रिहाई का अध्ययन करने के कई लेबल इकाइयों के व्यापक क्षेत्रों उपज, सरल और अपेक्षाकृत तेज है। लेबलिंग से पहले तैयारी के उप-विभाजित परीक्षण बनाम एक ही व्यक्ति से एक ही कान में नियंत्रण तुलना की अनुमति देता है। उपयोगी सुझाव तैयार करने, लेबलिंग और इमेजिंग मापदंडों की गुणवत्ता में सुधार लाने के लिए दिया जाता है। इस नई प्रणाली औषधीय परख करने की क्रिया और यंत्रवत् प्रेरित तेज और दोनों प्रकार के जंगली में भाले के आकार टर्मिनलों में इन महत्वपूर्ण रंगों और आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों की रिहाई के लिए उपयुक्त है। लेबलिंग तीव्रता पर modulatory प्रभावों के उदाहरण दिए गए हैं।
Introduction
Mechanosensory तंत्रिका अंत, बगल में उपयोग करने के लिए आम तौर पर, छोटे diffusely वितरित और मुश्किल हो जाता है के रूप में वे आम तौर पर त्वचा या अन्य आसपास के ऊतकों में गहरे दफन कर रहे हैं। उन्हें visualizing, इसलिए, आम तौर पर एक लंबे समय तक immunolabeling / धुंधला अवधि, या देरी और खर्च के इस तरह के हरे या पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP / YFP) 1 के रूप में फ्लोरोसेंट लेबल के आनुवंशिक अभिव्यक्ति के साथ माउस लाइनों प्राप्त करने के द्वारा पीछा किया सेक्शनिंग की आवश्यकता है। यहाँ हम एक सुविधाजनक ऊतक और एक त्वरित और आसान विधि अध्ययन के लिए बाल कूप afferents की बड़ी संख्या के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए दिखाने के लिए, और वे जल्दी से टर्मिनल 2 समारोह के ऑप्टिकल निगरानी के लिए लेबल किया जा सकता है कि कैसे। अभ्यास के साथ, इमेजिंग के लिए विच्छेदन से पूरे तकनीक के रूप में छोटे रूप में 2 घंटे में पूरा किया जा सकता।
संवेदी axons की भाले के आकार टर्मिनलों innervating स्तनधारियों में बालों के रोम-बाल कूप के आसपास उपकला Palisades फार्म, प्रत्येक के साथglial / श्वान सेल के बीच sandwiched टर्मिनल 2-4 प्रक्रियाओं। टर्मिनलों के उद्देश्य बाल वे चारों ओर के यांत्रिक विस्थापन का पता लगाने के लिए है। वे तेजी से और धीरे धीरे आदत डाल अंत का एक मिश्रण हैं, लेकिन वे मुख्य रूप से बालों के आंदोलन के जवाब में गतिविधि की कमी फटने का उत्पादन। आमतौर पर, फायरिंग, बहुत जल्दी जब आंदोलन रहता है बंद हो जाता है भी जारी रखा विस्थापन की उपस्थिति में।
ऑप्टिकल तरीकों से भाले के आकार टर्मिनलों के अध्ययन के लिए यह murine पंख मॉडल संरचना और इन अंत के समारोह के अध्ययन के लिए कई लाभप्रद विशेषताएं है। पंख मुख्य रूप से त्वचा की दो परतों के बैक-टू-बैक केवल बीच उपास्थि ऊतक के एक छोटी राशि के साथ apposed है। त्वचा शरीर के अन्य क्षेत्रों के लिए कमजोर चिपकने वाला संयोजी ऊतक रिश्तेदार की न्यूनतम मात्रा के कारण बहुत पतली और आसानी से विच्छेदित है। आसानी से अलग त्वचा की परतों, इसलिए, रोम और टर्मिनलों के लिए अच्छा उपयोग दे। इन्नेर्वतिओनआसानी से सुलभ और पहचाने जाने योग्य है। बालों के रोम और अधिक कम अन्य त्वचा क्षेत्रों की तुलना में वितरित कर रहे हैं, रोम के व्यक्तिगत या छोटे समूहों की इमेजिंग की सुविधा। पतली अंतर्निहित त्वचीय परत रंगों और औषधीय दवाओं के लिए अच्छी पहुंच देता है, तो आगे की प्रक्रिया के बिना प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के लिए आदर्श है। अगर एक फिक्स डाई एनालॉग का उपयोग कर, निर्धारण और आगे ऊतकीय प्रसंस्करण के बाद लेबल टर्मिनलों की इमेजिंग रहने वाले टर्मिनलों के लिए या तो हो सकता है या कर सकते हैं।
हम इस तैयारी का इस्तेमाल किया है कि झिल्ली रीसाइक्लिंग भाले के आकार अंत में होता है, तेज (endocytosis) और एक styryl pyridinium डाई (FM1-43 की रिहाई (exocytosis) इसका सबूत दिखाने के लिए, एन - (3-triethylammoniumpropyl) -4 (4 (dibutylamino) styryl) pyridinium Dibromide)। डाई नहीं है, तथापि, काफी लेबल करने के लिए निवेश श्वान सेल प्रक्रियाओं 2 प्रतीत होता है। हम यह भी है कि इस डाई तेज / रिलीज से पता चला है, और इसलिए आर झिल्लीeCycling, एक असामान्य (phospholipase डी-युग्मित) metabotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर के माध्यम से ग्लूटामेटरगिक मॉडुलन के अधीन है। सरल उत्तेजना और विश्लेषण प्रोटोकॉल के परिणामों सचित्र हैं, और आम संभावित विश्लेषण मुद्दों पर भी डाला जाता है।
Protocol
इन विधियों अनुसंधान बैंकों में सूचना दी, आरडब्ल्यू एट अल। 2 चूहों नम्रता से ग्रीवा अव्यवस्था से euthanised गया में इस्तेमाल किया गया। ब्रिटेन में, यह एक कानूनी तौर पर मंजूरी दे दी अनुसूची 1 पशु (वैज्ञानिक प्रक्रिया) में सूचीबद्ध विधि अधिनियम, 1986 और यूरोपीय निर्देशक 2010/63 / यूरोपीय संघ है। यह संघीय कानून पशु कल्याण द्वारा एबरडीन विश्वविद्यालय और नैतिक समीक्षा बोर्ड जो सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी है पर स्थानीय स्तर पर लागू की जाती है।
1. लेबलिंग के लिए तैयारी कान
- ऐसे Liley के (1956) के रूप में 5, एक मानक शारीरिक खारा तैयार है और 90% 2 हे / 5% सीओ 2 (carbogen) के साथ यह तर। 3 NaHCO (12), KCl (4), के.एच. 2 पीओ 4 (1), सोडियम क्लोराइड (138.8), 2 MgCl (1), 2 CaCl (2) और ग्लूकोज (11): Liley खारा (मिमी) है। नोट: इस पांडुलिपि के शेष के दौरान, 'खारा' खारा है कि पूरी तरह carbogen के साथ संतृप्त है का उल्लेख होगा। dissectio के दौरान20 मिनट - एन, तैयारी हर 15 को कवर खारा ताज़ा करें।
- नम्रता से खोपड़ी को नुकसान पहुँचाए बिना एक वयस्क माउस euthanize। नोट: हम C57 / Bl6J और MF1 चूहों का इस्तेमाल किया है, लेकिन किसी भी माउस तनाव में इस्तेमाल किया जा सकता है। सबसे महत्वपूर्ण पहलू बड़े वयस्कों (> 25 ग्राम) का उपयोग करने के लिए नहीं है। बड़े चूहों में लेबलिंग, कम विश्वसनीय अक्सर रोम के छोटे और बिखरे हुए समूहों को सीमित किया जा रहा है।
- ~ 25 सेमी कैंची के साथ बाहरी कान (pinnae) आधार के पास निकालें, सिर्फ घने बाल रेखा से ऊपर है, और एक सिलिकॉन रबर लाइन संस्कृति / पेट्री डिश में खारा में डूब (50 मिमी आमतौर पर सुविधाजनक है)।
- नीचे की स्थिति पंख पूर्वकाल (अवतल) की ओर और ठीक कीट पिन के साथ नियमित अंतराल पर सिलिकॉन के लिए मार्जिन पिन (~ 6 - 8 कान प्रति, ~ 0.2 मिमी व्यास पिन)। ताज़ा करे खारा हर 15 - 20 मिनट, या एक लगातार भरकर रखा स्नान का उपयोग करें।
- ध्यान से, कुंद विच्छेदन से पूर्वकाल त्वचा से त्वचा पीछे दूर छील शुरू में खत्म पंख की कटौती आधार से पहुँचनेमोटी केंद्रीय उपास्थि और व्यवस्थित ढंग से पतली, उपास्थि मुक्त बाहरी मार्जिन की दिशा में काम कर रहे।
- ऐसा करने के लिए, कोई एक जोड़ी के साथ पीछे त्वचा की कटौती बढ़त के केंद्र पकड़ो। 3 संदंश। फिर, जबड़े के साथ बंद हुए, कोई का एक और सेट के अंक जगह है। त्वचा और अंतर्निहित उपास्थि के बीच की खाई में 3 संदंश।
- धीरे, पक्ष की ओर से अंतराल के भीतर से बंद संदंश के अंक काम न्यूनतम आवश्यक बल प्रयोग सावधानी से adhesions ढीला परतों को अलग करने के पीछे त्वचा वापस छीलने है।
- पीछे त्वचा के साथ हटा, स्थिति में पूर्वकाल त्वचा छोड़ दें। (प्रति 1.5 के रूप में, ऊपर) पूर्वकाल त्वचा के बगल में पीछे त्वचा, चमड़े का पक्ष पिन अप।
- अगला, ध्यान और पूरी तरह से पंख उपास्थि कि 1.6 के रूप में ही कुंद विच्छेदन तकनीक द्वारा पूर्वकाल त्वचा से त्वचा की परतों के बीच बैठा था हटा दें। संदंश के साथ पंचर छेद बनाने से बचें।
- फिर, चया दोनों पंख त्वचा की तैयारी धीरे छील, बांधना और दूर संयोजी ऊतक की पतली परत रगड़ना, विस्तार polystyrene फोम, कि बाल कूप ठिकानों को शामिल किया जैसी। ध्यान दें: इष्टतम समाशोधन प्राप्त करने के एक छोटे से अभ्यास ले सकते हैं; अपर्याप्त ऊतकों को हटाने, पहुँच भी नुकसान पहुँचा दोनों डाई समाधान के लिए और इमेजिंग के लिए, जबकि भी सख्ती स्क्रैप तंत्रिका नेटवर्क है, जो रोम के आधार पर कर रहे हैं हटा।
- खारा ताज़ा करें।
2. भाले के आकार टर्मिनल लेबलिंग
नोट: निम्न प्रोटोकॉल styryl pyridinium डाई के लिए अनुकूलित है। अन्य, रासायनिक समान है, styryl pyridinium रंगों से काम करना चाहिए, शायद एकाग्रता और ऊष्मायन समय में कुछ समायोजन के बाद। दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट पहन जब डाई समाधान से निपटने। या तो निर्माता से सीधे 10 मिमी शेयर डाई समाधान खरीदने के लिए या ग्लूकोज बिना खारा में डाई पाउडर भंग द्वारा शेयर तैयार करते हैं। विभाज्य (10 μl आमतौर पर सुविधाजनक है, लेकिन बड़े एससीए के लिए इस समायोजितLe प्रयोगों) और दुकान -80 डिग्री सेल्सियस पर -20 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 6 महीने या ~ 1 साल के लिए जमे हुए। पाउडर में कम से कम 2 साल के लिए की दुकान है। दोहराया फ्रीज / डाई समाधान के पिघलना चक्र से बचें, इस तेजी से डाई denatures। एक बार जब 4 डिग्री सेल्सियस पर डीफ़्रॉस्ट, दुकान और 1 सप्ताह के भीतर का उपयोग करें।
- 30 डिग्री सेल्सियस के लिए एक पानी के स्नान पूर्व गर्मी, एक मंच ~ 3 के साथ - 5 पानी की सतह के नीचे मिमी।
- हौसले से 10 माइक्रोन styryl pyridinium डाई समाधान (10 मिलीलीटर खारा में हौसले डीफ़्रॉस्ट 10 मिमी styryl pyridinium डाई के 10 μl) तैयार करने और नहाने के पानी में संतुलित करना।
- (ठेठ मात्रा ~ 2 मिलीलीटर) खारा 2 मिमी - पिन एक सिलिकॉन रबर में प्रत्येक तैयारी 35 मिमी संस्कृति 1 में डूबे हुए व्यंजन खड़े हैं। प्रत्येक पंख त्वचा की तैयारी दो तैयारियों उपज यदि शीर्ष से आधे में कटौती छोटे कैंची के साथ आधार होगा - (10 से 15 सेमी लंबाई) जानवर उपयोग कम से कम करने के लिए।
- 30 डिग्री सेल्सियस waterbath में डूबे हुए मंच पर खारा से ढके पंख तैयारियों युक्त 35 मिमी बर्तन रखें। सुनिश्चित करेंपानी की गहराई पर्याप्त वार्मिंग के लिए पर्याप्त है लेकिन खुले डिश में खारा दूषित नहीं है।
- पिन ठीक (0.5 - 1 मिमी बाहरी व्यास) प्रत्येक पकवान लगातार तैयारियों गैस के सिलिकॉन आधार में बह 2 हे / सीओ 2 के साथ ट्यूबिंग। इसके अलावा पानी के स्नान में धोने / पकवान ताजगी के लिए डाई मुक्त खारा की 100 मिलीलीटर की जगह है। carbogen संतृप्ति को बनाए रखने और पानी के प्रदूषण को रोकने के लिए एक कसकर stoppered बोतल का प्रयोग करें।
- 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सब कुछ संतुलित करना तो stoppered बोतल 100 मिलीलीटर से पंख तैयारियों से ज्यादा खारा की जगह। एक और 30 मिनट के लिए सेते हैं। नोट: यह प्रतिस्थापन खारा वाष्पीकरण और किसी भी थोक मात्रा में गैस लाइन बुदबुदाती से उत्पन्न नुकसान के लिए क्षतिपूर्ति।
- एक 100 मिलीलीटर बेकार बीकर में डाई मुक्त खारा दूर डालो, तो जल्दी से और ध्यान से किसी भी तरल टिशू पेपर के साथ तैयारी के आसपास शेष दूर दाग को कम से कम करने के लिए डाई समाधान पर कमजोर पड़ने प्रभाव अगले जोड़ा जाएगा। छूने के लिए नहीं ख्याल रखना (
- 30 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए 10 माइक्रोन styryl pyridinium डाई के 3 मिलीलीटर तो प्रक्रिया के आराम के लिए आर / टी करने के लिए वापस - 2 में पंख की तैयारी सेते हैं।
- तीन चरणों में गैर-भाँति डाई हटाने, आर / टी पर समाधान का उपयोग। नोट: ये कदम सबसे अच्छा न्यूनतम परिवेश प्रकाश (अंधकार अंधा, लाल / नारंगी कम तीव्रता प्रकाश) में प्रदर्शन कर रहे हैं इमेजिंग के लिए आंख काले रूपांतरण शुरू करने के लिए।
- दूर बर्बादी बीकर में व्यंजन से लेबलिंग समाधान डालो और जल्दी से तेजी से उत्तराधिकार में डाई मुक्त खारा के तीन परिवर्तन में कुल्ला। इस तैयारियाँ और किसी भी डाई है कि आसानी से अवगत कराया झिल्ली से departitions अवशिष्ट styryl pyridinium डाई समाधान पालन हटा।
- एक और 30 मिनट के लिए डाई मुक्त खारा के अंतिम परिवर्तन में सेते सतह की झिल्ली से सबसे शेष डाई departition, यानी, टर्मिनल से भली भाँति नहीं डाई।
- लगातार डाई अटक टी हटायेओ sulfonated बी-cyclodextrin व्युत्पन्न के साथ chelating द्वारा उजागर झिल्ली के बाहरी पत्रक (ADVASEP-7, 1 मिमी, 5 मिनट - 1 टेबल देखें)। इस प्रकार, सभी शेष डाई ऊतकों के भीतर हो जाएगा।
- इमेजिंग के लिए नए सिरे से डाई मुक्त खारा में रखें और अच्छी तरह से टिशू पेपर के साथ पकवान के बाहर सूखी।
नोट: टर्मिनलों अब इमेजिंग के लिए तैयार हैं। यह पता है कि चाकू का अंत जीवित हैं और इसलिए, धीरे-धीरे endocytosed styryl pyridinium डाई फिर से जारी करने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि इस आर / टी पर धीमी हो जाएगा, यह इमेजिंग के दौरान / से पहले देरी को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रयोग में अनेक तैयारियों की लेबलिंग की आवश्यकता है, शुरू में बनाए रखने के लिए उन्हें सभी 30 डिग्री सेल्सियस पर लेबल नहीं किया गया। वे कई घंटे के लिए व्यवहार्य नहीं होगा। तब अंतराल पर क्रमिक रूप से लेबल, दूसरे की तैयारी लेबल करके (2.7 कदम - 2.8.3) पहली इमेजिंग है।
3. इमेजिंग लेबल भाले के आकार अंत।
नोट: प्रेक्षकनिम्नलिखित इमेजिंग चरणों के लिए अनुकूलित अंधेरा होना चाहिए। बढ़ी हुई दृश्य तीक्ष्णता इस परमिट का मतलब है कम उत्तेजना प्रकाश के स्तर इमेजिंग के लिए के रोम लगाने के लिए आवश्यक हैं। इस phototoxicity को कम करने के बजाय photobleaching की असुविधा को कम करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण है। पूर्ण तीव्रता रोशनी द्वारा उत्पन्न मुक्त कण तेजी से (60 सेकंड के भीतर) तंत्रिका टर्मिनलों (जी एस Bewick, एस Fadul और WJ Betz, अप्रकाशित टिप्पणियों) रह मार सकते हैं।
- इमेजिंग से पहले, एक विच्छेदन stereomicroscope के तहत तैयारी की जाँच करें और ध्यान से किसी भी सतह मलबे को हटा दें। इस ऑटो प्रतिदीप्ति छवियों को दूषित रोकता है।
- एक मानक fluorescein फिल्टर सेट के साथ एक ईमानदार epifluorescence खुर्दबीन के मंच पर पकवान माउंट (480 - 488 एनएम उत्तेजना, 500 - 520 styryl pyridinium डाई के लिए एनएम उत्सर्जन)।
- सिर्फ आराम से टर्मिनल का पता लगाने के लिए पर्याप्त जब तक तटस्थ घनत्व फिल्टर के साथ उत्तेजना प्रकाश की तीव्रता दुर्लभएस।
- कम से देख द्वारा लेबल के रोम का पता लगाएँ - उत्तरोत्तर अधिक (10x और 20x पानी विसर्जन उद्देश्य) बढ़ाई उद्देश्यों (3.5 सूखी उद्देश्य 4X), तो।
- कम बिजली और 20x उच्च बढ़ाई के लिए पानी विसर्जन उद्देश्यों के लिए 10x सूखी उद्देश्य के माध्यम से लेबल भाले के आकार टर्मिनलों की छवियों पर कब्जा। प्रकाश की तीव्रता और जोखिम के समय को कम (0.5 की एक कैमरा एकीकरण समय - 1 सेकंड का सुझाव दिया जाता है)।
- एक मानक डिजिटल कैमरे पर छवियों पर कब्जा है और मालिकाना सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कंप्यूटर की हार्ड ड्राइव पर छवियों को बचाने के लिए। नोट: एक विशिष्ट उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है।
- छवि ~ प्रत्येक तैयारी से 20 भाले के आकार अंत। पंख त्वचा और इस मार्जिन इमेजिंग बदले में प्रत्येक कूप के साथ काम के आधार पर कटौती बढ़त से मार्जिन दूर में शुरू करो। थोड़ा क्षेत्रों कटौती बढ़त के समानांतर ओवरलैपिंग, एक ही कूप दो बार देखभाल छवि के लिए नहीं ले जाने में भर में काम करने और किसी भी जाहिर है कि क्षतिग्रस्त हो रहे हैं। ध्यान देंफिर से आम तौर पर उन सब से पहले महत्वपूर्ण सहज de-धुंधला होता है छवि के लिए भी कई भाले के आकार टर्मिनल हैं। इस प्रकार, हम व्यवस्थित निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग कर जनसंख्या के नमूने सुझाव देते हैं।
- सीमांत पट्टी पूरा करने के बाद, पंख के आधार की ओर एक क्षेत्र चौड़ाई ले जाते हैं, और विपरीत दिशा में प्रक्रिया को दोहराएँ।
- छवि सभी टर्मिनलों, का सामना करना पड़ा कभी-कभी लोगों को स्पष्ट रूप से बहुत अधिक फेर से ऑप्टिकल विमान को और मानक कुंडलाकार विश्लेषण रॉय के भीतर पूरी तरह फिट होने की संभावना नहीं उन्मुख को छोड़कर (धारा 4 देखें)। असामान्य रूप से उज्जवल या मद्धम lanceolates, आसपास के टर्मिनलों की तुलना में जब तक वे स्पष्ट रूप से क्षतिग्रस्त हो रहे हैं या पृष्ठभूमि तीव्रता विशेष रूप से उच्च है, स्थानीय ऊतकों को नुकसान का संकेत बाहर नहीं करते।
- तैयारी त्यागें अगर त्वचा क्षेत्र के 10% से अधिक / टर्मिनलों क्षतिग्रस्त हो रहे हैं / व्यर्थ। नोट: lanceolates समय के साथ destain के रूप में, पूर्ण इमेजिंग धोने के अंत के 20 मिनट के भीतर प्रत्येक तैयारी।
- मैंएफ एक से अधिक तैयारी का उपयोग, यह सुनिश्चित तीव्रता तुलना समय-मिलान की तैयारी द्वारा मान्य हैं। ऐसा करने के लिए, ~ से 30 मिनट के प्रत्येक तैयारी धुंधला हो जाना, डे-दाग बार की तुलनात्मकता सुनिश्चित करने के समय ऑफसेट।
- 5 या 10 मिनट के अंतराल पर डी-दाग (exocytosis), छवि एक ही टर्मिनल पर नजर रखने के लिए। अभ्यास के साथ, यह किसी भी एक के लिए तैयार करने में हर समय बिंदु पर 3 अलग टर्मिनलों के लिए ऊपर छवि के लिए संभव है।
4. विश्लेषण लेबल भाले के आकार अंत।
नोट: निम्न प्रक्रिया टर्मिनल तीव्रता का विश्लेषण करने के लिए एक तेजी से विधि है।
- ब्याज (आरओआई) के एक कुंडलाकार क्षेत्र बनाने के कूप के आधार (चित्रा 2) में बाल शाफ्ट की नोक पर केन्द्रित। कुंडलाकार रॉय काफी बड़े किसी भी कूप में बाल शाफ्ट ऑटो प्रतिदीप्ति से बचने के लिए की भीतरी परिधि का विश्लेषण किया जाना निर्धारित है, लेकिन अभी भी सभी टर्मिनल प्रतिदीप्ति धरना। सुनिश्चित करें कि बाहरी परिधि काफी बड़ा सबसे बड़ा termin लगा देना करने के लिए हैअल संभावना है कि मुख्य ऑप्टिकल / कूप धुरी के करीब उन्मुख है सामना किया जा सके।
- एक पृष्ठभूमि रॉय लगभग लक्ष्य वलय के लिए क्षेत्र में बराबर बनाओ (वर्ग या वृत्त, आम तौर पर ~ 400 माइक्रोन 2) विश्लेषण के तहत टर्मिनल के आसपास के क्षेत्र में स्थानीय धुंधला तीव्रता का निर्धारण करने के लिए।
नोट: इन दो ROIs के आकार के विश्लेषण की शुरुआत में स्थापित किया है और किसी भी एक प्रयोग में सभी तैयारियों भर बाद के सभी के रोम / भाले के आकार टर्मिनलों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इसलिए, यह शुरुआत में देखभाल के साथ अपने मानकों को स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। - कूप के पास पर्याप्त पृष्ठभूमि रॉय की जगह वसामय ग्रंथियों कि टर्मिनलों, रोम के बीच नहीं कम तीव्रता त्वचा आबाद में स्थानीय पृष्ठभूमि का प्रतिनिधित्व करने के लिए, लेकिन सावधान नहीं किसी भी टर्मिनल क्षेत्रों को शामिल करने के लिए किया।
- 'उपाय' या 'विश्लेषण रॉय' एक स्प्रेडशीट के लिए सॉफ्टवेयर और डाटा हस्तांतरण के समारोह का उपयोग कर दो ROIs का मतलब तीव्रता रिकॉर्ड।
- स्प्रेडशीट में, प्रत्येक व्यक्ति के लिए कूप वलय में उस से मतलब स्थानीय पृष्ठभूमि तीव्रता घटाना एक शुद्ध तीव्रता देने के लिए। स्थानीय पृष्ठभूमि के लिए यह समायोजन बहुत बीच-कूप परिवर्तनशीलता कम कर देता है।
Representative Results
इस पंख तैयारी में बालों के रोम को आसानी से प्रतिदीप्ति (चित्रा 1 ए) के बिना transillumination के तहत देखा जाता तैयारी की न्यून प्रकृति और पहुंच के सापेक्ष कम यह इन mechanosensory टर्मिनलों के लिए परमिट को दर्शाता हुआ। प्रत्येक प्रमुख बाल शाफ्ट आधार भेदी वसामय ग्रंथि के अंधेरे वर्धमान द्वारा typified है। Epifluorescence के तहत, लेबल भाले के आकार प्रत्येक बाल कूप के आसपास के टर्मिनलों स्पष्ट रूप से देखा और आम तौर पर मजबूत सहज styryl डाई तेज (चित्रा 1 बी) दिखा रहे हैं। इस लगाए गए आंदोलन के बिना होता है। भाले के आकार टर्मिनल, बाल शाफ्ट घेरना करने के लिए देखा जाता है, हालांकि घेरा की हद तक चर 6 है। लेबलिंग की ज्यादातर कबरा (स्पॉट) के बजाय रैखिक व्यवस्था है कि उम्मीद की जा सकती है। कबरा पैटर्न टर्मिनलों टर्मिनल की लंबाई के साथ एक ऑप्टिकल विमान में मनाया जा रहा है दर्शाता है। थीएस तैयारी लेबलिंग के बाद दृश्य के लिए कोई आगे की प्रक्रिया प्राप्त किया, यह बस एक खुर्दबीन मंच को हस्तांतरित और सीटू, जो फिर से इस तैयारी की सादगी दिखाता में imaged किया गया था।
जो इस उपन्यास तैयारी अनुकूल चित्रा 3 में दिखाया जाता है, उदाहरण के प्रयोगों। यह दोनों endocytosis और रहने वाले टर्मिनलों में exocytosis, साथ ही उनके मॉडुलन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रकार, endocytosis के लिए, ग्लूटामेट रिसेप्टर एगोनिस्ट लेबलिंग तीव्रता में वृद्धि कर सकते हैं, जबकि ligands या ऐसे मिलीग्राम के रूप में 2 + 2 + फैटायनों के साथ सीए चैनलों को अवरुद्ध करने, नी 2 + 2 + या सीडी यह 2 कम हो जाती है। वैकल्पिक रूप से, इस तैयारी के रूप में भी चित्रा -3 सी में दिखाया गया है, exocytosis के कैनेटीक्स अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सबसे पहले, एक लेबल टर्मिनल अनायास de-धुंधला देखा जाता है। हालांकि, इस destain exocytosis उत्तेजक द्वारा त्वरित है, latrotoxin। अधिक deप्रयोगात्मक परिणामों की पूंछ, आरडब्ल्यू एट अल। 2 बैंकों में देखा जा सकता है।
चित्रा 1. मजबूत styryl डाई लेबलिंग माउस पिन्ना में दर्ज की गई। (ए) उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी में एक लेबल हटाया गया पंख तैयारी का हिस्सा है, दिखा कैसे स्पष्ट रूप से बालों के रोम areolar / वसा ऊतकों overlying की मंजूरी दे दी क्षेत्रों में दिखाई देते हैं। अंधेरा है, आमतौर पर bilobed, वर्धमान आकार चिकना केंद्रीय बाल शाफ्ट के आसपास के ग्रंथियों रहे हैं। (बी) एक समान क्षेत्र, एक से थोड़ा अधिक बढ़ाई और epifluorescence के साथ imaged, styryl डाई के साथ लेबल भाले के आकार अंत दिखा। स्केल बार -। 40 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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चित्रा 2. styryl डाई लेबलिंग तीव्रता का विश्लेषण। (ए) styryl डाई के साथ बाल कूप लेबलिंग की विशिष्ट परिपत्र पैटर्न, बाल शाफ्ट (इस छवि में दिखाई नहीं) पर केंद्रित रही। (बी) के मुख्य विश्लेषण 'ब्याज के क्षेत्र' (आरओआई) एक मानक वलय कूप को घेरने भाले के आकार तंत्रिका अंत के कटघरा की स्थिति पर आरोपित द्वारा परिभाषित किया गया है। इस रॉय किसी एक प्रयोग के लिए आकार और क्षेत्र में स्थिर रखा है सुनिश्चित करने के लिए लेबलिंग तीव्रता काफी तैयारी के बीच और सभी उपचार भर में तुलना की जा सकती। प्रत्येक रॉय का शुद्ध तीव्रता एक बगल वर्ग या परिपत्र पृष्ठभूमि क्षेत्र (~ 400 माइक्रोन 2) की तीव्रता घटाकर की जाती है। फिर, यह वर्ग पृष्ठभूमि क्षेत्र में किसी भी प्रयोग के दौरान आकार और क्षेत्र में स्थिर रखा है।लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. बाल कूप अभिवाही Lanceloate अंत की लेबलिंग तीव्रता आम तौर पर ऊपर वर्णित विश्लेषण विधि का उपयोग कर अनायास लेबल भाले के आकार टर्मिनलों में वितरित किया जाता नहीं है, और दोनों एंडो और exocytosis की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Styryl डाई तीव्रता माप से ठेठ डेटा। (ए) के नियंत्रण की शर्तों के तहत लेबलिंग तीव्रता (54 के रोम, 4 कान) और 1 मिमी ग्लूटामेट (42 के रोम, 4 कान)। अलग-अलग अंत की तीव्रता मूल्यों क्लस्टर डॉट भूखंडों के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं। प्रत्येक बिंदु एक कूप के आसपास एक टर्मिनल कटघरा की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है। ध्यान दें कि यहां तक कि नियंत्रण की शर्तों के तहत कुछ डेटा अंक (के रोम), अत्यंत तीव्र होते हैं, जबकि सबसे कम तीव्रता में clustered रहे हैं। एक विशेष INTENS में पहली डॉटअल्पसंख्यक केंद्र में साजिश रची है और एक ही तीव्रता के बाद डेटा बिंदुओं पर दोनों ओर उत्तरोत्तर अधिक laterally प्लॉट किए जाते हैं। इस प्रकार, पार्श्व प्रसार के किसी विशेष लेबलिंग तीव्रता का रोम की आवृत्ति का प्रतिनिधित्व करता है। क्षैतिज लाइनों मंझला ± 25% अन्तःचतुर्थक श्रेणी प्रतिनिधित्व करते हैं। 1 मिमी ग्लूटामेट के साथ ऊष्मायन ~ 50% (*** पी <0.001, मान व्हिटनी) मंझला तीव्रता को बढ़ाता है, लेकिन लेबलिंग 200 से बढ़ाया जा सकता है - कुछ टर्मिनलों में 300%। (बी) ग्लूटामेट की मध्यस्थता बढ़ाया डाई तेज (endocytosis) का प्रदर्शन छवियाँ। ग्लूटामेट (1 मिमी) में बाल कूप तैयारी की ऊष्मायन स्पष्ट रूप से, styryl डाई तेज बढ़ जाती है के रूप में वृद्धि की लेबलिंग तीव्रता से दिखाया गया है। स्केल बार 20 माइक्रोन। (सी) को बढ़ाने डाई रिलीज (exocytosis)। लेबलिंग के बाद, styryl डाई अनायास, फिर से जारी किया जाता है के रूप में 0 मिनट पर लेबलिंग 60 मिनट पर की तुलना में स्पष्ट रूप से उज्जवल है, पृष्ठभूमि घटाव के बाद भी photobleaching को नियंत्रित करने के लिए। यह रिलीज बहुत PO हैlatrotoxin द्वारा tentiated, एक काले रंग की विधवा मकड़ी के ज़हर घटक है, जो अनियंत्रित पुटिका exocytosis हो सके। विष में 60 मिनट के बाद, टर्मिनल लेबलिंग लगभग undetectable है। styryl डाई लेबलिंग के इस उलटने परिकल्पना है कि टर्मिनल प्रतिदीप्ति synaptic-तरह पुटिकाओं के स्थानीय रीसाइक्लिंग के दौरान internalization की वजह से है समर्थन करता है। स्केल बार 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
Bewick और Betz मूल एन (3-triethylammoniumpropyl) -4 (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium Dibromide से संबंधित styryl pyridinium रंगों 7-10 synaptic पुटिका झिल्ली की स्थानीय रीसाइक्लिंग की निगरानी के लिए विकसित की है। डाई तेज, और इसलिए वृद्धि हुई प्रतिदीप्ति, इसलिए synaptic पुटिका झिल्ली internalization (endocytosis) को दर्शाता है। बाद में, इस भाँति डाई आगे बिजली की गतिविधि द्वारा फिर से जारी किया जा सकता है, डाई नुकसान दिखा पुटिका झिल्ली externalization (exocytosis) नजर रखता है। synapses में, इस न्यूरोट्रांसमीटर स्राव के लिए एक प्रॉक्सी है। एक ही समय में, हम यह भी पाया गया है इन रंगों प्राथमिक mechanosensory तंत्रिका अंत 7 लेबल। अभी हाल ही में 11, Bewick, बैंकों और उनके सहयोगियों तो पता चला कि यह परिपक्व, विभेदित mechanosensory टर्मिनलों पूर्व vivo में एक इसी तरह की प्रक्रिया को दर्शाता है। यहाँ फिर से, रंगों 50 एनएम व्यास 'synaptic की तरह' पुटिकाओं (SLVs) कि अनिवार्यता से रीसायकल ग्लूटामेट जारी करने के लिए लेबल।mechanosensory टर्मिनलों में, उनके synaptic समकक्षों के विपरीत, इस रीसाइक्लिंग मुख्य रूप से सहज है। यह भी यांत्रिक, के बजाय सिर्फ बिजली, उत्तेजना से ठीक किया जाता है।
संस्कृति और कोक्लीअ बालों की कोशिकाओं, सामान्य और विशेष रूप styryl pyridinium डाई में styryl रंगों में संवेदी न्यूरॉन्स के लिए mechanosensory चैनलों के माध्यम से पारित करने के लिए दिखाया गया है, mechanosensory चैनलों अवरुद्ध और अचल आंतरिक झिल्ली 12 लेबलिंग। हालांकि, मांसपेशियों स्पिंडल 11 में बगल में विभेदित mechanosensory टर्मिनलों, यहाँ के रूप में तुलनीय styryl डाई सांद्रता भाले के आकार अंत 2, या आइए अंत में, पर और बालों की कोशिकाओं है कि यंत्रवत् प्रेरित नहीं कर रहे हैं 13, 14 में, लेबलिंग झिल्ली endocytosis के द्वारा होता है। Mechanosensory तंत्रिका टर्मिनलों में, उदाहरण के लिए, लेबलिंग प्रतिवर्ती है और यहां इस्तेमाल किया 2, 11, 1 सांद्रता में mechanosensory प्रतिक्रियाओं ब्लॉक नहीं करता5। जबकि इन अंत में चैनल पारगमन द्वारा कुछ डाई internalization पूरी तरह से इंकार नहीं किया जा सकता है, latrotoxin साथ पास कुल destain इंगित करता है परिपक्व टर्मिनलों में लेबलिंग के महान बहुमत रीसाइक्लिंग पुटिका झिल्ली के साथ internalization के द्वारा होता है। इसलिए हमने, इस तकनीक गतिविधि निर्भरता 11 अध्ययन करने के लिए, mechanosensory अभिवाही टर्मिनलों में एसएलवी रीसाइक्लिंग के औषध विज्ञान 2 तेज और रंगों की रिहाई पर दवा के प्रभाव का परीक्षण करके इस्तेमाल किया और, सबसे हाल ही में।
सबसे व्यावहारिक तकनीकों के साथ के रूप में, reproducibility पुनरावृत्ति और अभ्यास की आवश्यकता है। विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण बिंदुओं में से कुछ अब चर्चा की जाएगी। छोटे जानवरों में भाले के आकार लेबलिंग और अधिक विश्वसनीय है - छोटी जानवर हम इस्तेमाल किया है 15 ग्राम शरीर के वजन था। यह पूरी तरह स्पष्ट है कि क्यों यह मामला है नहीं है, लेकिन यह हो सकता है क्योंकि युवा संयोजी ऊतक के विच्छेदन कम यांत्रिक आघात और le की आवश्यकता हैएविस कम अवशेषों शेष जब ऊतकों इन्नेर्वतिओन परत को हटाने overlying।
कुल मिलाकर, ऊतक तैयारी केवल बड़े चूहों में अलग त्वचा की परतों छीलने जा रहा है सबसे तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण व्यावहारिक पहलू और फिर साथ काफी सरल है। इन में, त्वचा की परतों के आधार पर दृढ़ता से एक साथ पालन जहां विच्छेदन शुरू होता है, लेकिन यहां भी परतों की जुदाई मार्जिन के प्रति ज्यादा आसान हो जाता है। शुक्र है, या शायद नतीजतन, इन पतले सीमांत क्षेत्रों में आमतौर पर त्वचा सबसे संतोषजनक लेबलिंग, के रूप में आम तौर पर पूर्वकाल त्वचा करता दे। इसलिए, विशेष रूप से हाशिये पर बहुत पतली त्वचा लोभी से बचें। नुकसान के जोखिम को कम करने के बजाय बंद संदंश के साथ धक्का सीधे लोभी द्वारा परोक्ष रूप से तैयारियों में हेरफेर, या आवश्यक समझ ही मुश्किल संभावना नहीं ऊतकों लेबल किया जा रहा है। 'चादर polystyrene' परत को हटाने के तुरंत के रोम overlying में पूरी तरह से, यह मुख्य रूप से मुझे हैइमेजिंग और नशीली दवाओं का उपयोग करने के लिए chanical बाधा। हालांकि, यह और बस के नीचे इस नुकसान के रूप में आधारभूत संरचनाएं (यानी, दूर स्ट्रिप्स) तंत्रिका नेटवर्क टर्मिनलों के साथ शारीरिक संपर्क को कम करने के लिए आवश्यक है। अगर प्रमुख प्रतिदीप्ति पीला / वसामय ग्रंथियों में सफेद है, बाल शाफ्ट कुर्सियां और नारंगी / पीले भाले के आकार अंत के कुछ crescents की प्रमुख ऑटो प्रतिदीप्ति, यह तंत्रिका जाल परत और संबद्ध भाले के आकार टर्मिनलों निकासी के दौरान हटा दिया गया है इंगित करता है। यह पुराने (> 30 ग्राम) चूहों के साथ मुख्य समस्या प्रतीत होता है। धुंधला प्रक्रियाओं के दौरान, यह सुनिश्चित सब कुछ 30 डिग्री सेल्सियस पर है और अच्छी तरह से ऑक्सीजन। पता है कि लेबल टर्मिनलों अभी भी जीवित हैं बनें। नतीजतन, डाई चल रही सहज (विधान) exocytic रिहाई के द्वारा स्रावित कर दिया जाएगा। यह आर / टी पर धीमी हो जाएगी, लेकिन यह डाई नुकसान को कम करने, chelator समाधान और इमेजिंग के हटाने के बीच देरी को कम करने के लिए अच्छा अभ्यास है। इसके अलावा, के लिए बीच-समूहों तुलनात्मक रोंतीव्रता के tudies, यह सभी समूहों की इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए जरूरी है समय से मिलान है। इमेजिंग से पहले एक डाई-chelating एजेंट का उपयोग बहुत छवि के विपरीत सुधार। तो, जबकि अपेक्षाकृत महंगा है, केलेशन कदम अच्छी छवि गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए काफी महत्वपूर्ण है। Chelator उपयोग समाधान के लिए कई बार पुन: उपयोग करके कम से कम किया जा सकता है, और यहां तक पर 2 - 3 लगातार दिन, अगर उपयोगों के बीच 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत। chelator समाधान त्यागें एक बार यह काफ़ी गुलाबी हो जाता है, इसकी डाई ज़ब्ती संतृप्ति आ रहा है दिखा।
इमेजिंग के दौरान, इन रहने वाले टर्मिनलों के लिए phototoxic क्षति है, जो दोनों तीव्रता और उत्तेजना प्रकाश का जोखिम समय की संचयी परिणाम है के लिए क्षमता के बारे में पता हो। यह विचार ही timepoint छवियों, जहां छवि गुणवत्ता प्राथमिक चिंता का विषय है के लिए कम महत्वपूर्ण है। हालांकि, यह एक न्यूनतम करने के लिए उत्तेजना प्रकाश जोखिम को कम करने के कैनेटीक्स अध्ययन में दोहराया इमेजिंग के दौरान महत्वपूर्ण है। जबकि करने के लिए इन रंगों के विकासलेबल synapses, हम पूरी शक्ति उत्तेजना रोशनी में> 1 मिनट तंत्रिका टर्मिनलों के लिए नाटकीय और अपूरणीय क्षति होगी लिए उत्तेजना पाया। वे पहली बार बाद में बेहद विस्तार, फिर ~ से 15 मिनट की अवधि में पूरी तरह से पतन। हम व्यवस्थित जोखिम समय और तीव्रता के रिश्तेदार योगदान परीक्षण नहीं किया है, लेकिन इन टिप्पणियों का सुझाव मार्गदर्शक सिद्धांत दोनों को कम से कम करने के लिए किया जाना चाहिए। इसलिए, यह सिफारिश की है कि उत्तेजना प्रकाश की तीव्रता और अवधि कम से कम अच्छा छवियों के साथ हो रही अनुरूप हैं, और उचित नियंत्रण छवियों समय पाठ्यक्रम के अध्ययन में लिया जाता है। जांचने के लिए कि डेटा दोहराया इमेजिंग शर्तों के तहत phototoxicity से प्रभावित नहीं हैं हर समय बिंदु पर, एक पहले से unviewed टर्मिनल के एक अतिरिक्त छवि ले। यह सुनिश्चित करने के लिए अनुभवहीन टर्मिनलों में लेबलिंग के व्यवहार जैसा दिखता है कि रोम में बार बार imaged किया जा रहा है।
कारकों की एक संख्या शुद्ध तीव्रता डी के भीतर-समूह परिवर्तनशीलता को कम कर सकते हैंअता। रूप में चिह्नित करें धुंधला की भी छोटे क्षेत्रों में काफी बीच-कूप डेटा परिवर्तनशीलता को प्रभावित कर सकते ROIs के सटीक स्थान में, विशेष रूप पृष्ठभूमि रॉय, महत्वपूर्ण है। शुद्ध तीव्रता की परिवर्तनशीलता भी कैसे पूरी तरह से एक बाल कूप अंत के कटघरा से घेर लिया है से प्रभावित है। उदाहरण के लिए की तुलना करें, लगभग पूरी तरह से परिपत्र पैटर्न चित्रा 2 में देखा के साथ चित्रा 1 बी में अर्द्ध चंद्राकार आकार लेबलिंग वितरण। अधिक जटिल विश्लेषण, शायद स्वचालित सॉफ्टवेयर का पता लगाने और thresholding का उपयोग कर, आवश्यक हैं यदि घेरा की डिग्री एक प्रासंगिक पैरामीटर है। कृपया ध्यान दें कि यहां तक कि सबसे सही विश्लेषण किया कूप समूहों के लिए तीव्रता वितरण सामान्य रूप से वितरित नहीं किया है (चित्रा 3 देखें), बीच-उपचार का मतलब आबादी medians के बजाय की तुलना के लिए गैर पैरामीट्रिक आँकड़ों के उपयोग की जरूरत महसूस। इस तरह के एक प्रतिशत के रूप में ओ तीव्रता व्यक्त के रूप में सामान्य बनाने की तकनीक,एफ contralateral नियंत्रण, या एक नियंत्रण समूह के कई तैयारियों के ऊपर, आगे परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए लागू किया जा सकता बना दिया। अंतिम तकनीकी आइटम पर विचार किया जाएगा औषधीय परीक्षण के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन है। औषधीय जांच के दौरान डाई आवेदन से पहले 30 मिनट के लिए दवा के घोल में तैयारी पूर्व सेते हैं। फिर, डाई समाधान में दवा एकाग्रता बनाए रखें। नियंत्रण में, या तो खारा का उपयोग करें या, अगर दवा एक वाहन, खारा प्लस वाहन में भंग कर रहा है।
वर्तमान लेख दर्शाता है कि कैसे इस नए पंख तैयारी न्यूनतम तैयारी के साथ त्वचा में mechanosensory अंत की उच्च गुणवत्ता के चित्र प्रदान करता है। हम भी यह पुटिका रीसाइक्लिंग के दो महत्वपूर्ण पहलुओं में से औषध विज्ञान की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता दिखा। हम पहले बताते हैं कि एक ग्लूटामेट रिसेप्टर agonist डाई internalization (endocytosis के एक मार्कर) में वृद्धि कर सकते हैं, और दूसरा, कि डाई latrotoxin (exocytosis की एक उत्तेजक) के साथ फिर से खो दिया है। इस preparat का महत्वआयन और तकनीक है कि यह इमेजिंग प्रयोगों के लिए बगल में त्वचा mechanosenory टर्मिनलों रहने वाले, टर्मिनल समारोह, संरचना और उनके अंतर-संबंधों के ऑप्टिकल निगरानी के लिए अद्वितीय अवसर affording के लिए उत्कृष्ट पहुँच प्रदान करता है। इस बाद अंत करने के लिए, हम भी इसे आगे संयुक्त ऑप्टिकल / electrophysiological अध्ययन (विवरण के लिए बहन जौव लेख) में उपयोग के लिए विकसित किया है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
काम जीएसबी के लिए ब्रिटेन चिकित्सा अनुसंधान परिषद परियोजना अनुदान G0601253 और RWB और जीएसबी के लिए एक SULSA Bioskape अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS - Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera - basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
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