Methodenartikel
Eine Feinabstimmung Regulation der Gen-Transkription zugrunde liegt, embryonale Zellschicksal Entscheidung. Hier beschreiben wir Immunpräzipitationstests Chromatin verwendet epigenetischen Regulation sowohl der Herz Differenzierung von Stammzellen und kardialen Entwicklung von Mäuseembryos untersuchen.
Spezifische Gen-Transkription ist ein wichtiger biologischer Prozess, Zellschicksal Entscheidung während der embryonalen Entwicklung zugrunde liegt. Der biologische Prozess wird durch Transkriptionsfaktoren vermittelt, die genomischen regulatorischen Regionen einschließlich Enhancern und Promotoren von Herz konstitutiven Genen binden. DNA ist um Histone gewickelt, die zu chemischen Modifikationen unterzogen werden. Modifikationen von Histonen führen weiter zu verdrängten, aktiviert oder balanciert Gen-Transkription, also eine andere Ebene der Feinabstimmung Regulation der Gen-Transkription zu bringen. Embryonale Stammzellen (ES - Zellen) rekapitulieren innerhalb Embryoidkörpern (dh Zellaggregate) oder in der 2D - Kultur der frühen Schritte der Herzentwicklung. Sie bieten im Prinzip genügend Material für Chromatinimmunpräzipitation (CHIP), eine Technologie, im Großen und Ganzen verwendet Gen regulatorischen Regionen zu identifizieren. Darüber hinaus repräsentieren humane ES-Zellen, die eine humane Zellmodell Kardiogenese. In späteren Stadien der Entwicklung, ermöglichen embryonalen Mausgeweben fürUntersuchung spezifische epigenetische Landschaften zur Bestimmung der Zellidentität erforderlich. Hier beschreiben wir Protokolle von CHIP, sequentielle ChIP gefolgt von PCR oder Chip-Sequenzierung unter Verwendung von ES-Zellen, Embryoidkörpern und kardialspezifisch embryonale Regionen. Diese Protokolle ermöglichen die epigenetische Regulation der Herz Gen-Transkription zu untersuchen.
Das Herz ist das erste Organ gebildet wird und in dem Embryo funktionalen zu werden. Das Herz wird aus vielen Zelllinien aufgebaut , die von den ersten und zweiten embryonalen Herzfelder 1 entstehen. Von der nach der Befruchtung Blastozyste zu dem geformten Herz bis zu inszenieren, haben embryonale Zellen so viele Zellschicksal Entscheidungen zu treffen. Gen-Transkription wird in einem zeit- und ortsabhängig geregelt und ist ein wichtiger biologischer Prozess, Zellschicksal Entscheidung während der embryonalen Entwicklung zugrunde liegt. Ein derartiges Verfahren ist durch spezifische Transkriptionsfaktoren vermittelt, die innerhalb des Genoms einschl....
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1. DNA-Protein-Quervernetzung
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1A stellt zunächst die Herstellung von DNA-bindenden Perlen und Qualitätskontrolle unter Verwendung von DNA in verschiedenen Größen (1 kb Leiter). 0ne, 2 und 2,5 Volumina (1 bis 3) der Kügelchen wurde zu einem Volumen der Probe hinzugefügt hohem und niedrigem Molekulargröße DNA-Fragmente zu reinigen.
Figuren 1 B, C, D sind typische Beispiele für DNA - Gelen von Voll beschallter DNA extrahiert .......
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Epigenetik ist ein wichtiger Bereich der Forschung in der Entwicklungsbiologie geworden. Wie ein genetisches Programm in embryonalen Zellen aktiviert wird, um die Zellen zu erwerben eine bestimmte Identität innerhalb einer embryonalen Linie zu ermöglichen, hat eine Schlüsselfrage für Entwicklungsbiologen für lange Zeit gewesen.
ChIP wurde in den letzten Jahren und kombiniert, um die DNA-Sequenzierung folgende Verbesserung der Auflösung der Sequenzierung im Großen und Ganzen verwendet. Dies h.......
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Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Die Autoren danken den Förderorganisationen, dem IMI StemBANCC European Community Programm, der leducq Foundation (SHAPEHEART) und der Agence Nationale de la Recherche (Genopath)
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Formaldehyd | Sigma | F8775 | Zellfixierung |
| Glycin | Sigma | G8898 | Cross-Link Stop |
| Aprotinin | Fluka | 10820 | Proteasen Inhibitor |
| Leupeptin Hemisulfat | Sigma | L2882 | Proteasen Inhibitor |
| PMSF | Sigma | P7626 | Proteasen Inhibitor |
| Protein A magnetische Kügelchen | Life technologies | 10001D | Immunpräzipitation |
| SPRI magnetische Beads | Thermo Scientific | 15002-01 | DNA-Aufreinigung |
| Proteinase K | Life technologies | 25530-015 | Proteinverdauung |
| DNA BR Standard | Life Technologies | Q32850 | Kalibrierbereich |
| Syber green | Molecular Probes | S-11484 | DNA-Quantifizierung |
| TE-Puffer | Invitrogen | P7589 | DNA-Quantifizierung |
| PBX 1x | Lebenstechnologien | 14190-094 | Waschen |
| DNase RNase freies Wasser | Lebenstechnologien | 10977-035 | Verdünnung |
| Axygen Röhrchen | Axygen | MCT-175-C | ChIP purifikt |
| Antikörper | Unternehmen | >< | strong>ChIP-Konzentration |
| H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 µ g für Regler und EBs, 1 & Mikro; g für Gewebe |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | 3 µ g für Regler und EBs, 1 & Mikro; g für Gewebe |
| H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | 3 µ g für Regler und EBs, 1 & Mikro; g für Gewebe |
| H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | 3 & Mikro; g für Regler und EBs, 1 & Mikro; g für Gewebe |
| H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 µ g für Regler und EBs, 1 & Mikro; g für Gewebe |
| H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | 3 µ g für Regler und EBs, 1 & Mikro; g für Taschentücher |
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