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Methodenartikel

Murine Modell der intestinalen Ischämie-Reperfusionsschaden

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DOI:

10.3791/53881

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11. Mai 2016

 ,  ,  ,  , 
1Trudeau Institute, 2Engelhardt Institute of Molecular Biology, 3Departments of Medicine and Infectious Diseases and Pathology, University of Florida

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Einzelheiten des Verfahrens der intestinalen Ischämie-Reperfusion bei Mäusen, die ohne Mortalität in reproduzierbarer Verletzungen führt die Standardisierung dieser Technik auf dem Gebiet zu fördern. Dieses Modell der intestinalen Ischämie-Reperfusions-Verletzung kann die zellulären und molekularen Mechanismen der Schädigung und Regeneration zu studieren verwendet werden.

Zusammenfassung

Intestinale Ischämie ist ein lebensbedrohlicher Zustand in Verbindung mit einem breiten Spektrum von klinischen Zuständen, einschließlich Atherosklerose, Thrombose, Blutdruckabfall, nekrotisierende Enterokolitis, Darmtransplantation, Trauma und chronische Entzündungen. Intestinale Ischämie-Reperfusions (IR) Schädigung ist eine Folge der akuten mesenterialen Ischämie, hervorgerufen durch unzureichende Durchblutung der mesenterialen Gefäße, was zu Darmschäden. Reperfusion nach Ischämie können weitere Schäden des Darms verstärken. Die Mechanismen der IR-Verletzungen sind komplex und kaum verstanden. Daher sind kleine Versuchstiermodellen kritisch für das Verständnis der Pathophysiologie der IR Verletzung und die Entwicklung neuer Therapien.

Hier beschreiben wir ein Mausmodell der akuten Darm IR Verletzung, die ohne Mortalität reproduzierbaren Verletzung des Dünndarms zur Verfügung stellt. Dies wird durch Induzieren von Ischämie in dem Bereich des distalen Ileums durch zeitliches Occludin erreichtg die peripheren und Terminalnebenzweige der A. mesenterica superior für 60 min mikrovaskulären Clips. Reperfusion für 1 Stunde oder 2 Stunden nach einer Verletzung führt zu reproduzierbaren Schädigung des Darms durch die histologische Analyse untersucht. Die richtige Position der mikrovaskulären Clips ist für das Verfahren kritisch. Daher bietet der Videoclip eine detaillierte visuelle Schritt-für-Schritt-Beschreibung dieser Technik. Dieses Modell der intestinalen IR Verletzung kann die zellulären und molekularen Mechanismen der Schädigung und Regeneration zu studieren verwendet werden.

Einleitung

Der Darm ist sehr empfindlich auf Unterbrechung des Blutflusses, die Ischämie und epithelialen Schaden verursacht. Reperfusion nach Ischämie stellt Wiedersauerstoffversorgung des Gewebes und kann weiter Pathologie fördern. Daher wird intestinale Ischämie und Reperfusionsverletzung mit einer breiten Palette von Erkrankungen verbunden sind , einschließlich nekrotisierender Enterokolitis, Allograft Abstoßung in Dünndarmtransplantation, Komplikationen der Bauchaortenaneurysma Chirurgie, kardiopulmonalen Bypass und entzündlicher Darmerkrankung 1,2. Intestinale IR Verletzungen, vor allem akute Mesenterialischämie, ist ein lebensbedrohlicher Zustand , was zu Morbidität und Mortalität 3.

Obwohl wenig verstanden wird intestinale Ischämie-Reperfusions (IR) Schädigung dachte mit Veränderungen in der Darmflora verbunden zu sein , sowie die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies und inflammatorische Zytokine und Chemokine 1,4-6. Dies führt zur Aktivierung von sowohl innate und adaptive Immunmechanismen , die eine Entzündung und Gewebeschädigung 1,7,8 fördern.

Tiermodelle sind von entscheidender Bedeutung für die Mechanismen der IR Verletzungs verstehen, da sie leicht Verstärkungs- und loss-of-function genetische Experimente ermöglichen. Mehrere Tiermodelle von IR wurden die komplette Gefäßverschluss, Low - Flow - Ischämie entwickelt und segmentierten Gefäßverschluss (kürzlich in einem umfassenden Überblick zusammengefasst 9). Intestinale Ischämie verursacht durch vollständige Gefäßverschluss der Arteria mesenterica superior (SMA) ist eine einfache und häufig verwendete Modell von IR bei großen Tieren und Nagetiere 11.09. Jedoch verschiedene Bereiche des Darmes haben unterschiedliche Verletzungsanfälligkeit. Darüber hinaus Verwechselung die breite Palette von Anästhetika, Analgetika, Arterienverschluss Techniken sowie Inkonsistenz in der Dauer von ischämischen Verletzungen und Erholung führen zu variablen Grad der Verletzung unser Verständnis der Biologie des IR über mehrere studies. Tabelle 1 zeigt diese Inkonsistenzen in murine IR - Studien. Der größte Nachteil von mit kürzeren Ischämiezeiten (30-45 min) zielt auf das Fenster der Erholung, auf die erkennbaren Unterschiede zwischen Fällen und Kontrollen beobachtet werden können. Mild Schädigung des Epithels kann eine Stunde nach der Reperfusion gelöst werden, deshalb spezialisierte pathologische Metriken erforderlich sein können Unterschiede in der epithelialen Restitution zu finden. Im Gegensatz dazu, wie übermäßigen Schaden durch 100 min von ischämischer Verletzung gesehen kann in der vollständigen denudement des Epithels führen, wenn eine Rückerstattung nicht mehr möglich ist, die Rate der Sterblichkeit erhöhen und Recovery-Zeit. Deshalb beschreiben wir die Einzelheiten des Verfahrens der intestinalen IR bei Mäusen, die ohne Mortalität in reproduzierbarer Verletzungen führt die Standardisierung dieser Technik in unserem Bereich zu fördern. Dieses Modell der intestinalen IR Verletzung kann die zellulären und molekularen Mechanismen der Schädigung und Regeneration zu studieren verwendet werden.

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Protokoll

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem National Institute of Health Richtlinien durchgeführt und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee des Trudeau Institute genehmigt. 8-12 Wochen alte C57BL / 6-Mäuse wurden für die Studie verwendet.

1. Vorbereitung für Chirurgie

  1. Bereiten Sie und chirurgische Instrumente zu sterilisieren.
  2. Bereiten Sie Isofluran-basierte Anästhesiesystem mit Nasenkegel und Heizkissen. Stellen Sie sicher, Heizkissen ist nicht überhitzt (<39 ° C).
  3. Stellen Sie sicher, dass das Isofluran Gasspül- Kanister richtig positioniert ist, um die Auslassöffnungen an der Unterseite des Behälters, um sicherzustellen, sind nicht in irgendeiner Weise blockiert oder verstopft. Wiegen Gasspül Kanister vor dem Verfahren und Dokumentengewicht auf Kanister. Entsorgen Kanister, wenn Kanister Gewicht 50 g akkumulierte Gewicht übersteigt (~ 12 h).

2. Anesthesia

  1. Anästhesieren Maus mit 3% Isofluran in einer Induktionskammer (1 L / minO 2).
    1. Beurteilen Sie Narkosetiefe durch die Unfähigkeit, aufrecht zu bleiben, Verlust der gezielte freiwillige Bewegung, Verlust des Lidschlussreflexes, Muskelentspannung, und der Verlust der Reaktion Stimulation (toe oder Schwanz Prise mit festem Druck) zu Reflex.
    2. Beurteilen Sie die Atemfrequenz und Muster von Brustwand und Bauchbewegungen zu beobachten. Unter optimalen Anästhesie sollte die Atemfrequenz ~ 55-65 Atemzüge pro Minute sein.
    3. Entfernen Sie die Maus aus der Induktionskammer und rasieren schnell den Bauchbereich der Maus.
  2. Hornhautaustrocknungs, legen fad Augensalbe in die Augen zu verhindern.
  3. Platzieren Sie die Maus auf dem Heizkissen und verbinden Sie es über Bugspitze an Anästhesiesystem. Achten Sie darauf, Latex Bugnase Membran passt fest über den Kopf der Maus, und es gibt kein Leck von Isofluran.
  4. Reduzieren Sie Isofluran Rate auf 1,5%, und injizieren Buprenorphin (0,1 mg / kg) und Ketamin (10 mg / kg) subkutan Wind-up der Schmerz-Kaskade zu verhindern.
  5. Wischen Sie the Haut des Operationsgebietes mit einem sterilen mit Betadine von 70% Ethanol gefolgt chirurgische Lösung getränkten Wattestäbchen.

3. Chirurgie

  1. Machen Sie eine Mittellinie 3-5 cm Laparotomie mit Betriebs Schere. Abdeckung Betriebsbereich mit sterilem nicht-haftenden Unterlage mit Kochsalzlösung angefeuchtet ist. Isolieren Blinddarm und Ileum und setzen die A. mesenterica superior mit Wattestäbchen in Kochsalzlösung angefeuchtet ist.
  2. Zur Erleichterung der Clip anwenden, machen kleine Scharten im Gekröse rund um die A. mesenterica superior mit feinen Iris scissors.To dies zu tun, vorsichtig den Darm mit Dressing Zange heben und Gekröse auf beiden Seiten der A. mesenterica superior an der gewünschten Clip Position geschnitten (Abbildung 1A). Dann fügen einige Tropfen steriler Kochsalzlösung auf den Bereich der gewünschten Clip Position vor Clips anwenden.
    Hinweis: Um die Scheinoperation durchzuführen, folgen Sie dem chirurgischen Eingriff bis 3.2 zu treten. Wenden Sie keine Clips. Stattdessen halten das Gewebe feucht durch hinzugefügt warme saline wie in 3.6 für 1 Stunde beschrieben. Danach gehen 4.1 zu Schritt,
  3. Verschließen Sie die ersten Ordnung Zweige der A. mesenterica superior mit mikrovaskulären Clips (70 g Kraft) zur Anbringung von Klammern mit einem 5-7 cm Bereich des ischämischen Ileum zu schaffen neben Blinddarms (1B). Obwohl die Position der Schiffe konservativ ist, könnte es zwischen Mäusen (siehe Beispiele auf Abbildung 1) leichte Variationen. Deshalb, 2 oder 3 Clips sind in der Regel erforderlich (siehe die Position der Clips auf 1A, D, E, schwarze Pfeile).
    Hinweis: Verwenden Sie qualitativ hochwertige Behälter Clips. Hochdruck-Clips können Gefäße schädigen und zu verhindern, Regeneration während Niederdruck-Clips (<30 g) nicht vollständig Blutfluss blockieren.
  4. Blockieren Sicherheiten Blutfluss durch den Darm mit Hilfe von zwei mikrovaskulären Clips über Gefäße (40 g Kraft), Demarkieren den Bereich des ischämischen Darms (Abbildung 1). Occlusion von Kollateralen ist erforderlich, umBlutversorgung von benachbarten Blutgefäßen verhindern (siehe die Position der Clips auf 1A, D, E, grüne Pfeile).
  5. Optional: Fügen Sie Heparin-Lösung (6 USP-Einheiten / ml), die Blutgerinnung zu verhindern. Tropfenweise 0,5 ml Heparin-Lösung auf den isolierten Darm hinzuzufügen.
  6. Nasse sterile nicht-haft Pad zarte Tücher mit Kochsalzlösung vorgewärmt auf 37 ° C und OP-Bereich gelten. Stellen Sie sicher, dass bleibt Tücher während des gesamten Verfahrens nass.
  7. Pflegen Ischämie für 60 min unter Verwendung von 1-1,5% Isofluran-Narkose im gesamten Gebäude. Wenn Ischämie Verfahren korrekt durchgeführt wird, wird der ischämischen Region Wein in der Farbe rot in etwa 30 Minuten ändern. Beachten Sie, dass die Blutgefäße distal der Clipposition während der Ischämie (Abbildung 1, rechts Platten) , die erfolgreiche Okklusion vergrößert.
  8. genau überwachen die Maus während der Ischämie-Phase. Weiterhin Kochsalzlösung in die nicht-adhärenten pad anzuwenden Abdecken der Operationsstelle.
  9. Kennzeichendie Ränder des ischämischen Bereich von 20 & mgr; l auf dem Gewebe Gill`s 3 Hämatoxylin Pipettieren zum Vergleich (1E, rechte Tafel) Ernten der ischämischen Gewebe und benachbarte gesunde Gewebe aus der gleichen Maus zu erleichtern.

4. Reperfusion Bühne

  1. Am Ende der Ischämie fügen einige Tropfen Kochsalzlösung auf der Clip und sanft mikrovaskulären Clips mit Clip-Anbringvorrichtung entfernen. Dann drücken Sie vorsichtig den Darm wieder in die Bauchhöhle Salzlösung angefeuchtete Wattestäbchen verwenden. Nicht ausreichend tragfähige Unterlage und schließen Sie die Bauchdecke und die Haut mit 9 mm Edelstahl Wundklammern. Wenn Reperfusion durchgeführt wird, die länger als 3 Stunden, eine resorbierbare Vicryl Naht verwenden, um die Bauchdecke zu schließen, bevor Wundklammern auf die Haut aufgebracht wird.
  2. Pflegen Mäuse in einem geheizten sauberen Käfig für die gewünschte Zeitdauer (30 min, 60 min, 120 min bzw. 180 min) für die Reperfusionsphase.
  3. Überprüfen Tiere mindestens alle 30 min Stabilität zu gewährleisten.
5. Necropsy und Ernten des Dünndarms

  1. Euthanize Mäuse durch CO 2 Überdosis gefolgt durch zervikale Dislokation zu der gewünschten Zeit nach Reperfusion.
  2. Öffnen Sie Bauchhöhle und sammeln das ischämische Darmgewebe zur weiteren Analyse. Ernte gesund normales Gewebe neben dem verletzten Gewebe als interne Kontrolle zu Konto für jede systemische Reaktion auf eine Verletzung.
    Hinweis: Diese Kontrolle ist besser geeignet als die Scheinkontrollmäuse betrieben, weil scheinoperierten Mäusen keine systemische Reaktion auf IR-induzierte Schädigung erleiden.
  3. Waschen Sie den Darminhalt 30 ml Spritze mit aufgesetzter Sondennadel mit Kochsalzlösung gefüllt und anschließend schneiden Sie den Darm in Längsrichtung. Wenn eine Probe des Darmes für die Genexpressionsanalyse erforderlich ist, schneiden Sie ein 1,5 mm-Fragment in Längsrichtung, und verwenden Sie das restliche Stück für die histologische Analyse.
  4. Für die histologische Analyse, bereiten eine Schweizer Rolle ein Paar Zangen mit dem intest rollenine.
  5. Zur Aufrechterhaltung der gerollter Form, legen Sie die Stücke des Darms zwischen Biopsie Schaumstoffpolster in Gewebekassetten (Abbildung 2). Legen Sie die Kassetten in 10% gepuffertem Formalin.
  6. Fix Gewebe in Formalin für mindestens 24 Stunden. Ersetzen Formalin mit 70% Ethanol für weitere 24 hr. Store Gewebe in 70% igem Ethanol bei Raumtemperatur unbegrenzt.
  7. Einbetten von in Paraffin, schneiden 5 um - Schnitte und flecken mit Hämatoxylin und Eosin ein Standardprotokoll (Abbildung 3) verwendet wird .

6. Scoring

  1. Ergebnis der Maus - Ischämie-Reperfusionsschaden wie in Tabelle 2 zusammengefasst. Wählen Sie eine geeignete Scoring - Methode.
  2. Optional: Teilen Sie das Sichtfeld in vier Abschnitte, da die Schwere der Verletzung im gesamten Abschnitt variiert.
  3. Berechnen Sie den durchschnittlichen Grad von jedem Abschnitt von Partituren blind erhalten.
  4. Vergleichen Sie die Klasse des verletzten Gewebes zwischen den Fällen und Kontrolle sowie zu the heil Gewebe einen Kruskal-Wallis-Test verwenden, gefolgt von einem mehrVergleichsTest Dunn.

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Ergebnisse

Wir optimieren das Versuchsprotokoll von IR-Operation reproduzierbare IR induzierte Schädigung des Ileum bei Mäusen zu erhalten. Repräsentative Ergebnisse sind in diesem Abschnitt dargestellt.

Abbildung 1 zeigt Beispiele von mikrovaskulären Clips Position Ischämie des Ileum zu induzieren. Schwarze Pfeile zeigen Position der Haupt Clips erster Ordnung Zweige der A. mesenterica superior Okkludieren. Grüne Pfeile...

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Diskussion

Die Entwicklung von Mausmodellen der intestinalen Verletzungen IR haben stark verbessert das Verständnis der Mechanismen der Gewebeverletzung und bei der Entwicklung von potentiellen therapeutischen Strategien Aided zu Gewebeschäden 7,9,11,34 minimieren. Die kritischen Schritte dieses Protokolls sind die richtige Positionierung der mikrovaskulären Clips, richtige Timing der Ischämie und korrekte histologische Untersuchung des IR-Verletzung.

Die Dauer der Ischämie ist kritisch für ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von russischen Science Foundation unterstützt wurde, gewähren keine. 14-50-00060 und LLC RUSCHEMBIO. Diese Arbeit wurde von der Morbus und Colitis Grundlage von Amerika gewähren 294.083 (AVT), und von NIH Zuschusses RO1 DK47700 (CJ) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
HeizkissenSunbeamE12107-819Alternative: Braintree Scientific Heizkissen
Tischgerät für die ForschungsanästhesieVascoUCAP 0001-0000171Alternative: Parkland Scientific, V3000PS
Nose ConeParkland ScientificARES500
Scavenger-Kanister und ErsatzpatroneParkland Scientific80000, 80120
InduktionskammerSurgivetV711802
IsofluranPiramal HealthcareNDC 66794-013-10Kontrollierte Substanz, kontaktieren Sie IACUC
Tierschermaschine Oster Oster Golden A5 078005-050-003
AugensalbeWebster8804604
BuprenorphinMcKesson562766Kontrollierte Substanz, Kontakt IACUC
Ketaset (Ketamin HCl)PfizerNADA 45-290Geregelte Substanz, Kontakt IACUC
WattestäbchenPuritanische Medizinprodukte806-WCAutoklav vor Gebrauch
BetadinePurdue Products67618-150-1710% Povidon-Jod
Sterile KochsalzlösungAspen46066-807-60Vor Gebrauch auf Raumtemperatur einstellen
IR-NagetierthermometerBIOSEBBIO-IRB153
Mikrovaskuläre Clips, 70 gRoboz Chirurgisch RS5424, RS5435Alternativ: WPI 14121, für SMA-Okklusion
Mikrogefäßclips, 40 gRoboz ChirurgischRS6472Alternative: WPI 14120, für den Verschluss von Kollateralgefäßen
Clip-AnlegezangeWorld Precision Instruments14189Alternative: Roboz #RS-5410 oder  #RS-5440
Gill's 3 HämatoxylinThermo Scientific14-390-17
Chirurgische Klammern, Reflex 9 mmCell Point Scientific201-1000
Autoclip-ApplierBeckton Dickinson427630
Byopsy FoamPad SimportM476-1
GewebekassetteFisher Healthcare15182701AHistosette II Kombination Deckel und Boden
10% gepuffertes FormalinFisher Scientific245-684
Chirurgische IrisschereWorld Precision Instruments501263-G SCAlternative: Roboz RS6816
Schere zur BedienungWorld Precision Instruments501219-GAlternative: Roboz RS6814
AbrichtzangeRoboz SurgicalRS-5228, RS-8122Alternative: World Precision Instruments 1519-G
Heparin, endotoxinfrei, 300 USP-Einheiten/Fläschchen, 50 mgSigma2106
Reflex Pinzette zum Entfernen von WundclipsRoboz SurgicalRS-9263Alternative: World Precision Instruments: 500347
Mäuse C57BL/6J Mäuse Jackson LaboratoryBest.-Nr. 0664
Telfa nicht adhärente Verbände, 3 x 4, sterilCoviden1050
Fisherbrand TransferpipettenFischer Scientific13-711-5AMVerwenden Sie Pipetten, um Kochsalzlösung tropfenweise hinzuzufügen

Referenzen

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