In - vitro - Zerlegung von Influenza - A - Virus Kapside durch Gradientenzentrifugation

Sarah Stauffer; Firat Nebioglu; Ari Helenius

doi:10.3791/53909

Methodenartikel

In - vitro - Zerlegung von Influenza - A - Virus Kapside durch Gradientenzentrifugation

DOI:

10.3791/53909

⸱

27. März 2016

Sarah Stauffer¹^,² , Firat Nebioglu³ , Ari Helenius¹

¹Institute of Biochemistry, ETH Zurich, ²Department of Biochemistry, University of Zurich, ³Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Demontage von Influenza-A-Viruskernen während des Viruseintritts in Wirtszellen ist ein mehrstufiger Prozess. Wir beschreiben eine in vitro Methode, um die frühen Stadien der viralen Enthüllung zu analysieren. Bei diesem Ansatz wird die Geschwindigkeitsgradientenzentrifugation verwendet, um die Schritte, die die Entschichtung unter definierten Bedingungen einleiten, biochemisch zu zerlegen.

Zusammenfassung

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Säure-ausgelöste molekulare Prozesse kontrollieren den Zelleintritt vieler Viren, die durch das endozytäre System eindringen, genau. Im Falle des Influenza-A-Virus (IAV) wird die Virusfusion mit der endosomalen Membran sowie der anschließende Abbau des viralen Kapsids, die sogenannte Entschichtung, durch die ionischen Bedingungen in den endozytären Vesikeln bestimmt. Die frühen Schritte im Lebenszyklus des Virus sind schwer zu untersuchen, da experimentell kein direkter Zugang zu Endosomen möglich ist, was einen In-vitro-Ansatz erforderlich macht. Hier beschreiben wir eine Methode, die auf der Geschwindigkeitsgradientenzentrifugation von gereinigten Virionen durch einen zweischichtigen Glyceringradienten basiert und eine Analyse des IAV-Kerns und seiner Stabilität ermöglicht. Der Gradient enthält in seiner unteren Schicht ein nichtionisches Detergens (NP-40), um die Virusmembran durch Solubilisierung zu entfernen, während das Virus nach unten sedimentiert. Bei neutralem pH-Wert werden die Viruskerne als stabile Strukturen pelletiert. Die Hauptkernkomponenten, das Matrixprotein (M1) und die viralen Ribonukleoproteine (vRNPs), können in der Pelletfraktion mittels SDS-PAGE eindeutig identifiziert werden. Durch Senkung des pH-Werts auf 6,0 oder niedriger in der unteren Schicht wird M1 selektiv aus dem Pellet entfernt, gefolgt von der Freisetzung von vRNPs unter saureren Bedingungen. Virale Proteinbanden auf Coomassie-gefärbten Gelen können einer densitometrischen Quantifizierung unterzogen werden, um Zwischenzustände der IAV-Demontage zu überwachen. Neben dem pH-Wert können auch andere Faktoren, die die Stabilität des Viruskerns beeinflussen, wie z. B. die Salzkonzentration und mutmaßliche Faktoren für die virale Enthüllung, bewertet werden, indem einfach die detergenzienhaltige Glycerinschicht entsprechend modifiziert wird. Zusammengenommen ermöglicht die vorgestellte Technik eine hochgradig reproduzierbare und quantitative Analyse der viralen Enthüllung in vitro. Es kann auf andere behüllte Viren angewendet werden, die komplexe Entschichtungsprozesse durchlaufen.

Einleitung

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Influenza - A - Virus (IAV) ist ein umhülltes Virus und gehört zur Familie der Orthomyxoviridae. Seine Gene codiert sind auf einem segmentierten, Negativ-sense und einzelsträngige RNA-Genom. Beim Menschen verursacht IAV Infektionen der Atemwege, die ¹ für die globale Pandemien saisonalen Epidemien und trägt das Potential auftreten. Nach Bindung an Sialinsäure-Reste auf der Zelloberfläche ² wird IAV internalisiert von Clathrin-abhängige Endozytose und Clathrin-unabhängige Wege ^3-8. Das saure Milieu (pH <5,5) in den endozytischen Vakuolen löst eine große Konformationsänderung des IAV - Spike - Glykoprotein - Hämagglutinin (HA),....

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Protokoll

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1. Herstellung von Puffer und Stammlösungen

Bereiten MNT - Puffer (20 mM MES, 30 mM Tris und 100 mM NaCl) durch Auflösen von 470 mg Tris - Hydrochlorid, 390 mg MES - Hydrat und 580 mg NaCl in 80 ml ddH ₂ O. Stellen Sie den Puffer auf pH 7,4 und bringt es auf ein Endvolumen von 100 ml mit ddH ₂ O.
Bereiten Sie drei identische Lösungen von 500 mM MES - Puffer durch Auflösen von 9,76 g MES - Hydrat in 80 ml dH ₂ O je. Stellen Sie die Puffer pH 5,8, 5,4 und 5,0 jeweils durch mit konzentrierter NaOH titriert. Bringen jeder Puffer auf ein Endvolumen von 100 ml mit dH ₂ O.
Bereiten zwei ide....

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Ergebnisse

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Wie bereits diskutiert, in Endosomen Grundierung erforderlich, um die IAV Kern uncoating kompetent zu machen. Protonierung des Kerns schwächt Wechselwirkung von M1 und vRNPs (zusammengesetzt aus den viralen RNA, NP und die Polymerase-Komplex PB1 / PB2 / PA). Dieser Prozess wird eingeleitet, wenn ankommende Virus zu einem pH-Wert von 6,5 ausgesetzt (oder niedriger) in frühen Endosomen (EBS) und wird fortgesetzt, bis die Virus-Sicherungen bei etwa pH 5,0 in LEs.

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Diskussion

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Virale Capside sind metastabile makromolekularer Komplexe. Während Zusammenbau von Virionen, die Einkapselung und Kondensieren des Virusgenoms erfordert, hängt Einleitung der nächsten Runde der Infektion auf die Demontage dieser kompakten Kapsidstruktur. Viren entwickelt haben verschiedene zelluläre Mechanismen zu nutzen , um die Beschichtung-uncoating Zyklus zu steuern, einschließlich der zellulären Rezeptoren, Chaperone, proteolytischen Enzymen, physikalische bereitgestellt Kräfte , die durch Motorproteine oder Heli.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Wir danken Yohei Yamauchi und Roberta Mancini für uns mit Reagenzien bereitstellt. Das AH-Labor durch die Marie-Curie Initial Training Networks (ITN), dem European Research Council (ERC), und von der Schweizerischen National Science Foundation (Sinergia) unterstützt wurde.

....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
cOmplete™, EDTA-freie Proteasehemmer-Tabletten	Sigma-Aldrich	11873580001	Die Stammlösung kann bei 2 bis 8 Grad gelagert werden; C für 1 bis 2 Wochen
Eisessig	Merck Millipore	100063
Glycerin wasserfrei BioChemica	AppliChem	A1123
Salzsäure	Merck Millipore	100317
Lange Injektionsnadel (21 G, 9 cm, abgeschrägt oder stumpf Ende)
MES	Sigma-Aldrich	M8250
Methanol	Merck Millipore	106009
NP-40	Sigma-Aldrich	I8896	Jetzt kommerziell erhältlich als IGEPAL® CA-630
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini-Gele, 10 μl; Wells, 1,0 mm	Life Technologies	NP0321
NuPAGE LDS-Probenpuffer (4x)	Life Technologies	NP0008
NuPAGE MOPS SDS Laufpuffer (20x)	Life Technologies	NP0001
pH-Indikatorstreifen, pH 4,0-7,0	Merck Millipore	109542
QC Kolloidale Coomassie Färbung	BIO RAD	1610803
Natrium Chlorid	Merck Millipore	106406
Natriumhydroxid	Merck Millipore	106498
Steritop Filtereinheit	Merck Millipore	SCGPT05RE
SW41 Ti, Ultrazentrifugenrotorsatz	Beckman Coulter	331336
Thinwall, Ultraklare Zentrifugenröhrchen, 13,2 ml, 14 mm x 89 mm	Beckman-Schar	344059
Trishydrochlorid	AppliChem	A1087
X31 Influenza-A-Virus (H3N2), in Eiern gezüchtet, geklärte Allantoisflüssigkeit	Virapur		Frisch aufgetaut auf 4 > C

hydrat

Referenzen

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Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza....

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Schlagwörter

Velocity Gradientenzentrifugation Disassemblierung von Viruskapsiden Glycerolgradient NP 40 Solubilisierung pH abh ngiges Uncoating SDS PAGE Analyse Stabilit t des Viruskerns Matrixprotein M1 virale Ribonukleoproteine

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