Identifizierung kritischer Bedingungen für die Immunfärbung in der Erbsenblattlaus Embryos: Erhöhung Gewebepermeabilität und abnehmender Hintergrundfärbung

Gee-Way Lin; Chun-che Chang

doi:10.3791/53883

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Methodenartikel

Identifizierung kritischer Bedingungen für die Immunfärbung in der Erbsenblattlaus Embryos: Erhöhung Gewebepermeabilität und abnehmender Hintergrundfärbung

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DOI:

10.3791/53883

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2. Februar 2016

Gee-Way Lin¹^,² , Chun-che Chang¹^,²^,³^,⁴

¹Department of Entomology, National Taiwan University, ²Institute of Biotechnology, National Taiwan University, ³Research Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine, National Taiwan University, ⁴Genome and Systems Biology Degree Program, National Taiwan University and Academia Sinica

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll der Ganzbett-Immunfärbung an Blattlausembryonen vorgestellt, in dem kritische Bedingungen für die Verringerung der Hintergrundfärbung und die Erhöhung der Gewebepermeabilität behandelt werden. Diese Bedingungen wurden speziell für den effektiven Nachweis der Proteinexpression im embryonalen Gewebe von Blattläusen entwickelt.

Zusammenfassung

Die Erbsenblattlaus Erbsenlaus, mit einem sequenzierten Genoms und reichlich phänotypische Plastizität, hat sich zu einem aufstrebenden Modell für genomische und Entwicklungsstudien. Wie andere Blattläuse, A. Pisum ausbreiten schnell über parthenogenetic viviparous Vervielfältigung, in denen die Embryonen im Ei Kammern in einem Fließband in der Ovariole. Bisher haben wir eine robuste Plattform von ganzen-mount in situ Hybridisierung ermöglicht Detektion von mRNA-Expression in den Blattlaus Embryonen etabliert. Zur Analyse der Expression von Protein, obwohl, etablierten Protokolle für die Immunfärbung der Ovariolen der asexuellen viviparous Blattläuse nicht zu befriedigenden Ergebnissen. Bedingungen für die Erhöhung der Gewebepermeabilität und Verringern der Hintergrundfärbung, die beide Probleme bei der Anwendung von etablierten Ansätzen optimiert berichten wir hier. Optimierungen umfassen: (1) Inkubation mit Proteinase K (1 ug / ml, 10 min), die wesentlich f gefunden wurdeoder Antikörper-Penetration in mittleren und späten Stadium Blattlaus Embryonen; (2) Austausch von normalem Ziegenserum / Rinderserumalbumin mit einem Blockierungsreagenz durch eine Digoxigenin (DIG) geliefert -basierte Puffer gesetzt und (3) Anwendung von Methanol statt Wasserstoffperoxid (H _{₂ O 2)} zum Bleichen von endogenen Peroxidase; welche deutlich reduziert die Hintergrundfärbung in der Blattlaus Gewebe. Diese kritischen Bedingungen für die Immunfärbung optimiert werden effektive Erkennung von Genprodukten in den Embryonen von A. Pisum und andere Blattläuse zu ermöglichen.

Einleitung

Blattläuse sind hemipteran Insekten mit kleinen (1-10 mm) weichen Körper. Sie ernähren sich von Pflanzen durch das Saugen Phloemsaft mit stechenden Mundwerkzeuge. Darüber hinaus setzen sie auf eine obligate Endosymbionten Bakterium, Buchnera aphidicola, um essentiellen Aminosäuren, die einen Mangel an der Phloemsaft Ernährung sind zu synthetisieren. Blattläuse haben einen komplexen Lebensgeschichte, die parthenogenetic viviparous Reproduktion im Frühjahr und Sommer Langtagsphotoperioden und sexuelle oviparous Wiedergabe durch Kurztagsphotoperioden, in denen sie eine begrenzte Anzahl von überwinternden Eiern ^1,2 lag ausgelöst umfa....