Abstract
Um romance técnica de dissecção ea gravação é descrita para a coloração de monitorização óptica e de tirar manchas de terminais lanceoladas circundantes folículos pilosos na pele do pavilhão auricular mouse. A preparação é simples e relativamente rápido, produzindo de forma confiável extensas regiões de múltiplas unidades rotulados de viver terminais nervosos para estudar a absorção e liberação de corantes pirid�nio estirilo amplamente utilizados em estudos de reciclagem de vesícula. Subdividindo os preparativos antes da rotulagem permite teste vs. comparações de controle na mesma orelha de um único indivíduo. dicas úteis são dadas para a melhoria da qualidade da preparação, a marcação e os parâmetros de imagem. Este novo sistema é adequado para ensaiar farmacologicamente e absorção e liberação desses corantes vitais em terminais lanceoladas, tanto do tipo selvagem e animais geneticamente modificados mecanicamente induzida. Exemplos de influências moduladoras de intensidade de marcação são dadas.
Introduction
Terminações nervosas mecanosensorial são tipicamente pequenos, difusamente distribuídos e de difícil acesso in situ, como eles são geralmente enterradas profundamente na pele ou outros tecidos circundantes. Visualizá-los, portanto, geralmente requer seccionamento seguido por um imunomarcação prolongado / período de coloração, ou a demora eo custo de obtenção de linhas de rato com expressão genética de marcadores fluorescentes, tais como a proteína fluorescente verde ou amarela (GFP / YFP) 1. Aqui nós mostramos um tecido conveniente e um método rápido e simples para ter acesso a um grande número de aferentes do folículo piloso para estudo, e como eles podem ser rapidamente marcado para o monitoramento óptico da função terminal 2. Com a prática, toda a técnica de dissecção a imagem pode ser concluída em menos de 2 horas.
Os terminais de axónios lanceoladas sensoriais que inervam folículos de cabelo em mamíferos formar paliçadas todo o epitélio do cabelo folicular, com cadaterminal de imprensado entre células / Schwann glial processa 2-4. A finalidade dos terminais é detectar deslocamento mecânico dos pêlos que cercam. Eles são uma mistura de terminações rapidamente e de adaptação lenta, mas eles produzem predominantemente curtos períodos de actividade em resposta ao movimento do cabelo. Tipicamente, o disparo pára muito rapidamente quando o movimento cessa, mesmo na presença de deslocamento continuado.
Este modelo murino pavilhão auricular para estudar terminais lanceoladas por métodos ópticos tem muitas características vantajosas para o estudo da estrutura e função dessas terminações. O pavilhão é predominantemente duas camadas da pele apposed back-to-back, com apenas uma pequena quantidade de tecido de cartilagem entre os dois. A pele é muito fina e facilmente dissecado devido a quantidades mínimas de tecido conjuntivo fracamente adesiva em relação a outras regiões do corpo. As camadas de pele facilmente separados, portanto, dar um bom acesso para os folículos e terminais. a inervaçãoé facilmente acessível e identificável. Os folículos pilosos são mais esparsamente distribuído do que em outras regiões da pele, facilitando a imagem de indivíduos ou pequenos grupos de folículos. A camada dérmica subjacente fina dá uma boa acessibilidade aos corantes e drogas farmacológicas, por isso é ideal para geração de imagens por microscopia de fluorescência no estado inalterado. A imagem de terminais marcados podem ser tanto de terminais vivos ou, se estiver usando um análogo do corante solucionáveis, após a fixação e posterior processamento histológico.
Usámos esta preparação para mostrar que a membrana de reciclagem ocorre nas terminações lanceoladas, evidenciado por absorção (endocitose) e libertação (exocitose) de um corante de estirilo piridínio (FM1-43; N - (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) estiril) piridínio dibrometo). O corante não, no entanto, parecem rotular significativamente a célula de Schwann investir processa 2. Também mostramos que esta absorção do corante / release e, portanto, membrana reciclagem, está sujeita a modulação glutamatérgica através de um receptor de glutamato metabotrópico atípica (fosfolipase D-acoplado). Os resultados de protocolos de estimulação e análise simples são ilustrados, e as questões de análise de potenciais comuns também são destacados.
Protocol
Estes métodos foram utilizados na pesquisa, publicada em Bancos, RW et ai. 2 Os ratos foram humanamente eutanasiados por deslocamento cervical. No Reino Unido, esta é uma Anexo 1 método legalmente aprovado listado nas Animais (Scientific Procedures) Act de 1986 e da Directiva Europeia 2010/63 / UE. Esta legislação federal é aplicada localmente na Universidade de Aberdeen pelo Bem-Estar Animal e Ethical Review Board, que aprovaram todos os procedimentos.
1. Orelhas preparando para Labeling
- Prepara-se uma solução salina fisiológica convencional, tal como de Liley (1956) 5 e satura com 90% de O2 / 5% de CO 2 (carbogénio). Solução salina de Liley é (mM): NaHCO3 (12), KCl (4), KH 2 PO 4 (1), NaCl (138,8), MgCl2 (1), CaCl2 (2) e glicose (11). NOTA: Durante o resto deste manuscrito, "salina" irá referir-se a solução salina que está totalmente saturado com carbogênio. durante dissection, atualizar a solução salina cobrindo a preparação a cada 15 - 20 min.
- Humanamente sacrificá um rato adulto sem danificar o crânio. NOTA: Nós usamos ratos C57 / Bl6J e MF1, mas qualquer tensão mouse pode ser usado. O aspecto mais importante é não usar grandes adultos (> 25 g). Rotulagem em camundongos maiores é menos confiável, sendo muitas vezes confinados a pequenas e dispersas grupos de folículos.
- Retire as orelhas externas (pavilhões auriculares) perto da base com ~ 25 cm tesoura, logo acima da linha do cabelo denso, e mergulhe em solução salina em um silicone revestido de borracha cultura / placa de Petri (50 mm são geralmente conveniente).
- Posição anterior lateral (côncava) o pavilhão auricular para baixo e fixar as margens para o silicone em intervalos regulares com pinos finos de insectos (~ 6 - 8 por orelha, ~ 0,2 mm de diâmetro pinos). Atualizar salina a cada 15 - 20 minutos, ou usar um banho constantemente perfundidos.
- Retire cuidadosamente afastado a pele posterior da pele anterior por dissecção romba, inicialmente aceder a partir da base de corte da orelha sobrea cartilagem central grosso e sistematicamente a trabalhar para as margens externas finas, livre de cartilagem.
- Para fazer isso, mantenha o centro da aresta de corte da pele posterior com um par de nenhuma. 3 fórceps. Em seguida, com as mandíbulas fechadas, colocar os pontos de um outro conjunto de nenhuma. 3 fórceps no espaço entre a pele ea cartilagem subjacente.
- Suavemente trabalhar os pontos de pinça fechadas a partir de lado-a-lado no interior da abertura, por meio da força mínima necessária, cuidadosamente solte enquanto aderências descascar a pele posterior a separar as camadas.
- Com a pele posterior removida, deixar a pele anterior em posição. Pin a pele posterior, o lado dérmico-se, ao lado da pele anterior (conforme 1.5, acima).
- Em seguida, cuidadosamente e remover completamente a cartilagem do pavilhão que foi ensanduichada entre as camadas da pele a partir da pele anterior pela mesma técnica de dissecção romba como em 1.6. Evitar fazer furos com a pinça.
- Em seguida, fou ambas as preparações para a pele delicadamente Pinna casca, coragem e esfregar a fina camada de tecido conjuntivo, assemelhando-se espuma de poliestireno expandido, que cobre as bases do folículo piloso. NOTA: A obtenção de compensação ideal pode demorar um pouco de prática; remoção insuficiente de tecido obstrui o acesso, tanto para a solução de corante e para geração de imagens, enquanto raspagem demasiado vigorosa remove as redes neurais, que estão na base dos folículos.
- Atualizar a solução salina.
Rotulagem 2. Lanceolate Terminal
NOTA: O seguinte protocolo é otimizado para corante de estirilo piridínio. Outros, quimicamente semelhantes, corantes pirid�nio estirilo deve funcionar, talvez depois de algum ajuste na concentração e tempo de incubação. Use luvas e uma bata de laboratório ao manusear soluções de corantes. Ou comprar solução de corante 10 mM diretamente do fabricante ou preparar estoque dissolvendo o pó de corante em solução salina sem glicose. Alíquota (10 mL é geralmente conveniente, mas ajustar isso para a grande scale experimentos) e armazene congelado por até 6 meses a -20 ° C ou ~ 1 ano a -80 ° C. Pó irá armazenar durante pelo menos 2 anos. Evite congelamento repetido / descongelamento de soluções de corantes; este desnatura-se rapidamente o corante. Uma vez descongelado, armazenar a 4 ° C e usar dentro de uma semana.
- Pré-aquecer num banho de água a 30 ° C, com uma plataforma de ~ 3-5 mm abaixo da superfície da água.
- Recém preparar 10 mM solução estiril piridínio corante (10 ul de corante de estirilo piridínio 10 mM recém-descongelado em 10 ml de solução salina) e equilibrar em banho-maria.
- Pin cada preparação de um silicone de borracha forrada 35 mm de placas de cultura submersa em 1 - 2 mm de solução salina (volume típico, ~ 2 ml). Cada preparação da pele do pavilhão auricular irá produzir duas preparações se cortar pela metade a partir do vértice à base com uma tesoura pequena (10 - 15 cm de comprimento), para minimizar a utilização de animais.
- Colocar as cápsulas de 35 mm contendo as preparações Pinna coberta com solução salina na plataforma submersa no 30 ° C banho-maria. garantir aa profundidade da água é suficiente para o aquecimento adequado, mas não contamina a solução salina no prato aberto.
- Bem Pin (0,5 - diâmetro exterior 1 mm) tubulação com fluxo O 2 / CO 2 para a base de silicone de cada prato para o gás de forma contínua os preparativos. Também coloque em banho-maria 100 ml de solução salina livre de corante para refrescante lavagem / prato. Use uma garrafa com rolha firmemente para manter a saturação carbogênio e prevenir a contaminação da água.
- Equilibrar tudo a 30 ° C durante 30 min e depois substituir a solução salina sobre as preparações de Pinna os 100 ml recipiente rolhado. Incubar mais 30 minutos. NOTA: Esta substituição compensa a evaporação de solução salina e quaisquer perdas de volume em massa resultantes da linha de gás borbulhante.
- Deite fora salina livre de corante em um 100 ml copo de resíduos, em seguida, rapidamente e cuidadosamente apagar afastado qualquer líquido restante em torno da preparação com papel de seda para minimizar os efeitos de diluição na solução de corante para ser adicionado ao lado. Tome cuidado para não tocar (
- Incubar preparações Pinna em 2 - 3 ml de 10 uM de corante de estirilo piridinio durante 40 min a 30 ° C, em seguida, voltar para o R / T para o resto do procedimento.
- Remover o corante não-internalizado em três etapas, usando soluções em R / T. NOTA: Estes passos são melhor realizadas em luz mínima ambiente (persianas, vermelho / laranja iluminação baixa intensidade) para começar a olho escuro-adaptação para a imagem latente.
- Deite fora a solução de rotulagem dos pratos em um copo de resíduos e rapidamente enxaguar em três mudas de solução salina livre de corante em rápida sucessão. Isto remove a solução de corante de estirilo piridínio residual aderente às preparações e qualquer corante que facilmente departitions a partir de membranas expostas.
- Incubar numa mudança final de solução salina livre de corante durante mais 30 min para departition corante mais restante a partir de membranas de superfície, isto é, não corante internalizado pelos terminais.
- Remover corante persistente preso tO folheto externa das membranas expostas por quelação com o derivado sulfonado b-ciclodextrina (ADVASEP-7, 1 mM, 5 min - ver Tabela 1). Assim, todos os restantes corante estará dentro dos tecidos.
- Colocar em solução salina livre de corante fresco para imagiologia e secar o exterior do prato cuidadosamente com papel de seda.
NOTA: Os terminais estão agora prontos para a imagem latente. É importante estar ciente de que as terminações lanceoladas estão vivos e, portanto, liberando lentamente o corante piridínio estiril endocitado novamente. Embora esta será mais lenta em R / T, é importante para minimizar os atrasos antes / durante a imagem. Se a experiência exige a rotulagem de várias preparações, inicialmente manter todos eles não marcado a 30 ° C. Eles vão ser viável por várias horas. Em seguida, rotular sequencialmente em intervalos, ao rotular o segundo preparação (passos 2.7 - 2.8.3), enquanto imagem da primeira.
3. Imagem Rotulado Lanceolate Endings.
NOTA: O observadordeve ser escuro-adaptado para as seguintes etapas de imagem. O aumento da acuidade visual este proporciona significa que os níveis mais baixos de luz de excitação são necessários para encontrar os folículos para a imagem latente. Isso é mais importante para minimizar fototoxicidade em vez de reduzir a inconveniência de fotodegradação. Os radicais livres gerados pela iluminação intensidade total pode rapidamente (dentro de 60 seg) matar vivendo terminais nervosos (GS Bewick, S. Fadul e WJ Betz, observações não publicadas).
- Antes de imagem, verifique a preparação sob um microscópio estereoscópico de dissecação e remova cuidadosamente quaisquer detritos superfície. Isto impede a auto-fluorescência contaminando as imagens.
- Monte o prato no palco de um microscópio de epifluorescência na posição vertical com um conjunto de filtros de fluoresceína padrão (480-488 nm de excitação, 500-520 nm de emissão para estiril corante piridínio).
- Atenuar a intensidade da luz de excitação com filtros de densidade neutros até que apenas o suficiente para localizar o terminal confortavelmentes.
- Localize folículos rotulados, observando com baixa (3,5x - 4x objetivo seco), em seguida, progressivamente objetivos maiores (objetiva de imersão 10x e 20x de água) de ampliação.
- Capturar imagens de terminais lanceoladas marcados através de 10x objetivo seco para baixa potência e 20x objetivos de imersão em água para maior ampliação. Minimizar a luz intensidade e tempo de exposição (a tempo de integração da câmera de 0,5 - é sugerido 1 seg).
- Capturar imagens em uma câmera digital padrão e salvar imagens no disco rígido do computador utilizando o software proprietário. NOTA: Um exemplo típico é mostrado na Figura 1.
- Imagem ~ 20 terminações lanceoladas de cada preparação. Comece pelo mais distante margem a partir da borda corte na base da pele do pavilhão auricular e do trabalho ao longo desta margem de imagiologia cada folículo, por sua vez. Trabalhar transversalmente em ligeiramente sobrepostos campos paralela à borda do corte, tomando cuidado para não imagem do mesmo folículo duas vezes e as que são, obviamente, danificado. Note ore são tipicamente muitos terminais lanceoladas a imagem todos eles antes significativa espontânea de-coloração ocorre. Assim, sugerimos que sistematicamente amostragem da população usando o seguinte protocolo.
- Depois de completar a tira marginal, mover um campo de largura em direcção à base do pavilhão, e repetir o processo no sentido inverso.
- Imagem todos os terminais encontrou, exceto os ocasionais claramente orientados muito mais obliquamente ao plano óptico e improvável para caber inteiramente dentro do ROI análise anular padrão (ver secção 4). Não excluem lanceolates excepcionalmente brilhantes ou dimmer em comparação com os terminais vizinhos, a menos que eles são, obviamente, danificado ou intensidade fundo é particularmente elevado, indicando dano tecidual localizada.
- Descartar a preparação, se mais do que 10% da área de pele / terminais estão danificados / inutilizável. NOTA: Como lanceolates Destain com o tempo, a imagem completa de cada preparação dentro de 20 minutos do final da lavagem.
- Euf usando mais de uma preparação, garantir comparações intensidade são válidos por preparações de correspondência de tempo. Para fazer isso, compensar horários de coloração cada preparação por ~ 30 min, para assegurar a comparabilidade dos tempos de-mancha.
- Para monitorar de-mancha (exocitose), a imagem do mesmo terminal em intervalos de 5 ou 10 min. Com a prática, é possível para a imagem até 3 terminais separados em cada ponto no tempo em qualquer uma preparação.
4. Análise Rotulado Lanceolate Endings.
Nota: O procedimento que se segue é um método rápido para analisar a intensidade do terminal.
- Realizar uma região anelar de interesse (ROI) centrado na ponta do eixo do cabelo na base do folículo (Figura 2). Definir a circunferência interna do ROI anular grande o suficiente para evitar o eixo do cabelo auto-fluorescência em qualquer folículo a ser analisado, mas ainda abranger toda a fluorescência do terminal. Certifique-se que a circunferência externa é grande o suficiente para envolver o maior terminai que poderão ser encontrados que está orientada para próximo do eixo óptico / folículo principal.
- Adicione uma ROI fundo aproximadamente igual em área alvo para o anel tubular (quadrado ou círculo, tipicamente ~ 400? M 2) para determinar a intensidade da coloração local, na vizinhança do terminal em análise.
Nota: Os tamanhos destes dois ROIs são definidas no início da análise e utilizado para analisar todos os folículos / terminais lanceoladas subsequentes em todas as preparações em qualquer experiência. Então, é importante para definir os seus parâmetros com cuidado no início. - Coloque o ROI de fundo perto o suficiente para o folículo para representar fundo local nas glândulas sebáceas que estão na base dos terminais, não a pele menor intensidade entre os folículos, mas tome cuidado para não incluir quaisquer regiões terminais.
- Grave a intensidade média das duas ROIs usando o 'medida' ou 'analisar ROI' função do software e transferência de dados para uma planilha.
- Na planilha, para cada folículo indivíduo subtrair o local de intensidade média de fundo do que no anel para dar uma intensidade líquida. Este ajustamento para o fundo localizada reduz bastante variabilidade entre folículo.
Representative Results
Os folículos pilosos desta preparação pavilhão auricular são facilmente visíveis em transillumination sem fluorescência (Figura 1A), que ilustra a natureza extremamente fino da preparação e da relativa facilidade de acessibilidade que proporciona a estes terminais mecanosensorial. Cada um é tipificado pela base eixo do cabelo proeminente perfurando o crescente escuro da glândula sebácea. Sob epifluorescência, os terminais lanceoladas marcados em torno de cada folículo de cabelo e são claramente vistas mostram a absorção de corante de estirilo espontânea tipicamente robusta (Figura 1B). Isso ocorre sem movimento imposto. Os terminais lanceoladas são vistos para circundar o eixo do cabelo, embora o grau de cerco é variável 6. Grande parte do rótulo é pontuada (manchas), em vez de o arranjo linear que poderia ser esperado. O padrão salpicado de pontos terminais reflecte a ser observada num plano óptico ao longo do comprimento do terminal. This preparação recebeu nenhum processamento adicional para visualização após a marcação, foi simplesmente transferido para um estágio de microscópio e fotografada in situ, o que novamente ilustra a simplicidade desta preparação.
Exemplo experiências para que esta nova preparação é adaptado são mostrados na Figura 3. Ele pode ser usado para estudar tanto a endocitose e a exocitose em terminais vivos, bem como a sua modulação. Assim, para a endocitose, agonistas do receptor de glutamato pode aumentar a intensidade de rotulagem, enquanto bloqueia canais de Ca2 + com ligandos ou catiões tais como Mg 2+, Ni 2+ ou Cd 2+ diminui-lo 2. Alternativamente, esta preparação pode também ser utilizado para estudar a cinética da exocitose, como mostrado na Figura 3C. Primeiro, um terminal marcado é visto de-coloração espontaneamente. No entanto, este destain é acelerada pela estimulante exocitose, latrotoxin. mais decaudas dos resultados experimentais podem ser observados em Bancos, RW et ai. 2.
Figura 1. Robust Estiril Dye Labeling Gravado no mouse Pinna. (A) Parte de uma preparação pavilhão auricular não marcado em iluminação de campo brilhante, mostrando como claramente folículos pilosos aparecem em áreas desmatadas do que recobre tecidos areolar / adiposas. Os, geralmente bilobado, formas crescentes escuras são glândulas sebáceas em torno do eixo do cabelo central. (B) uma área semelhante, com uma ampliação ligeiramente superior e fotografada com epifluorescência, mostrando terminações lanceoladas marcadas com corante de estirilo. Barras de escala -. 40 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2. Análise da Estiril Dye Labeling Intensidade. (A) padrão circular típica de rotulagem do folículo de cabelo com corante de estirilo, centrado no eixo do cabelo (não visível nesta imagem). (B) «região de interesse» A análise principal (ROI) é definida por um anel tubular padrão sobrepor a posição da paliçada de terminações nervosas lanceoladas circundando o folículo. Este ROI é mantida constante em forma e área para qualquer única experiência para garantir intensidade de marcação podem ser comparados de maneira justa entre os preparativos e em todos os tratamentos. Intensidade líquida de cada ROI é calculado subtraindo-se a intensidade de uma região de fundo quadrado ou circular adjacente (~ 400? M 2). Mais uma vez, esta região de fundo quadrado é mantido constante em forma e área ao longo de qualquer dada experiência.target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Rotulagem Intensidade do folículo de cabelo aferentes Lanceloate Endings não é normalmente distribuída, e pode ser usado para examinar Ambos endo e exocitose. Dados típicos de medições de intensidade estiril corante em terminais lanceoladas espontaneamente rotulados usando o método descrito acima. (A) a intensidade de Etiquetagem em condições de controle (54 folículos, 4 orelhas) e glutamato 1 mM (42 folículos, 4 orelhas). Os valores de intensidade de terminações individuais são apresentados como gráficos de pontos de cluster. Cada ponto representa a intensidade de uma paliçada de terminal em torno de um folículo. Note-se que, mesmo sob condições de controle poucos pontos de dados (folículos) são extremamente intensa, enquanto a maioria são agrupados em intensidades mais baixas. O primeiro ponto em um determinado intensdade é representada no centro e os pontos de dados subsequentes da mesma intensidade são traçados progressivamente mais lateralmente em ambos os lados. Assim, espalhamento lateral representa a frequência de folículos de qualquer intensidade de marcação particular. As linhas horizontais representam mediana intervalo interquartil ± 25%. A incubação com glutamato 1 mM aumenta a intensidade média de ~ 50% (*** P <0,001, Mann-Whitney), mas rotulagem pode ser reforçada por 200-300%, em alguns terminais. (B) As imagens que demonstram a absorção de corante melhorada mediada por glutamato (endocitose). A incubação da preparação do folículo de cabelo em glutamato (1 mM) aumenta acentuadamente a absorção do corante de estirilo, como demonstrado pelo aumento da intensidade de etiquetagem. Barra de escala 20? m. (C) aumentar a libertação de corante (exocitose). Após a marcação, corante de estirilo é espontaneamente liberada novamente, como a rotulagem a 0 min é claramente mais brilhante do que a 60 min, mesmo após a subtracção de fundo para controlar a fotodegradação. Esta versão é muito potentiated por latrotoxin, uma viúva negra veneno da aranha constituinte, o que desencadeia a exocitose da vesícula descontrolada. Depois de 60 min em toxina, rotulagem do terminal é quase indetectável. Essa reversibilidade da rotulagem estiril corante suporta a hipótese de que a fluorescência do terminal é devido à internalização durante reciclagem local das vesículas sinápticas-like. Barra de escala de 20 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Bewick e Betz originalmente desenvolvido a N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) estiril) piridinio-dibrometo relacionada corantes de estirilo piridínio 7-10 para monitorizar reciclagem local da membrana de vesículas sinápticas. a absorção do corante, e, consequentemente, aumento da fluorescência, portanto, reflete a internalização da membrana das vesículas sinápticas (endocitose). Posteriormente, este corante internalizado pode ser re-lançado por uma maior atividade elétrica, que mostra a perda de corante monitora externalização membrana da vesícula (exocitose). Em sinapses, este é um proxy para a secreção de neurotransmissor. Ao mesmo tempo, também encontramos estes corantes rotular terminações nervosas mecanosensorial primários 7. Mais recentemente 11, Bewick, Banks e seus colegas, em seguida, mostrou que isso reflete um processo semelhante em maduros terminais, diferenciadas mecanosensorial ex vivo. Aqui, novamente, os corantes rotular 50 nm de diâmetro vesículas sinápticas "-like" (SLVs) que reciclam constitutivamente para libertar glutamato.Em terminais mecanosensorial, ao contrário dos seus homólogos sinápticos, esta reciclagem é principalmente espontânea. Também é modulada por processos mecânicos, em vez de simplesmente eléctrica, a estimulação.
Para neurónios sensoriais em cultura e em células capilares cóclea, corantes de estirilo em geral e corante de estirilo piridínio, em particular, têm sido mostrados para passar através dos canais mecanosensorial, bloqueando os canais mecanosensorial e rotulagem irreversivelmente membranas internas 12. No entanto, em concentrações estiril corante comparáveis em terminais mecanosensorial diferenciadas in situ, como aqui em terminações lanceoladas 2, ou em terminações Ia em fusos musculares 11, e em células de cabelo que não são mecanicamente estimuladas 13, 14, a rotulagem é por endocitose membrana. Nos terminais nervosos mecanosensorial, por exemplo, a rotulagem é reversível e não bloqueia as respostas mecanosensorial nas concentrações utilizadas aqui 2, 11, 15. Enquanto alguns internalização corante por permeação canal nessas terminações não pode ser completamente descartada, o destain quase total com latrotoxin indica a grande maioria da rotulagem em terminais maduros é de internalização com membrana de reciclagem de vesícula. Temos, portanto, usou esta técnica para estudar a dependência atividade 11 e, mais recentemente, a farmacologia 2 de reciclagem SLV em terminais aferentes mecanosensorial examinando efeitos de drogas sobre a captação e liberação dos corantes.
Tal como acontece com a maioria das técnicas práticas, reprodutibilidade exige repetição e prática. Alguns dos pontos-chave para garantir a confiabilidade será agora discutida. rotulagem Lanceolate em animais mais jovens é mais confiável - o menor animais temos utilizado foi de 15 g de peso corporal. Não é completamente claro porque este é o caso, mas pode ser devido a dissecção do tecido conjuntivo mais jovens requer menos trauma mecânico e leaves menos restantes resíduos ao remover os tecidos que recobrem a camada de inervação.
No geral, a preparação do tecido é bastante simples, com descascar as camadas da pele para além de ser o aspecto prático tecnicamente mais desafiadora e apenas em ratos mais velhos. Nestes, as camadas da pele aderir fortemente em conjunto na base onde a dissecção começa, mas mesmo aqui a separação das camadas torna-se muito mais fácil para as margens. Felizmente, ou talvez, por conseguinte, estas áreas da pele marginais mais finas, geralmente, dão a rotulagem mais satisfatória, assim como a pele anterior em geral. Portanto, evitar particularmente agarrar a pele muito fina nas margens. Para minimizar o risco de danos, manipular preparações indiretamente, empurrando com uma pinça fechadas em vez de agarrar diretamente, ou se aperto essencial tecidos única mais duras improváveis de ser rotulados. Ser completo na remoção da 'folha de poliestireno' camada imediatamente que recobre os folículos, pois esta é a principal meobstrução mecânica de imagem e acesso a medicamentos. No entanto, é essencial para minimizar o contacto físico com as estruturas subjacentes como esta danos (ie, desnuda) as redes neurais e terminais logo abaixo. Se a fluorescência predominante é o amarelo / branco nas glândulas sebáceas, proeminente auto-fluorescência das bases eixo do cabelo e alguns crescentes de laranja / amarelo terminações lanceoladas, isso indica a camada de plexo nervoso e terminais lanceoladas associados foram removidos durante a remoção. Este parece ser o principal problema com (> 30 g) os ratinhos mais velhos. Ao longo dos procedimentos de coloração, garantir que tudo está a 30 ° C e bem oxigenado. Esteja ciente de que os terminais marcados ainda estão vivos. Consequentemente, corante vai ser secretada pela liberação contínua espontânea (constitutiva) exocítico. Este será mais lenta em R / T, mas é uma boa prática para minimizar o atraso entre a remoção da solução quelante e de imagem, para minimizar a perda de corante. Além disso, para entre-grupos s comparativostudies de intensidade, que é essencial para assegurar a imagiologia de todos os grupos é combinado em tempo. Utilização de um agente corante quelante antes de imagem melhora grandemente o contraste da imagem. Assim, embora relativamente caro, o passo de quelação é muito importante para garantir uma boa qualidade de imagem. utilização quelante pode ser minimizado através da reutilização da solução várias vezes, e mesmo em 2 - 3 dias consecutivos, se armazenado a 4 ° C entre as utilizações. Descartar a solução quelante uma vez que vai visivelmente rosa, mostrando a sua sequestro de corante está se aproximando da saturação.
Durante a gravação, estar ciente do potencial de danos fototóxico para estes terminais vivos, que é o resultado cumulativo de ambos a intensidade e o tempo de exposição da luz de excitação. Esta consideração é menos importante para imagens único ponto no tempo, onde a qualidade da imagem é a principal preocupação. No entanto, é crucial durante a imagem repetida em estudos cinéticos para reduzir a exposição a luz de excitação a um mínimo. Ao desenvolver estes corantes parasinapses etiqueta, encontramos excitação para> 1 min a excitação iluminação plena potência causará dramática e irreparáveis danos a terminais nervosos. Eles primeiro subsequentemente expandir enormemente, em seguida, entrar em colapso completo ao longo de um período de ~ 15 min. Nós não testar sistematicamente as contribuições relativas de tempo de exposição e intensidade, mas estas observações sugerem o princípio orientador deve ser minimizar ambos. Assim, recomenda-se que a intensidade da luz de excitação e duração são o mínimo compatível com a obtenção de boas imagens, e as imagens de controlo adequadas são tomadas em estudos de tempo do curso. Para testar se os dados não são afetados por fototoxicidade em condições de imagens repetidas, em cada momento tomar uma imagem adicional de um terminal ainda não foi visualizada. Isto é para assegurar o comportamento da rotulagem em terminais naive assemelha-se em folículos a ser trabalhada repetidamente.
Um número de factores pode reduzir a variabilidade dentro-grupo da intensidade líquida data. a colocação exata das ROIs, em particular o ROI fundo, é importante, pois mesmo pequenas áreas de coloração inadequada pode afetar grandemente entre folículo-variabilidade dos dados. A variabilidade da intensidade líquida também é influenciada por quão completamente cada folículo piloso é cercado por paliçada de terminações. Compare, por exemplo, a distribuição em forma de crescente rotulagem na Figura 1B com o padrão quase completamente circular, visto na Figura 2. Uma análise mais complexa, talvez usando detecção software automatizado e de limiar, são necessários se o grau de cerco é um parâmetro relevante. Por favor, note que as distribuições de intensidade até mesmo para os grupos folículo mais analisados com precisão não são normalmente distribuídos (ver Figura 3), que impliquem a utilização de estatísticas não paramétricos para as comparações entre o tratamento de medianas da população, em vez de meios. técnicas de normalização, tais como a expressão de intensidades em percentagem ócontralateral de controlo F, ou de um grupo de controlo constituído por várias preparações, pode ser aplicado para reduzir ainda mais a variabilidade. O item técnico final a ser considerado é o desenho experimental para testes farmacológicos. Durante os estudos farmacológicos, pré-incubar a preparação em solução de um fármaco, durante 30 min antes da aplicação do corante. Em seguida, manter a concentração da droga na solução do corante. Em controlos, utilizar solução salina ou, se a droga é dissolvida num veículo, salina com veículo.
O presente artigo demonstra como esta nova preparação pavilhão auricular oferece imagens de alta qualidade de terminações mecanosensorial na pele com o mínimo de preparação. Também mostramos que pode ser usado para examinar a farmacologia dos dois aspectos críticos de reciclagem vesícula. Nós mostramos pela primeira vez que um agonista do receptor de glutamato pode aumentar a internalização de corante (um marcador de endocitose), e segundo, que o corante é perdido novamente com latrotoxin (um estimulante de exocitose). O significado desta preparation e técnica é que ela oferece um excelente acesso a viver pele terminais mechanosenory in situ para experimentos com imagens, proporcionando oportunidades únicas para o monitoramento óptico da função terminal, estrutura e suas inter-relações. Para este último fim, nós também desenvolveram-lo ainda mais para uso em estudos combinados ópticos / eletrofisiológicos (ver a irmã artigo JoVE para detalhes).
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O trabalho foi financiado pelo G0601253 UK Medical Research Council concessão do projeto para GSB e RWB e uma subvenção SULSA Bioskape para GSB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS - Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera - basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
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