Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

Leigh Ann Samsa; Nicole Fleming; Scott Magness; Li Qian; Jiandong Liu

doi:10.3791/53877

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Methodenartikel

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

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DOI:

10.3791/53877

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12. März 2016

Leigh Ann Samsa¹^,² , Nicole Fleming²^,³ , Scott Magness¹ , Li Qian²^,³ , Jiandong Liu²^,³

¹Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, ²McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, ³Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung einzelner Zellen aus Zebrafischembryonen, zur Anreicherung von Zellen von Interesse, zum Einfangen von Zebrafischzellen in mikrofluidisch basierten Einzelzell-Multiplexsystemen und zur Bewertung der Genexpression von einzelnen Zellen.

Zusammenfassung

Der Zebrafisch (Danio rerio) ist ein leistungsfähiger Modellorganismus, um die Entwicklung von Wirbeltieren zu untersuchen. Obwohl viele Aspekte der Embryonalentwicklung von Zebrafischen auf morphologischer Ebene beschrieben wurden, ist wenig über die molekularen Grundlagen der zellulären Veränderungen bekannt, die im Laufe der Entwicklung des Organismus auftreten. Mit den jüngsten Fortschritten in der Mikrofluidik und Multiplexing-Technologie ist es nun möglich, die Genexpression in einzelnen Zellen zu charakterisieren. Dies ermöglicht die Untersuchung der Heterogenität zwischen einzelnen Zellen spezifischer Zellpopulationen, um Zellsubtypen zu identifizieren und zu klassifizieren, Zwischenzustände zu charakterisieren, die während der Zelldifferenzierung auftreten, und differentielle zelluläre Reaktionen auf Reize zu erforschen. Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur Isolierung lebensfähiger, einzelner Zellen aus Zebrafischembryonen für Hochdurchsatz-Multiplexing-Assays. Diese Methode kann schnell auf jeden embryonalen Zelltyp des Zebrafisches mit fluoreszierenden Markern angewendet werden. Eine Erweiterung dieser Methode kann auch in Kombination mit Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien verwendet werden, um das Transkriptom einzelner Zellen vollständig zu charakterisieren. Als Beweis für das Prinzip wurde die relative Häufigkeit von kardialen Differenzierungsmarkern in isolierten, einzelnen Zellen untersucht, die von nkx2,5 positiven kardialen Vorläuferzellen abgeleitet wurden. Durch die Auswertung der Genexpression auf Einzelzellebene und zu einem einzigen Zeitpunkt unterstützen die Daten ein Modell, in dem kardiale Vorläuferzellen mit differenzierenden Nachkommen koexistieren. Die hier beschriebene Methode und der Arbeitsablauf sind auf breiter Basis für die Zebrafisch-Forschungsgemeinschaft anwendbar und erfordern lediglich eine markierte transgene Fischlinie und Zugang zu Mikrofluidik-Technologien.

Einleitung

Die meisten aktuellen Studien der Zell- und Molekularbiologie sind auf Bevölkerungsdurchschnittswerten. Jedoch können wichtige biologische Ereignisse, die von diesen traditionellen populationsbasierten Analysen maskiert werden, da kleinere Populationen wichtige Rollen in biologischen Prozessen und Krankheitsverlauf spielen können. Genexpression in heterogenen Populationen auf Einzelzellebene zu verstehen , kann (und hat) führen zu relevanten biologischen und klinischen Erkenntnisse ^1,2. Von Bedeutung für die embryonale Entwicklung Studien, in einer größeren Population von Zellen, sind Vorläuferzellen oft unterrepräsentiert, so dass es schwierig subtile Ver....