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Methodenartikel

Identifizierung kritischer Bedingungen für die Immunfärbung in der Erbsenblattlaus Embryos: Erhöhung Gewebepermeabilität und abnehmender Hintergrundfärbung

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DOI:

10.3791/53883

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2. Februar 2016

 , 
1Department of Entomology, National Taiwan University, 2Institute of Biotechnology, National Taiwan University, 3Research Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine, National Taiwan University, 4Genome and Systems Biology Degree Program, National Taiwan University and Academia Sinica

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll der Ganzbett-Immunfärbung an Blattlausembryonen vorgestellt, in dem kritische Bedingungen für die Verringerung der Hintergrundfärbung und die Erhöhung der Gewebepermeabilität behandelt werden. Diese Bedingungen wurden speziell für den effektiven Nachweis der Proteinexpression im embryonalen Gewebe von Blattläusen entwickelt.

Zusammenfassung

Die Erbsenblattlaus Erbsenlaus, mit einem sequenzierten Genoms und reichlich phänotypische Plastizität, hat sich zu einem aufstrebenden Modell für genomische und Entwicklungsstudien. Wie andere Blattläuse, A. Pisum ausbreiten schnell über parthenogenetic viviparous Vervielfältigung, in denen die Embryonen im Ei Kammern in einem Fließband in der Ovariole. Bisher haben wir eine robuste Plattform von ganzen-mount in situ Hybridisierung ermöglicht Detektion von mRNA-Expression in den Blattlaus Embryonen etabliert. Zur Analyse der Expression von Protein, obwohl, etablierten Protokolle für die Immunfärbung der Ovariolen der asexuellen viviparous Blattläuse nicht zu befriedigenden Ergebnissen. Bedingungen für die Erhöhung der Gewebepermeabilität und Verringern der Hintergrundfärbung, die beide Probleme bei der Anwendung von etablierten Ansätzen optimiert berichten wir hier. Optimierungen umfassen: (1) Inkubation mit Proteinase K (1 ug / ml, 10 min), die wesentlich f gefunden wurdeoder Antikörper-Penetration in mittleren und späten Stadium Blattlaus Embryonen; (2) Austausch von normalem Ziegenserum / Rinderserumalbumin mit einem Blockierungsreagenz durch eine Digoxigenin (DIG) geliefert -basierte Puffer gesetzt und (3) Anwendung von Methanol statt Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) zum Bleichen von endogenen Peroxidase; welche deutlich reduziert die Hintergrundfärbung in der Blattlaus Gewebe. Diese kritischen Bedingungen für die Immunfärbung optimiert werden effektive Erkennung von Genprodukten in den Embryonen von A. Pisum und andere Blattläuse zu ermöglichen.

Einleitung

Blattläuse sind hemipteran Insekten mit kleinen (1-10 mm) weichen Körper. Sie ernähren sich von Pflanzen durch das Saugen Phloemsaft mit stechenden Mundwerkzeuge. Darüber hinaus setzen sie auf eine obligate Endosymbionten Bakterium, Buchnera aphidicola, um essentiellen Aminosäuren, die einen Mangel an der Phloemsaft Ernährung sind zu synthetisieren. Blattläuse haben einen komplexen Lebensgeschichte, die parthenogenetic viviparous Reproduktion im Frühjahr und Sommer Langtagsphotoperioden und sexuelle oviparous Wiedergabe durch Kurztagsphotoperioden, in denen sie eine begrenzte Anzahl von überwinternden Eiern 1,2 lag ausgelöst umfasst. Im Frühjahr diesen Eiern schlüpfen, um die erste Generation der rein weiblichen Blattläusen (fundatrices) zu produzieren, nach vielen Runden parthenogenetic Wiedergabe bis in den Herbst. Die zyklische Parthenogenese in Blattläuse, wo asexuelle und sexuelle Phasen wechseln im jährlichen Lebenszyklus hat sich als eine evolutionäre Neuheit 1,2 angesehen. In den parthenogenetic viviparous BlattläuseNimmt der Embryogenese innerhalb Ei Kammern der Eierstock-Tubuli (Ovariolen). Im Gegensatz dazu entwickeln sexuelle oviparous Embryonen in die befruchtete Eier. Abgesehen von der reproduktiven Plastizität kann Blattläuse transgeneFlügel polyphenism Anzeigen: als Antwort auf Überbelegung Signale und Raubtier-Bedrohungen können die unwinged asexuelle Weibchen lebendgebärender produzieren geflügelten Nachkommen für Langstreckenwanderung. Veröffentlichung der Genomsequenz des Erbsenblattlaus Erbsenlaus -die erste Genomsequenz für eine basale hemimetabolous insekten ermöglicht die weitere Erforschung der reproduktiven Plastizität Flügel polyphenism und weitere Funktionen, darunter Insekten-Pflanzen-Interaktionen, virale Vectoring und Symbiose in Blattläuse auf molekularer Basis 3.

Zusätzlich zu dem sequenzierten Genoms werden Werkzeuge zum Charakterisieren Genexpression und die Funktion zur Förderung der Erbsenblattlaus als reife Modellorganismus 4 erforderlich. Wir haben robuste Protokolle der ganzen-mount beschrieben in situ-Hybridisierung zum Nachweis der Expression von mRNA in Blattlaus Embryonen 5-7. RNA-Interferenz (RNAi) durch doppelsträngige RNA-Injektion und Fütterung für Gen-Silencing in Blattlaus Nymphen und Erwachsene verwendet worden, aber stabilen Bedingungen für die Gen in den Embryonen Knockdown noch nicht gemeldet 8-10. Immunfärbung, ein Antikörper-basierten Ansatz, der Protein-Expression in Proben nachweisen kann vor und nach RNAi hat auf Erbsenblattlaus Embryonen 11-13 durchgeführt. , Erhöhung der Gewebe Durchlässigkeit und Eliminierung von Hintergrundfärbung sind jedoch noch nicht zufriedenstellend Verwendung von Standardprotokollen für die Immunfärbung in der asexuellen viviparous Embryonen von Erbsenblattlaus. Beispielsweise fanden wir, dass das Eindringen von Antikörper zu den Geweben verringert in gastrulating Embryonen (Stufen 8-10), und dass Embryonen morphologisch identifizierbaren Extremitätenknospen (Stufen 13-14) waren kaum durchlässig für Antikörper. Darüber hinaus wurde die Hintergrundfärbung in der ungeschlechtlichen viviparo visualisiertus Erbsenblattlaus Embryonen färbt unter Verwendung von Antikörper gegen die Keimbahn Marker Vasa als auch die gegen das Engrailed / Invected Protein in den embryonalen Segmente 12,13 ausgedrückt. Tatsächlich Hintergrundfärbung noch in Embryonen mit dem sekundären Antikörper allein gefärbt deutlich sichtbar.

Um die Durchlässigkeit ohne Beschädigung Integrität Blattlaus Geweben erhöhen wir sorgfältig titriert die Konzentration von Proteinase K und bestimmt optimale Bedingungen für die Gewebeverdauungs auf Blattläuse Embryonen. Um nicht-spezifische Färbung in der Erbsenblattlaus zu vermeiden, suchten wir nach Verbindungen, die effektiv blockieren könnten Embryonen und zu unterdrücken Aktivität von endogenen Peroxidase (POD), ein Enzym zur Verstärkung von Signalen während der Immunfärbung eingesetzt. Ein Blockierungsmittel durch eine Digoxigenin (DIG) basierende Puffersatz vorgesehen ist, sondern die traditionell verwendet normalem Ziegenserum (NGS) / Rinderserumalbumin (BSA), deutlich reduziert Hintergrundfärbung. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Methanol InHiBit des endogenen POD-Aktivität wirksamer als Wasserstoffperoxid (H 2 O 2). Einzelheiten bezüglich dieser Blattlaus-spezifischen Bedingungen für die Immunfärbung an Embryonen wird in den folgenden Abschnitten beschrieben werden.

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Protokoll

1. Kultur der Blattläuse

. HINWEIS: Der Laborstamm des parthenogenetic viviparous Erbsenblattlaus A pisum wurde ursprünglich in der Zentral-Taiwan gesammelt und hat sich auf Wirtspflanzen (der Gartenerbse Pisum sativum oder Saubohne Vicia faba) unter Langtagsphotoperiode für mehr als 300 Generationen erzogen worden (einer Generation: ~ 10 Tage).

  1. Keimung von Samen
    1. Weichen Sie die Samen der Wirtspflanzen in Leitungswasser für 3-5 Tage bei RT. Nachfüllen mit frischem Wasser einmal pro Tag.
      HINWEIS: Alternativ setzen Samen der Wirtspflanzen direkt in feuchten Boden kann die Keimung sowie zu induzieren.
    2. Wachsen 10 keimenden Samen in einem kleinen Topf (Durchmesser von 9 cm x 7 cm hoch) mit Erde in der Wachstumskammer unter Photoperiode 16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit bei 20 ° C.
    3. Über 10 Tage nach Wachstum beginnt, übertragen Blattläuse auf Pflanzen, deren Höhe mehr als 8 cm.
  2. Übertragung der Blattläuse
    1. Halten Sie jeden Topf von Pflanzen in einem 1 L Becherglas, übertragen 8 erwachsene Blattläuse auf Pflanzen mit einem Pinsel, und dann verschließen Sie den Becher mit einem luftdurchlässigen Abdeckung wie Gaze Mesh Blattläuse der Flucht zu hindern.
    2. Blattläuse in einer Wachstumskammer inkubieren Photoperiode 16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit bei 20 ° C. Wasser jeden Blumentopf von Pflanzen jeden Tag neu.
    3. Zum Erhalt der nächsten Generation von Blattläusen, wiederhole Schritte 1.1.3-1.2.2 zehn Tage nach der primären Blattlaus Übertragung.

2. Dissection und Fixierung der Eierstöcke

  1. Frisch in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Fixierungspuffer Herstellung von 4% Paraformaldehyd (PFA).
  2. Füllen Sie eine Vertiefung einer Tüpfelplatte mit PFA (etwa 500 ul), legen Sie die Platte unter einem Stereomikroskop bei geringer Vergrößerung, und tauchen Sie ein Erwachsener Blattlaus in der PFA für die Präparation.
  3. Sezieren Eierstöcken, indem Sie den Kopf und Bauch mit einem Satz von Zangen, Aufschneiden der RückenKutikula des Bauches, und Ziehen der Eierstöcke von der Bauchhöhle.
  4. Fix drei Paare von Eierstöcken in ein 1,5 ml Röhrchen, enthaltend 1 ml PFA bei RT für 20 min.
  5. Dekantieren Fixierungspuffer mit einer Transferpipette (Glas- oder Einweg) und waschen Sie die Eierstöcke mit 0,2% Triton X-100 in 1 × PBS (PBST) 3-mal für jeweils 10 min dann. Mild Schütteln auf einem Mischer / Rotator (Drehwinkel: 60 ° (F60) / Drehzahl: 8 RPM) ist sowohl für die Fixierung und spülmaschinengeeignet.

3. Die Behandlung mit Proteinase K (PK), die Permeabilität Embryonalgewebe Erhöhen

HINWEIS: PK Behandlung Embryonen aus Keimband Erweiterung Weiter (Stufe 11 der Entwicklung) angewandt. Für die jüngeren Embryonen, ist dieser Schritt optional.

  1. Seriell verdünnter die Stammlösung von PK (10 mg / ml) mit 1x PBS auf die Arbeitskonzentration 1 ug / ml.
  2. Eierstöcke mit 1 ug / ml PK (etwa 500 ul) Inkubieren für 10 min mit leichtem Schütteln.
  3. Dekantieren PK solutiauf und dann waschen die Eierstöcke mit 700 & mgr; l von Glycine (2 mg / ml) 3 Mal für jeweils 5 Minuten.
  4. Zweimal waschen Eierstöcke mit 0,2% PBST 10 min je.
  5. Fix Eierstöcke wieder mit Fixations Puffer für 15 min bei RT mit mildem Schütteln.
  6. Überstand verwerfen und waschen Eierstöcke mit 0,2% PBST zweimal je 10 min.

4. Methanol Inkubation zur Unterdrückung der endogenen Peroxidase (POD) Aktivität

HINWEIS: Methanol Inkubation ist nicht auf Embryonen Phalloidin-Färbung oder Antikörper-Epitope, die Methanol empfindlich sind zogen angewendet.

  1. Seriell dehydratisieren Ovarien mit unterschiedlichen Prozentsatz von Methanol in 0,2% PBST (v / v: 1: 3, 1: 1, 3: 1) durch Inkubation Ovarien bei jeder Konzentration von Methanol-Lösung für 10 min unter leichtem Schütteln.
  2. Dehydratisieren Ovarien mit 100% Methanol für 1 h bei RT mit mildem Schütteln.
    HINWEIS: Zufriedenstellende Ergebnisse der Färbung konnte immer noch von Blattlaus Gewebe, die in 100% Methanol bei gespeichert wurden erhalten -20 &# 176; C für einen Monat.
  3. Seriell rehydrieren Ovarien mit unterschiedlichen Prozentsatz von Methanol in 0,2% PBST (v / v: 3: 1, 1: 1, 1: 3) durch Inkubation Ovarien bei jeder Konzentration von Methanol-Lösung für 10 min unter leichtem Schütteln.

5. Antikörper-Färbung

  1. Verdünnen Sie den 10x Blockierungslösung aus dem DIG-basierten Puffersatz (DIG-B) auf 1x.
    HINWEIS: Die 1x DIG-B Blockierungslösung ist effektiver zur Verringerung des Hintergrundfärbung als die Standard-Blockierungsmittel aus 5% (v / v) normales Ziegenserum (NGS) und 0,5% (v / v) Rinderserumalbumin (BSA ) in 0,2% PBST.
  2. Inkubieren der Eierstöcke mit dem 1x DIG-B Blockierungslösung für 2,5 bis 4 h bei RT oder O / N bei 4 ° C mit mildem Schütteln.
    HINWEIS: drei Paare von Eierstöcke in einem 1,5-ml-Röhrchen, beträgt 200 & mgr; l und dem minimalen Volumen für Proben Sperrung und Antikörperfärbung.
  3. Überstand dekantieren und ersetzen mit frischem 1x DIG-B Sperrlösung, die primären Antikörper in geeigneten dilutiauf Verhältnis. Färben die Eierstöcke 4 h bei RT oder O / N bei 4 ° C mit mildem Schütteln.
    HINWEIS: Bei dem hier beschriebenen Experiment, verwenden Sie die folgenden optimalen Verdünnungen des primären Antikörper: (1) ApVas1 Antikörper: 1: 500 für chromogene Färbung 1.50 für Immunfluoreszenzfärbung; (2) Anti-α Tubulin-Antikörper: 1: 500; (3) 4D9 monoklonale Antikörper: 1:25.
  4. Waschen Sie die Eierstöcke mit 0,2% PBST 4-mal für 15 Minuten jeweils.
  5. Inkubieren Ovarien 1x DIG-B Blockierungslösung für 1 Stunde bei RT mit mildem Schütteln.
  6. Überstand dekantieren und ersetzen mit frischem 1x DIG-B Sperrlösung, die Sekundär-Antikörper in geeigneten Verdünnungsverhältnis. Färben die Eierstöcke 4 h bei RT oder O / N bei 4 ° C mit mildem Schütteln.
    1. Verwenden Sie die folgenden Verdünnungsverhältnisse von Sekundärantikörper: (1) Für die Immunfluoreszenzfärbung: 1: 500 für Alexa Fluor 633 Ziege-Anti-Kaninchen-IgG oder Alexa Fluor 488 Ziege-Anti-Maus-IgG; (2) Für chromogene Färbung: 1: 200 zur biotinyliertem Ziege-Anti-Kaninchen-IgG.
      HINWEIS: Der biotinylierte sekundäre Antikörper wird zur Wechselwirkung mit dem Avidin-Biotin-Komplex (ABC) in dem Substrat-basierten (chromogenen) Erkennung, durch die die Färbung Signale signifikant verstärkt angewendet.
    2. Für Immunfluoreszenzfärbung durchzuführen Färbung im Dunkeln, weil der sekundäre Antikörper lichtempfindlich ist.
  7. Abwaschen sekundären Antikörpers mit 0,2% PBST 4 mal je 10 min.

6. Nuclear und F-Aktin-Färbung

HINWEIS: Dies ist nur für Immunfluoreszenzfärbung angewendet.

  1. Fleck Ovarien mit 0,2% PBST mit DAPI (2 ng / ul) und Phalloidin-TRITC (100 nM) für 2 h bei RT im Dunkeln.
  2. Waschen Sie die Eierstöcke mit 0,2% PBST 4 mal je 10 min.
  3. Inkubieren Eierstöcke mit dem Eindeckmedium O / N bei 4 ° C mit mildem Schütteln.

7. Signal Entwicklung

HINWEIS: Dies ist nur für chromogene Färbung aufgetragen.

  1. Vorzubereiten 100 ulReagenz Avidin-Biotin-Komplex (ABC) zum Verstärken der Signale, die durch Zugabe von 1 ul des Reagenz A (Avidin) in 98 ul 0,2% PBST über vorsichtiges Pipettieren gründlich gemischt und die Zugabe von 1 ul Reagenz B (Biotin konjugiert mit Meerrettichperoxidase ), gefolgt von sofortigem Mischen. Inkubieren des Gemisches für 30 min bei RT mit mildem Schütteln.
  2. Ovarien (einschließlich der dissoziierten Eikammern) in der Mischung der Reagenzien A und B Inkubation 30 min bei RT mit mildem Schütteln.
  3. Waschen Sie die Mischung von Reagenzien A und B mit 0,2% PBST 4 mal je 10 min.
  4. Übertragen Sie die Eierstöcke in PBST eingetaucht, um eine gut auf der Tüpfelplatte mit einem Kunststoff-Pipette.
  5. Bereiten Substratlösung von 3,3'-Diaminobenzidin (DAB): Lösen Sie eine DAB Tablet Plus über heftiges Vortexen ein anderes enthält Harnstoff-Wasserstoffperoxid in 1 ml ddH 2 O für 1 min.
    HINWEIS: DAB, ein Ausfällen von Peroxidase-Substrat, ist eine populäre Chromogen Immunfärbung. Es produziert eine brEigen- und unlöslicher Niederschlag, nachdem er durch die Peroxidase oxidiert wird. Schwache Signale können durch Zugabe von Nickelchlorid zu der Substratlösung (Endkonzentration 0,05-0,08%) verbessert werden.
  6. Entfernen Sie die in der gut restlichen PBST-Lösung und füllen mit 100 ul der DAB Substratlösung für die Signalentwicklung.
  7. Überwachen Intensität der Signale unter einem Stereomikroskop bei geringer Vergrößerung.
  8. Stopp-Reaktionen durch Entfernen des DAB-Lösung, gefolgt von der Wiederbefüllung mit 1x PBS sofort. Wiederholen Sie zweimal die Wäsche.
  9. Übertragen Sie die Eierstöcke zurück in die 1,5-ml-Tube und dann mit 1x PBS oder PBST waschen zweimal für jeweils 15 min.
  10. Eierstöcke in einem Glycerin-basierten Mounting Medium (70% Glycerin) O / N Inkubieren bei 4 ° C unter mildem Schütteln inkubiert.

8. Montage der Blattlaus Embryos

HINWEIS: Die Dicke der Blattlaus Embryonen variiert zwischen Entwicklungsstadien. Montagestrategien werden so modifiziert, dass frühe passen (germaria und Stufen 0-10), Mitte (Stufen11-18), und am späten Embryonen (Stufen 19-20), die in 2B gezeigt sind - D. Embryonalen Staging gefolgt Miura et al. 12

  1. Übertragen Sie die Eierstöcke mit Eindeckmedium auf die Zelle Tablett mit einer Plastiktropfen und beobachten Proben unter einem Stereomikroskop bei geringer Vergrößerung.
  2. Schneiden Sie die Kelche mit der seitlichen Eileiter mit Insektenstifte zugeordnet und dann auch über eine isoliert Ovariole in ein leeres Glas mit einer Pipette. Bilden Sie das Endvolumen auf 50 bis 100 & mgr; l mit Eindeckmedium.
  3. Übertragen Sie eine Ovariole auf den Objektträger mit einem Glas Tropf und dann zu sezieren Eikammern mit Insekten Pins.
    HINWEIS: Bei Embryonen älter als Stufe 6 der Entwicklung, Trennung von Eikammern vorgeschlagen; für germaria und die ersten beiden Eikammern jünger als Stufe 6 ist die Trennung optional.
  4. Verlagern einen seziert Ei Kammer auf einen sauberen Objektträger mit einem Glas Tropf.
  5. Setzen Sie ein Deckglas (Größe: 22 x 22mm) in den sezierten germaria oder Eierkammern (mit Embryonen im Stufen 1-10 von Entwicklungs) langsam, um Blasen zu vermeiden.
    1. Halterung Eikammern (enthaltend Embryonen in den Stufen 11-18 der Entwicklung) auf einer Folie mit einseitiger Deck Brücke und Stelle noch ein Deckglas (Größe: 18 x 18 mm) oben auf der Probe.
    2. Berg Eikammern (mit Embryonen älter als Stufe 19 der Entwicklung) auf einem Objektträger mit beidseitigem Deckbrücke und legen Sie eine weitere Deckglas (Größe: 18 x 18 mm) auf der Oberseite der Probe.
  6. Füllen Sie den Raum unter der oberen Deckglas mit Montage Medien zu vermeiden, Trocknen der Probe.
  7. Mild rollen den Embryo durch Verschieben des Deckglases, um die richtige Ausrichtung für die Beobachtung zu erhalten.
  8. Dichtung um den Rand des Deckgläser (einschließlich der Brückendeckgläser) mit Nagellack.

9. Imaging Analysis

  1. Fotografisches Differentialinterferenzkontrast (DIC) Bilder der ganze-mount Embryonen mit einem compound Mikroskop mit DIC Optik und einem Trockenobjektivlinse (10X, 20X, 40X) mit einer Kamera verbunden ausgestattet. Installieren Sie die Software für die Bildübertragung zwischen Kamera und Computer mit den Anweisungen des Herstellers.
  2. Erwerben Projektionen der fluoreszenzmarkierten Embryonen mit einem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop 14. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für das Fotografieren, z-Stapeln und 3D Projizieren mit Imaging-Software.
    1. Drehen Sie den Schieber auf den Kopf, finden Sie den montierten Probe mit 10X-Objektiv, und kreisen Sie die Probenfläche mit einer feinen geölt-basierte Stift.
      HINWEIS: Das macht die Identifizierung der Probe leichter bei der Suche nach es durch Ziele eines konfokalen Mikroskops.
    2. Einen Tropfen Öl auf der Oberseite der Deckfläche, dessen gegenüberliegende Seite ist, wie in 9.2.1 beschrieben markiert.
  3. Finden Sie die Fokusebene bei 40X Ölimmersionsobjektiv dann zu einem 63X Ölimmersionsobjektiv zu ändern. Manuell die Feinfokussteuerung nach oben zu verschieben und zu tunwn um das beste Brennebene zu erfassen.
    HINWEIS: Für die Beobachtung strukturelle Details germaria und frühen Embryonen, empfehlen wir, 40X Ziele oder solche mit höherer Vergrößerung.
  4. Scannen Sie den Embryo in verschiedenen Anregungskanäle und Bild einen z-Stack zu erhalten.
    HINWEIS: Erbsenblattlaus Gewebe zu reduzieren Dicke jeder optischen Schnitt auf 1,5 um oder weniger.

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Ergebnisse

In dieser Studie, führten wir ganze-mount Immunfärbung an Embryonen der asexuellen Erbsen Blattläuse (Abbildung 1A). Diese weibliche Nachkommen zu produzieren parthenogenetisch und lebendgebärender. Diese weibliche Embryonen im Ei Kammern der Eierstock-Tubuli (Ovariolen) (Abbildung 1B und 2A). Vor der Mikroskopie, die seziert Ovariolen sind die Färbung Ziele; jedoch wird die Trennung Eikammern zur Beobachtung von Embryonen unter einem Mi...

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Diskussion

Wir identifizierten optimalen Bedingungen für eine erfolgreiche Immunfärbung in der Erbsenblattlaus A. Pisum, ein aufstrebendes Modellorganismus für genomische und Entwicklungsstudien 3,15. Optimierten Bedingungen für die Erhöhung der Gewebepermeabilität und Reduzieren der Hintergrundfärbung verstärkt die Intensität und Spezifität von Signalen. Sie unterscheiden sich von Standardprotokollen für die Immunfärbung in anderen Tiermodellen in den Schritten zum Erzeugen von Poren in Zellmembranen ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Chau-Ti Ting (Fly Core in Taiwan) für die Bereitstellung des monoklonalen 4D9-Antikörpers, Technology Commons (TechComm) vom College of Life Science NTU für die konfokale Mikroskopie, Hsiao-Ling Lu für das Korrekturlesen des Manuskripts und Chen-yo Chung für die Unterstützung bei den Dreharbeiten. CC dankt insbesondere Charles E. Cook für die strategischen Vorschläge und die kritische Bearbeitung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie (101-2313-B-002-059-MY3 und 104-2313-B-002-022-MY3 für GWL und CC) und der National Taiwan University (NTU-CESRP 101R4602D3 für CC; 103R4000 für GWL) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
30% Wasserstoff-Perxidase (H2O2)Sigma-Aldrich18304Zum Bleichen der endogenen Peroxidase von Embryonen.
4' 6-Diamidino-2-phenyl-indol-dihydrochlorid (DAPI)Sigma-AldrichD9542Zur Markierung der Doppelstrang-DNA. GIFTIG. Tragen Sie Handschuhe, geben Sie in kleine Aliquots und feeze, um die Exposition zu minimieren
4D9 anti-engrailed/invected Maus monoklonale AntikörperEntwicklungsstudien Hybridom BankAB_528224Zur Markierung der sich entwickelnden Segmente des Embryos.
ApVas1 polyklonaler Kaninchen-AntikörperUnser LaborN/AZur Markierung des Keimbahn-spezifischen Vas1-Proteins der Blattlaus in Embryonen. Dieser Antikörper wurde von unserem Labor hergestellt.
Austerlitz InsektenstifteENTOMORAVIAN/AZum Trennen jeder Eikammer von einer Eierzelle. Größe 000, SCHWARZ EMAILLIERT.
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-Aldrich9048-46-8Zur Blockierung der unspezifischen Bindung von Antikörpern.
Kamera verbunden mit VerbundmikroskopCanonEOS 5DZum Fotografieren von Blattlausembryonen.
Kolorimetrisches 8-Zellen-TablettKartell Labware357Zur Entwicklung des Färbesignals von Blattlausembryonen. Durchmesser 95 x 57 mm, Zellentiefe 2 mm.
Durchlichtmikroskop mit DIC-OptikLeica MicrosystemsDMRZum Fotografieren von Blattlausembryonen, die auf den Objektträgern montiert sind.
DIG Wash and Block Buffer SetSigma-Aldrich (Roche)11585762001Zur Blockierung der unspezifischen Bindung von Antikörpern. Wir haben die 10x Blockierungslösung in 1x als Blockierungsreagenz verdünnt.
PinzetteIdeal-tekN/AZum Sezieren von Eierstöcken von Blattläusen. Hersteller-Nr. 5: 5 SA. 
GlastropferN/AN/AZum Übertragen von Eierstöcken von Blattläusen von der Slotplatte auf die Röhrchen. 150 mm Gesamtlänge und 5 3/4" Spitzenlänge.
GlycerolSigma-AldrichG5516Zur Reinigung von Blattlausembryonen und zur Montage.
GlycinBioshopN/AZur Blockierung der Enzymaktivität der Proteinase K (PK).
Ziegen-Anti-Maus-IgG-konjugiertes Alexa Fluor 488InvitrogenA11017Zum Nachweis von Primärantikörpern aus der Maus.
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-konjugiertes Alexa Fluor 633InvitrogenA21072Zum Nachweis von Primärantikörpern von Kaninchen.
Intelli MischerELMI LaborgerätRM-2MZur Verbesserung der gründlichen Reaktion von Reagenzien mit den Eierstöcken.
Konfokale Laserscanning-MikroskopieLeica MicrosystemsSP5Zum Fotografieren von Blattlausembryonen, die auf Objektträgern mit florecent Etikett montiert sind.
Methanol Burdick und JacksonAH2304Zum Bleichen der endogenen Peroxidase von Embryonen.
Objektträger Thermowissenschaftliche10143560Für die Einbettung von Embryonen. SUPERFROST geschliffene Kanten, ca./env. 76 x 26 mm.
Mikroskop AbdeckbrilleMarienfeld0101030Zum Befestigen von Embryonen auf den Objektträgern. Größe 18 x 18 mm. Dicke Nr. 1 (0,13 bis 0,16 mm)
Mikroskop DeckglasMarienfeld0101050Zum Befestigen von Embryonen auf den Objektträgern. Größe 22 x 22 mm. Dicke Nr. 1 (0,13 bis 0,16 mm)
Monoklonaler Maus-Anti-alphaTubulin-Antikörper (DM1A)Santa Cruz Biotechnologysc-32293Zur Markierung der Verteilung von Alpha-Tubulin in Zellen.
NagellackN/AN/AZum Versiegeln der Deckgläser auf den Objektträgern.
Normales Ziegenserum (NGS)Sigma-AldrichG9023Zur Blockierung der unspezifischen Bindung von Antikörpern.
Paraformaldehyd (PFA)VWRMK262159Zur Fixierung von Blattlaus-Eierstöcken.
Phalloidin-TRITCSigma-AldrichP1951Zur Markierung der Verteilung von F-Aktin auf Embryonen.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)N/AN/AAls isotonische Lösung für Blattlaus-Eierstöcke.
Pipetteaus Kunststoff N/AN/AZum Transfer der Eierstöcke von Blattläusen von der Tube in die Zellschale. Größe 3 ml. 
Proteinase KMerck124678Zur Schaffung von Poren (Stanzen) auf der Zellmembran und zur Erleichterung des Zugangs von Antikörpern.
Pyrex-SpotplatteN/AN/AFür die Dissektion und Farbreaktionen von Blattlaus-Eierstöcken unter der Mikroskopie. Jeder Hohlraum mit einem Durchmesser von 22 mm und  Tiefe 7 mm.
SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) TablettenSigma-AldrichD4168Für die Entwicklung von substratierten Signalen. Auch DAB-Peroxidase-Substrat-Tablettenset genannt.
StereomikroskopLeica MicrosystemsEZ4Zum Sezieren und Betrachten von Blattlaus-Eierstöcken.
Triton-X 100Sigma-AldrichT8787Zum Erzeugen von Poren (Stanzen) auf der Zellmembran.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)Vector laboratoriesPK-6101Zur Verstärkung des Signals. Einschließlich biotinylierter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper, A- und B-Reagenzien.
VECTASHIELD EindeckmediumVector laboratoriesH1000Zur Reinigung von Blattlausembryonen und zur Einbettung.

Referenzen

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