Methodenartikel

Epigenetische Umwandlung als eine sichere und einfache Methode, Insulin absondernden Zellen aus adulten Fibroblasten der Haut zu erhalten

DOI:

10.3791/53880

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18. März 2016

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1Laboratory of Biomedical Embryology, Unistem, Centre for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier wird eine neue Methode vorgestellt, die die Umwandlung von adulten Hautfibroblasten in insulinsezernierende Zellen ermöglicht. Diese Technik basiert auf epigenetischer Konversion und beinhaltet weder die Verwendung retroviraler Vektoren noch den Erwerb eines stabilen pluripotenten Zustands. Es ist daher vielversprechend für Anwendungen in der translationalen Medizin.

Zusammenfassung

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Regenerative Medizin benötigt neue, voll funktionsfähige Zellen, die den Patienten zur Verfügung gestellt werden, um degeneriertes oder beschädigtes Gewebe zu reparieren. Wenn solche Zellen nicht ohne weiteres verfügbar sind, können sie mit verschiedenen Ansätzen gewonnen werden, zu denen unter anderem Reprogrammierung und Transdifferenzierung gehören, mit Vorteilen und Einschränkungen, die für die verschiedenen Techniken spezifisch sind. Hier wird eine neue Strategie zur Umwandlung eines adulten reifen Fibroblasten in eine insulinsezernierende Zelle beschrieben, die willkürlich als epigenetische umgewandelte Zellen (EpiCC) bezeichnet wird. Die Methode wurde auf der Grundlage des zunehmenden Verständnisses der Mechanismen entwickelt, die die epigenetische Regulation des Zellschicksals und der Differenzierung steuern. Insbesondere wird im ersten Schritt ein epigenetischer Modifikator, nämlich 5-Aza-Cytidin, verwendet, um adulte Zellen in einen "hochgradig freizügigen" Zustand zu versetzen. Es nutzt dann dieses kurze und reversible Zeitfenster epigenetischer Plastizität, um Zellen wieder auf eine andere Linie auszurichten. Der Ansatz wird als "epigenetische Zellkonversion" bezeichnet. Es ist eine einfache und robuste Methode, um einen effizienten, kontrollierten und stabilen zellularen Inter-Lineage-Switch zu erhalten. Da das Protokoll keine Gentransfektion erfordert, frei von viralen Vektoren ist und keinen stabilen pluripotenten Zustand beinhaltet, ist es sehr vielversprechend für translationale medizinische Anwendungen.

Einleitung

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Ein grundlegendes Ziel der regenerativen Medizin ist die Erzeugung von neuen, funktionsfähigen Zellen, die verwendet werden können, zu reparieren oder zu ersetzen beschädigte, entartete Gewebe. leicht verfügbar adulte Zellen in neue remaking, indem sie aus einem Zelltyp in einen anderen umzuwandeln, ist ein besonders attraktiver Ansatz, insbesondere, wenn die erforderliche Zellpopulation Zugang nicht reichlich oder schwierig ist. Allerdings sind adulte Zellen bemerkenswert stabil. Sie erhalten ihre differenzierten Zustand durch eine schrittweise Einschränkung ihrer Möglichkeiten und, sobald sie die reifen Terminal Spezialisierung erreichen, sie es stabil 1 behalten.

In den letzten Jahren haben eine Reihe von Protokollen entwickelt worden, dass die Umprogrammierung zu Pluripotenz einer somatischen Zelle (iPS) ermöglichen erreicht durch die erzwungene Expression einer ganzen Reihe von Transkriptionsfaktoren 2,3. Alternativ kann die Zellumwandlung durch direkte Abstammungslinie transdifferentiation erhalten werden, eine einzige 4 Einführung oder eine Kombination von Transkriptionsfaktoren 5-7. Diese Strategie geht es nicht um den Übergang durch eine de-differenzierten Zustand , sondern erfordert eine hohe Expression des spezifischen Transkriptionsfaktoren 8.

Wir haben kürzlich eine Umwandlungsprotokoll, das auf der kurzen Belichtungs adulter Zellen zu den demethylating Eigenschaften des Cytidinanalogon 5-Azacytidin (5-Aza-CR), einem gut charakterisierten DNA-Methyltransferase-Inhibitor entwickelt. Die Demethylierung Schritt wird sofort durch eine spezifische Differenzierungsprotokoll 9-11 gefolgt, die die erforderliche terminalen Phänotyp zu erhalten ermöglicht. Dieses Verfahren ist in der Lage reife, differenzierte Zellen in Zellen einer anderen Abstammung zu konvertieren und hat den wesentlichen Vorteil, sowohl die Verwendung von viralen Vektoren und die Transfektion einer exogenen Transkriptionsfaktoren zu vermeiden. Der Erwerb eines stabilen pluripotenten Zustand, und die damit verbundene erhöhte Anfälligkeit Instabilität der Zelle wird ebenfalls vermieden.

Das detaillierte Protokoll, das die Umwandlung von adulten menschlichen Hautfibroblasten in voll funktionsfähigem insulinsezernierenden Zellen ermöglicht wird hier vorgestellt. Allerdings ist es erwähnenswert, dass die Technik auf unterschiedlichen Zelltypen angewendet wurde und führte zu positiven Ergebnissen, wenn die Zellen gegenüber verschiedenen Differenzierungswege Adressierung. Darüber hinaus hat epigenetische Umwandlung erfolgreich in der Mensch und Schwein Spezies 9-13 sowie in dem Hund (Manuskript eingereicht) was auf eine breite Wirksamkeit und Robustheit des Ansatzes verwendet.

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Protokoll

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Hinweis: Alle nachfolgend beschriebenen Verfahren müssen unter sterilen Bedingungen unter Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden. Stellen Sie sicher, dass alle Kulturverfahren durchgeführt werden, auf thermostatgesteuerten Bühnen und die Zellen werden bei 37 ° C während ihrer Handhabung beibehalten.

1. Haut Fibroblast Isolation

  1. Bereiten Kulturschale Beschichtungslösung
    1. Man löst 0,1 g Schweine-Gelatine in 100 ml Wasser (Endkonzentration 0,1%). Sterilisieren Lösung mit Autoklaven.
    2. 1,5 ml steriler 0,1% Schweinegelatine bis 35 mm Petrischalen. Warten 2 h zu beschichten, so dass sie bei Raumtemperatur gehalten.
      Hinweis: Menschliche Hautbiopsien erhoben werden durch Exzision unter örtlicher Betäubung von einem avaskulären Bereich der anterioren Seite des Unterarms und gespeichert in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), ergänzt mit 2% Antibiotikum, Antimykotikum-Lösung bei +4 ° C vor der Verwendung.
  2. Wash Biopsien mit neuen PBS mit 2% antibi ergänztotic Antimykotika-Lösung.
  3. Platz Biopsien in einer 100 mm Petrischale und Schnitt in etwa 2 mm 3 Fragmente mit sterilem Skalpelle.
  4. Entfernen Sie die Beschichtungslösung Überschuss unmittelbar vor der Fragmente Plattierung.
  5. Platzieren 5-6 Hautfragmente in die vorbeschichteten 35 mm Petrischale.
  6. Bereiten Fibroblastenkulturmedium: 77% Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit hohem Glucose, 20% Fetal Bovine Serum (FBS), 1% L-Glutamin-Lösung und 2% Antibiotikum, Antimykotikum-Lösung.
  7. Hinzufügen , um ein Tröpfchen von Fibroblastenmedium über jedem Fragment (üblicherweise 100 & mgr; l pro Fragment) und Kultur sie bei 37 ° C in 5% CO 2.
  8. Nach 24 Stunden wurden 500 & mgr; l von Fibroblasten - Kulturmedium über die Fragmente fügen Sie sie in 5% CO 2 bei 37 ° C feucht zu halten.
  9. Ändern Sie das Medium mit einer Pipette mindestens einmal alle 48 Stunden.
  10. Nach 6 Tagen Inkubation vorsichtig entfernen Gewebefragmente und sie verwerfen.
    Hinweis: Nach 6 Tagen Fibroblastens beginnen aus den Gewebefragmenten zu wachsen und beginnen, eine Zellschicht zu bilden.
  11. Aktualisieren Medium, 2 ml Fibroblasten - Kulturmedium und weiterhin Zellschicht Kultur bei 37 ° C in 5% CO 2 Inkubator.

2. Fibroblast Kultur

  1. Kultur Fibroblasten bei 37 ° C in 5% CO 2 , bis 80% Konfluenz
  2. Für Passagierung absaugen Fibroblasten-Kulturmedium aus Gewebekulturschalen. Wasche die Zellen dreimal mit 4 ml PBS, ergänzt mit 1% Antibiotika-Antimykotika-Lösung.
  3. Hinzufügen, um eine dünne Schicht (10% des Kulturmediums Volumen) von Trypsin-EDTA-Lösung (0,5 g / L Schweine Trypsin und 0,2 g / L EDTA) und inkubiere bei 37 ° C bis zur Zellmonoschicht von der Unterseite des Gewebes zu lösen beginnt, Kulturschale und Zellen distanzieren.
  4. Verdünnte Zellsuspension mit 9 Teilen Fibroblastenkulturmedium Trypsin Wirkung neutralisieren. Zentrifugation nicht notwendig ist.
  5. Platten-Zellen in neue Kulturschalen (mitaus Gelatine) und die Kultur bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator. Halten Sie das Durchtrittsverhältnis zwischen 1: 2 und 1: 4, je nach Wachstumsrate.
  6. Wenn die Zellen erreichen rund 80% Konfluenz Passage sie (in der Regel zweimal pro Woche).

3. Fibroblast Plating für epigenetische Conversion

  1. In 0,26 ml / cm 2 von 0,1% Schweinegelatine (herzustellen , wie in 1.1 beschrieben) auf Zellkulturschalen. Warten Sie 2 Stunden zu beschichten.
  2. Entfernen Sie die Beschichtungslösung Überschuss 10-30 min vor der Fibroblasten Plattierung.
  3. Entfernen Fibroblasten-Kulturmedium aus den Kulturschalen. Wasche die Zellen dreimal mit PBS, supplementiert mit 1% Antibiotika-Antimykotika-Lösung.
  4. Hinzufügen, um eine dünne Schicht (10% des Kulturmediums Volumen) von Trypsin-EDTA-Lösung (0,5 g / L Schweine Trypsin und 0,2 g / L EDTA) und inkubiere bei 37 ° C bis zur Zellmonoschicht von der Unterseite des Gewebes zu lösen beginnt, Kulturschale und Zellen distanzieren.
  5. Verdünnte Zellsuspension mit 9 Teilen fibroblast Kulturmedium Trypsin Aktion zu neutralisieren.
  6. Zählen von Zellen unter Verwendung einer Zählkammer unter einem Mikroskop bei Raumtemperatur. Berechnen des erforderlichen Volumens von Fibroblastenkulturmedium Zellen zu resuspendieren, eine Zellkonzentration von 7,8 x 10 4 Fibroblasten / cm 2 zu erhalten. Dies hängt von der speziellen Art der Kammer verwendet wird.
    Die Zellen / ul = Durchschnittliche Anzahl der Zellen pro kleines Gitter x 90 (Multiplikationsfaktor) x Verdünnung
  7. Zentrifuge Zellsuspension bei 150 g für 5 min bei Raumtemperatur. Überstand entfernen und resuspendieren Zellen mit dem vorher errechneten Volumen der Fibroblasten-Kulturmedium.
  8. Platten Zellen auf 0,1% Gelatine vorbeschichtet Geschirr und Kultur sie für 24 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator.

4. Erhöhung der Zellplastizität Mit dem De-Methylierungsmittel 5-Aza-CR

  1. Tag 0
    1. Bereiten Sie 5-Aza-CR-Stammlösung von 2,44 mg 5-Aza-CR Auflösen in 10 ml DMEM mit hohem Glucose mediÄh. Sterilisieren durch Filtration. Bereiten Sie 5-Aza-CR Lager unmittelbar vor der Verwendung.
    2. Verdünne 1 ul von 5-Aza-CR-Stammlösung in 1 ml Fibroblasten-Kulturmedium (Endkonzentration 1 uM).
    3. Um Zellplastizität erhöhen, 24 Stunden nach der Zellschichten (Hierher 3.8), zu entfernen Kulturmedium aus ausgesät Fibroblasten und fügen 1 & mgr; M 5-Aza-CR - Stammlösung und Kultur für 18 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2 Inkubator.
  2. Tag 1
    1. Bereiten frischen humanen pluripotenten (HP) Medium , wie in Tabelle 1 beschrieben.
    2. Nach Inkubation mit 1 & mgr; M 5-Aza-CR, entfernen Medium und wasche die Zellen dreimal mit PBS, um sicherzustellen, dass 5-aza-CR abgespült wird.
    3. Inkubiere 5-Aza-CR behandelten Fibroblasten mit HP Medium für 3 Stunden (Erholungsphase) bei 37 ° C in 5% CO 2.
    4. Nach der Erholungsphase, entfernen Medium, waschen dreimal mit PBS.
    5. Um die Effizienz der 5-Aza-CR Behandlung zu überwachen, überprüfen Sie in diesem Schritt foder das Vorhandensein von morphologischen Veränderungen (detaillierter in Abschnitt Ergebnisse). Die Zellen verlieren die typische längliche Morphologie von Fibroblasten und eine runde oder ovale Form zu erwerben, in der Größe kleiner zu werden, mit vergrößerten Kernen.
    6. Fahren Sie mit Pankreas-Differenzierung.

5. Pancreatic Differenzierung Protokoll

  1. Tage 1-6
    1. Bereiten Pancreatic Basal Medium , wie in Tabelle 2 beschrieben.
    2. Bereiten Sie eine Vorrats-Lösung Activin: Man löst 5 ug eines rekombinanten humanen Protein in 166,6 ul sterilem Wasser Activin.
    3. Kultur 5-Aza-CR - Fibroblasten in 0,26 ml / cm 2 von Bauchspeicheldrüsen Basal Medium, ergänzt mit 1 & mgr; l / ml Activin A - Stammlösung (siehe 5.1.2) für 6 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2 Inkubator behandelt. Ändern Medium täglich.
  2. Tage 7-8
    1. Bereiten Retinsäure Stammlösung durch Zugabe von 16,6 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) zu 50 mg Retinoesäure acid.
    2. Kulturzellen in 0,26 ml / cm 2 von Pancreatic Basal - Medium , ergänzt mit 1 & mgr; l / ml Activin A - Stammlösung (siehe 5.1.2) und 1 ul / ml Retinsäure - Stammlösung (siehe 5.2.1) für 2 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2. Ändern Medium täglich.
  3. Tage 9-36
    1. Kulturzellen in 0,26 ml / cm 2 von Pancreatic Basal - Medium , ergänzt mit 1% (v / v) Insulin-Transferrin- Selen (ITS), 2% (v / v) B27 und 0,1% (v / v) Recombinant Human FGF Grund (bFGF) Stammlösung (siehe Tabelle 1) bei 37 ° C in 5% CO 2 Inkubator. Ändern Sie das Medium täglich für die ersten 15 Tage.
    2. Vom 16. Tag an, aktualisieren Sie jeden zweiten Tag Medium, unter einem Mikroskop, da aggregierte Zellen bilden vom Boden der Kulturschale lösen kann.

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Ergebnisse

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Gründung der Primärkultur aus Hautbiopsien
Hautbiopsien wurden in kleine Fragmente geschnitten und platziert in Gelatine vorbeschichtet Gerichte. Nach 6 Tagen begann Fibroblasten aus den Gewebefragmenten und bildeten eine Zellschicht (1A) zu wachsen. Zellen zeigten eine typische längliche Form und, wie erwartet, eine einheitliche immun Positivität für den Fibroblasten - spezifischen Marker Vimentin (Vim, 1B) angezeigt.

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Diskussion

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Die vorliegende Manuskript beschreibt ein Verfahren, das die Umwandlung von Fibroblasten der menschlichen Haut in Insulin-produzierende Zellen, durch eine transiente und kurze Exposition gegenüber 5-Aza-CR, gefolgt von einem gewebespezifischen Induktionsprotokoll ermöglicht. Dieser Ansatz ermöglicht einen Wechsel von Mesoderm Endoderm verwandten Zellen, ohne die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren oder microRNAs noch den Erwerb eines stabilen pluripotenten Zustand, die 14 Zellen mehr instabil und...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von Carraresi Stiftung und Europäische Stiftung für die Erforschung von Diabetes (EFSD) gefördert. GP wird von einem Post-Doc-Stipendium der Universität von Mailand unterstützt. Die Autoren sind Mitglieder der COST-Aktion FA1201 Epiconcept: Epigenetik und Periconception Umwelt und die COST Aktion BM1308 Freigabe Fortschritte auf Großtiermodellen (SALAAM). TALB ist Mitglied der COST Action CM1406 Epigenetische Chemical Biology (Epichem).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Dulbecco's Phosphatgepufferte KochsalzlösungSigmaD5652PBS; für die Zellwäsche und Lösungsvorbereitung
Antibiotische Antimykotische LösungSigmaA5955Bestandteil von Fibroblasten, HP und Pankreasmedien
100 mm PetrischaleSarstedt83.3902Für die Isolierung von Fibroblasten
SchweinegelatineSigmaG1890Für die Beschichtung von Schalen
WasserSigmaW3500Für die Lösungsvorbereitung
35 mm PetrischalenSarstedt83.39Für die Isolierung von Fibroblasten
DMEM, hoher Glukosegehalt, PyruvatLife Technologies41966052Für Fibroblasten-Kulturmedium
Fötales RinderserumLife Technologies10500064FBS; Bestandteil des Fibroblasten- und HP-Mediums
L-Glutamin-LösungSigmaG7513Bestandteil des Fibroblasten-, HP- und Pankreasmediums
Trypsin-EDTA-LösungSigmaT3924Für die Dissoziation von Fibroblasten
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 MIT GITTERNHycor Biomedical87144Zellzählung
5-AzacytidinSigmaA23855-Aza-CR, für Inkrerase-Zellen Plastizität in Fibroblasten
Ham's F-10 Nutrient MixLife Technologies31550031Für HP Medium
DMEM, Low Glucose, PyruvatLife Technologies31885023Für HP Medium
KnockOut Serum Replacement LifeTechnologies10828028Bestandteil von HP Medium
MEM Non-Essential Amino Acids SolutionLife Technologies11140035Bestandteil von HP und Pankreas-Basalmedien
2-MercaptoethanolSigmaM7522Bestandteil von HP und Pankreas-Basalmedien
GuanosinSigmaG6264Nukleosid-Mix-Stoffbestandteil von HP-Medium
AdenosinSigmaA4036Nukleosid-Mix-Stoffbestandteil von HP-Medium
CytidinSigmaC4654Nukleosid-Mix-Stoffbestandteil von HP-Medium
UridinSigmaU3003Nukleosid-Mix-Stoffkomponente aus HP-Medium
ThymidinSigmaT1895Nukleosid-Mix-Stoffkomponente aus HP-Medium
Millex-GS 0,22 &; Mikro; mMilliporeSLGS033SBZur Sterilisation der Lösung
FGF-Basic (AA 1-155) Rekombinante Human ProteinLife TechnologiesPHG0261bFGF; Bestandteil von HP und Pankreas-Basalmedium
RinderserumalbuminSigmaA3311BSA; Bestandteil des Pankreas-Basalmediums
DMEM/F-12Life Technologies11320074für Pankreas-Basalmedium
B-27 Supplement Minus Vitamin ALife Technologies12587010Bestandteil des Pankreasmediums
N-2 SupplementLife Technologies17502048Bestandteil des Pankreas-Basalmediums
Activin A rekombinantes humanes ProteinLife TechnologiesPHG9014Für Pankreasmedium
RetinsäureSigmaR2625Für Pankreasmedium
DimethylsulfoxidSigmaD2650DMSO; Für Retinsäure Stoffaufbereitung
Insulin-Transferrin-SeleniumLife Technologies41400045ITS; Für Pankreas-Endmedium
Anti-Vimentin-AntikörperAbcamab8069Für die immunzytochemische Analyse. Arbeitsverdünnung 1:100
4′,6-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochloridSigma32670DAPI. Für die immunzytochemische Analyse. Arbeitsverdünnung  1 & Mikro; g/ml
5-MethylcytidinEurogentecMMS-900P-BZur immunzytochemischen Analyse. Arbeitsverdünnung 1:500
Anti-C-Peptid-Antikörper Abcamab14181Für die immunzytochemische Analyse. Arbeitsverdünnung 1:100
Anti-PDX1 Antikörper Abcamab47267Für die immunzytochemische Analyse. Arbeitsverdünnung 1:500
Mercodia Insulin ELISAMercodia10-1113-10Zum Nachweis der Insulinfreisetzung
: Technologies

Referenzen

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5 Aza Cytidin Behandlungpankreatische DifferenzierungRetins ure InduktionActivin A SupplementierungITS B27 BFGS MediumPDX1 CPEP Kolokalisationglucosestimulierte Insulinfreisetzung

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