Methodenartikel

Eine Methode zum Ziel und Isolieren Airway-innervating sensorischen Neuronen bei Mäusen

DOI:

10.3791/53917

⸱

19. April 2016

 , 
1Department of Cellular & Molecular Physiology, Yale University, 2Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organspezifische sensorische Neuronen sind schwer zu identifizieren. Fast Blue Tracing wird verwendet, um Nodose-Neuronen zu identifizieren, die die Atemwege für die Zellsortierung innervieren. Sortierte Nodose-Neuronen werden verwendet, um hochwertige Ribonukleinsäure (RNA) für die Sequenzierung zu extrahieren. Mit Hilfe dieses Protokolls wird die Genexpression von atemwegsspezifischen Neuronen bestimmt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Somatosensory Nerven transduzieren thermische, mechanische, chemische und schädliche sowohl von endogenen und Umwelteinflüsse verursacht Reize. Die Zellkörper dieser afferenten Neuronen innerhalb der sensorischen Ganglien. Sensorischen Ganglien ein spezifisches Organ oder Teil des Körpers innervieren. Zum Beispiel werden die Spinalganglien (DRG) in der Wirbelsäule angeordnet und erstrecken sich Prozesse im gesamten Körper und Gliedmaßen. Die Trigeminalganglien sind im Schädel und innervate das Gesicht befindet, und der oberen Atemwege. Vagal Afferenzen der nodose Ganglien erstrecken sich in den Darm, Herz und Lunge. Die nodose Neuronen steuern, um eine Vielfalt von Funktionen wie: Atemfrequenz, Reizung der Atemwege und Husten Reflexe. Somit, um ihre Funktion zu verstehen und zu manipulieren, ist es entscheidend Atemweg spezifischen neuronalen Subpopulationen zu identifizieren und zu isolieren. Bei der Maus werden die Atemwege zur retrograden Tracing von Atemwegsspezifischen nodose Neuron zu einem fluoreszierenden Tracer-Farbstoff, Fast Blue, ausgesetzts. Die nodose Ganglien dissoziiert und Fluorescence Activated Cell (FAC) Sortierung verwendet wird Farbstoff-positiven Zellen zu sammeln. Als nächstes wird aus positiven Zellen Farbstoff für die Sequenzierung der nächsten Generation extrahiert hoher Qualität Ribonukleinsäure (RNA). Mit dieser Methode Atemwegs spezifische neuronale Genexpression bestimmt wird.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Somatosensory Nerven transduzieren thermische, mechanische, chemische und schädliche sowohl von endogenen und Umwelteinflüsse verursacht Reize. Die Zellkörper dieser afferenten Nerven in sensorischen Ganglien, wie die Spinalgan, trigeminal oder nodose ganglia befindet. Jedes sensorische ganglion innervates spezifischen Regionen des Körpers und enthält Zellen, die getrennte Organe und Gewebe innerhalb dieser Region innervieren. So werden zum Beispiel die Dorsalwurzelganglien (DRG) in der Wirbelsäule angeordnet und erstrecken sich Prozesse im ganzen Körper und Gliedmaßen, während die Trigeminalganglien im Schädel befinden, enthält Neuronen, die das Gesicht, Augen, Hirnhaut oder der oberen Atemwege 1 innervate, 2. Die nodose Ganglien des Nervus vagus im Hals unterhalb des Schädels und enthält Zellkörper , die Nervenfasern im gesamten Magen - Darm - Trakt, Herz erstrecken und unteren Atemwege und Lungen 3. Beim Menschen steht das Ganglion nodosum allein, jedoch in der Maus, um es fusioniert istmit dem Ganglion jugulare, die auch die Lunge 4 innervates. Das fusionierte Ganglion wird oft die Gurgel / nodose Komplex, Vagus - Ganglion oder einfach Ganglion nodosum 5 genannt. Hier wird bezeichnet als das Ganglion nodosum.

Afferenzen der nodose passieren Informationen von den Eingeweiden zum Kern des einsamen-Darm-Trakt (NTS) im Hirnstamm. Sensorischen Input zu diesem einzigartigen Ganglion steuert eine Vielfalt von Funktionen, wie Darmmotilität 6, Herzfrequenz 7, Atmung 8,9 und Reizaktivierte Atmungsreaktionen 10,11. Bei dieser Vielfalt der Funktionen und innervated Organe ist es entscheidend, organspezifische Subpopulationen des Ganglion nodosum, um einzelne zu studieren neuronalen Bahnen zu zielen und zu isolieren. Es können jedoch die geringe Größe des nodose und die begrenzte Anzahl von Neuronen gegebenen enthält dieses keine triviale Aufgabe. Jede Maus Ganglion nodosum enthält ungefähr 5.000 Neuronen 12zusätzlich zu einer umfangreichen Bevölkerung von Satellitenzellen zu unterstützen. Von den 5.000 nodose Neuronen, nur 3 bis 5% innervate die Atemwege. Daher werden alle funktionalen, morphologische oder molekulare Veränderungen im Atemweg-innervating Neuronen, durch Atemstimulation oder Pathologien, in der dicht gepackten Ganglion nodosum verloren.

Um dieses Problem zu lösen, wurde ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung Neuronen entwickelt, die die Atemwege innervate. Die Atemwege wurden mit einem fluoreszierenden Markierungsfarbstoff ausgesetzt, um die nachfolgenden innervating nodose Neuronen zu identifizieren. Fast Blue wurde von Neuronen und wandert schnell in ihre Zellkörper aufgenommen , wo es für bis zu acht Wochen 13 zurückgehalten wird - 15. Einmal identifiziert, eine sanfte, aber wirksame, Dissoziation Protokoll verwendet wurde, Farbstoffmarkierung und die Lebensfähigkeit von Zellen fluoreszenzaktivierte Zell (FAC) Sortierung zu erhalten. Sortierte Zellen werden verwendet, um hohe Qualität Ribonukleinsäure (RNA) extrahieren Genexpression oder f, um zu bestimmenoder andere Downstream-Genanalyse. Dieses Protokoll stellt eine nützliche und robuste Technik zur Isolierung von sensorischen Neuronen, die ein Gewebe von Interesse innervate.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der Duke University genehmigt.

1. Die intranasale Verabreichung von Fast Blue

Für Fast Blue, zur Verwaltung der Farbstoff mindestens 2 Tage vor der Maus euthanizing. Der Farbstoff wird für bis zu acht Wochen andauern.

  1. Anesthetize die Maus mit Licht Inhalationsanästhesie (2,5% Sevofluran), bis zu atmen beginnt zu verlangsamen.
  2. Verwenden, um eine 200 & mgr; l-Pipette mit Filterspitzen zu langsam 40 ul Farbstofflösung vermitteln (0,4 mM Fast Blue, 1% Dimethylsulfoxid, DMSO, in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, PBS) in das Nasenloch, Pausieren gelegentlich die Maus, um sicherzustellen, Absaugen der Lösung (1A).
  3. Halten Sie die Maus vertikal, Kopf hoch, und sanft die Brust massieren der Farbstoff breitet sich in der Lunge zu gewährleisten.

2. Vorbereitung auf Dissection und Analyse Tag

  1. Bereiten Sie 10 ml0; Ganglia Dissoziationslösung (GADS) , indem die Inhaltsstoffe kombiniert , wie in Tabelle 1 angegeben.
  2. Führen Sie die RNA-Extraktion in einem speziellen Labor-Bereich. Vor Versuchsbeginn, saubere Oberflächen mit 70% Ethanol, 10% Bleiche und RNase Dekontamination Reagens. Dazu gehört auch die RNA-Zentrifuge, alle Rohrgestelle und Pipetten. Stellen Sie sicher, es gibt nur spezielle Filterspitze Boxen für die RNA-Einsatz. Verwenden Sie dieses Gerät und Bereich nicht für die DNA-Präparation, da dies die Proben kontaminieren.
  3. Mischen Sie frische 70% und 80% Ethanol mit RNase-freiem Wasser. Vorbereitung 1 ml pro Probe in die RNA-Extraktion verwendet werden.
Zutat Menge
Erweiterte DMEM / f12 9,5 ml
Glutamin 100 ul
HEPES (10 mM) 100 ul
N2 Ergänzung 100 ul
B27 (kein Vitamin A) 200 ul
NGF (50 ug / ml) 10 ul

Tabelle 1 Reagenzmischung für Ganglia Dissoziationslösung (gads).

3. Dissection Verfahren

  1. Füllen Sie 1,5-ml-Röhrchen mit 500 ul gads, eine für jede Versuchsprobe, eine für eine positive Sortierkontrolle und eine für eine negative Sortierkontrolle. Shop Röhrchen auf Eis im gesamten Dissektion.
  2. Präparieren Sie die Ganglion nodosum und zwei Teilschnitte machen Dissoziation zu erleichtern, ist es dann in der Versuchsprobenröhrchen setzen. Bitte beachten Sie die folgende JoVE Protokoll für die Präparation der nodose Ganglien 16 und DRG 17.
  3. Sezieren und teilweise nicht-markierten ganglia, wie die Spinalganglien (DRG) geschnitten, für die Sortiersteuerung. Verwenden Sie zwei Ganglien für die positive Kontrolle und zwei Ganglieine für die Negativkontrolle.
  4. Um genügend nodose Neuronen für eine erfolgreiche Sortierung zu erhalten, kombinieren Glien von 5 Mäusen in einem experimentellen Verfahren Probenröhrchen mit gads.

4. Sensorische Ganglia Dissociation

  1. Pipette aus 500 ul gads, Ganglien in der Röhre zu verlassen. Waschen Sie Ganglien einmal mit 1 ml PBS Zugabe warten Ganglien auf den Boden des Rohres zu regeln, dann Pipette aus PBS.
  2. 1 ml GADS und 22 & mgr; l Verdauungsenzym (Kollagenase I / II und Protease - Mischung, 2,5 mg / ml in H 2 O) in jedes Röhrchen.
  3. In 20 ul Fast Blue (5,26 mM) mit dem positiven Steuerrohr.
  4. Setzen Sie die Röhrchen in einem Wasserbad oder Heizblock bereits bei 37 ° C eingestellt.
    Anmerkung: Der Zeitpunkt des ganglia Verdauung von dem Alter des Aufschlusses Enzyms abhängt. Innerhalb von 1 Monat nach der Verdauung Enzym löst, verdauen für 30 Minuten innerhalb von 2 - 6 Monate für 45 min verdauen. Wenn das Enzym über 6 Monate alt ist, verdauen Ganglien foder 60 min.
  5. Alle 15 min schütteln Röhrchen kurz und schnippen sie Ganglien, um sicherzustellen, werden von der Lösung bedeckt.
  6. Während Ganglien verdaut werden, Dichtegradienten mit einer Partikellösung (kolloidalen Silicapartikel, beschichtet mit Polyvinylpyrrolidon) herzustellen.
    1. Mischen Sie 12% Partikellösung in Gads, 500 & mgr; l pro Probe.
    2. Mischen Sie 28% Partikellösung in Gads, 500 & mgr; l pro Probe.
    3. Langsam und vorsichtig für jede Probe 400 ul 12% Dichte Lösung oben auf 400 & mgr; l 28% Dichte Lösung in einem frischen 1,5-ml-Röhrchen hinzufügen. Sie nicht zulassen, dass die beiden Schichten zu vermischen. Zwei verschiedene Schichten sollte in dem Röhrchen sichtbar sein; ein dunkler als der andere.
  7. Während Ganglien verdaut werden, beschriften neue 1,5-ml-Sammelröhrchen für die Sortierung (ein Fast Blue positive und eine Fast Blue negativen Röhrchen pro Sortier Probe). Je nach den Anforderungen Sortieranlage müssen diese Rohre haben abnehmbaren Deckel, um nicht zu interferierene mit dem Zellsortierer.
  8. Nach der entsprechenden Verdauungszeit, entfernen gads mit Verdauungsenzym und waschen Ganglien zweimal mit 1 ml PBS. In 200 ml frisches gads in jedes Röhrchen.
  9. Verwenden Sie eine 200 ul-Pipette auf 100 & mgr; l Volumen und Pipette Ganglien nach oben und unten mehrmals Zellen auseinander zu brechen. Wiederholen, bis kein intaktes Stück Gewebe zu sehen ist. Vermeiden Blasen in der Lösung.
  10. Pass dissoziierten Zellen durch eine 70 um Zelle Sieb.
  11. Fügen Sie weitere 100 ul gads auf die ursprüngliche Dissoziation Röhre alle verbleibenden Streu Zellen links zu holen und die zusätzliche Lösung durch die Zelle Sieb passieren. Unter Verwendung einer neuen Pipettenspitze sammeln jegliches verbleibende zellhaltigen Flüssigkeit, die durch das Sieb passiert hat und auf das Netz geklammert. Das Endvolumen der in GADS suspendierten Zellen beträgt 300 & mgr; l.
  12. die 300 & mgr; l der Zellen auf der Oberseite der bisherigen Dichtegradienten sorgfältig Schicht. Vermeiden Blasen und Mischen von cells mit den Dichteschichten.
  13. Zentrifuge für 10 min bei 2900 xg bei RT.
  14. Während Zellen in der Zentrifuge sind, Lyse-Puffer (1 ml pro Versuchsprobe) mischen wie folgt: 10 & mgr; l 2-Mercaptoethanol in 1 ml Puffer RLT (von RNA-Extraktions-Kits).
    1. In 300 ul Lysepuffer Fast Blue positive Sammelröhrchen und 600 & mgr; l Fast Blue negativen Sammelröhrchen (Röhrchen aus Schritt markiert 4.7). Dieses Volumen hängt von der Anzahl der Zellen zu erwarten gesammelt werden. Für <2.000 Zellen, fügen Sie 300 ul für> 7.000 Zellen 600 ul hinzufügen. Dadurch wird die Sortier Hüllflüssigkeit gewährleisten nicht wesentlich den Lysepuffer verdünnt.
  15. Sobald Zentrifugation abgeschlossen ist, sorgfältig entfernen und die oberen 700 ul Schicht verwerfen. Diese Schicht enthält die Mehrheit der Zelltrümmer, die sonst mit Zellsortierung stören.
  16. In 700 ul frisch gads auf die verbleibende Zelle enthaltende Lösung und pipettierente nach oben und unten mehrmals zu mischen.
  17. Zentrifuge für 15 min bei 2900 xg Zellen zu pelletieren.
  18. Während Zellen in der Zentrifuge befinden, Mischungs GADs (500 ul pro Probe) das Sortieren durch Zugabe von 5 ul DNase (10 mg / ml) zu 1 ml GADS.
  19. Sobald Zentrifugation durchgeführt wird, sorgfältig entfernen und Überstand verwerfen, das Zellpellet zu verlassen.
  20. Re-suspend Zellpellet in 200 bis 300 & mgr; l Sortierung gads durch Pipettieren nach oben und unten mit einem 1000 ul Pipette auf 200 & mgr; l mehrmals. Legen Sie Proben auf Eis. Zellen sind nun bereit, sortiert werden.

5. Fluorescence Activated Cell (FAC) Sortierung

Hinweis: Dieser Abschnitt operative Kenntnisse in einer FACS-Sorter oder die Hilfe von Fachpersonal erfordert.

  1. 1 & mgr; l Propidiumjodid (PI) Stammlösung (50 ug / ml) zu jeder Probe für die Lebensfähigkeit der Zellen zu testen. Split negative Kontrolle in zwei Röhren, eines mit PI und eine ohne. PI bindet DNA nur in tote Zellen. Obnach den ersten paar Arten gibt es keine toten Zellen zu markieren, wird die Verwendung von PI nicht benötigt.
  2. Transport - Zellen - Zytometrie Instrument fließen, z. B., BD FACS AriaII Diva 8 - Software ausgeführt wird , auf dem Eis.
  3. Da die Größe der Zellen in dieser Population variabel ist, verwenden Sie eine große Düse (100 & mgr; m) zum Sortieren. Zur Verringerung der Menge an Stress Erfahrung, um die Zellen und erhöhen die Lebensfähigkeit der Zellen niedrigem Druck verwenden (20 psi).
  4. Verwenden Sie die FACS-Sorter Software die Analyse Plots, Vorwärtsstreuung, Seitenstreuung (SSC), Fast Blue einzurichten, und PI, wenn nötig.
  5. Um erneut zu suspendieren Zellen, Strudel sanft die Probe kurz bevor sie in den Sortierer geladen werden.
  6. Beginnen Sie mit der negativen Kontrolle, kein Fast Blue oder PI, der Gate - Schwelle (2A) zu setzen. Dadurch wird die Menge der Autofluoreszenz in der Zellpopulation zu bestimmen. Optional: Führen Sie die negative Probe mit PI zu erkennen, ob es eine Population von toten Zellen ist.
  7. Sortieren Sie die positive Kontrollprobe (incubated mit Fast Blue), Kompensationsparameter einzustellen.
  8. Sobald die Tore und die Parameter festgelegt sind, beginnen die experimentellen Proben zu sortieren. Proben werden in die vorbereiteten Sammelröhrchen, enthaltend RNA Lysepuffer sortiert.
  9. Halten Sie sortierten Proben auf Eis, bis die Zellsortierung abgeschlossen ist.
  10. Beginnen RNA-Extraktionsschritt unmittelbar nach Zellen sortiert werden.

6. RNA-Extraktion

  1. Vortex sortierten Zellen in Lysepuffer für 1 min zu homogenisieren.
  2. 1 Volumen 70% Ethanol und Mischung durch Auf- und Abpipettieren mehrmals.
  3. Übertragung von bis zu 700 & mgr; l der Probe auf einer Spin-Säule. Zentrifuge für 15 sec bei 8.000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.
    1. Wiederholen, bis das Gesamtvolumen der Probe durch die Spin-Säule geleitet wird.
  4. In 350 & mgr; l Puffer RW1 und weiterhin die RNA-Reinigungsverfahren, einschließlich der DNase Behandlungsschritt nach der Protoco des Herstellersl für Zellen.
  5. Sobald RNA extrahiert wurde, testen Sie die RNA-Qualität eines mikrofluidischen Elektrophorese-System gemäß den Spezifikationen des Herstellers.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unter Verwendung dieses Verfahrens Atemweg-innervating Neuronen werden durch intranasal Einträufeln Fast Blue (1A) gekennzeichnet. Nach zwei Tagen erscheinen Fast Blue markierten Zellen in der nodose ganglia (Abbildung 1C). Diese Zellen machen 3 - 5% der gesamten neuronalen Population der nodose Ganglien. Andere retrograden Farbstoffe, die für diesen Zweck verwendet wurden, umfassen DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanin Perchlorat)...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren Atemwegs-innervating Neuronen in der nodose Ganglien des Nervus vagus zu zielen. Einmal markiert, werden die Ganglien sanft distanzierte optimal Zellzahlen und die Lebensfähigkeit zu erhalten. Diese Neuronen sind dann FAC sortiert direkt in Lysepuffer und RNA extrahiert wird. Die Bedeutung dieses Protokolls ist die Fähigkeit, zu zielen, zu isolieren, und die Qualität einer bestimmten Sinneszellpopulation zu erhalten. Genexpression wird in diesem kleinen Population von Neuronen b...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unterstützt von NIH gewähren R01HL105635 zu SEJ. Die Autoren möchten sich Diego V. Bohórquez für technische Beratung danken. Wir danken auch R. Ian Cumming für die technische Unterstützung und die Durchflusszytometrie im Duke Humanimpfstoff Institut Forschung Durchflusszytometrie Shared Resource Facility-Durchführung (Durham, NC). Die Durchflusszytometrie wurde im Regional Biocontainment Laboratory an der Duke durchgeführt, die teilweise Unterstützung für den Bau von den National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (UC6-AI058607) erhalten.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Fast BluePolysciences, Inc.17740-2Bestand 2 mg/ml in Wasser
NeuroTrace 530/615 rot Nissle FärbungLife TechnologiesN21482
Dimethylsulfoxid (DMSO)Fisher ScientificD128-500
Dulbecco's Phosphat Buffered Saline (PBS) Ca und Mg freiGibco14190-144
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
Glutamin ( Glutamax)Gibco35050-061
HEPESGibco15630-080
N2Gibco17502-048
B27 (kein Vitamin A)Gibco12587-010
Nervenwachstumsfaktor (NGF)SigmaN6009Lager 50 &Mikro; g/ml in PBS/10% FBS-Aufschlussenzym
, Liberase DH Roche5401054001Forschungsqualität 2,5 mg/ml in
Wasserpartikellösung (Percoll)SigmaP1644-25ML
HeizblockLabNet
70 & micro; m cell SiebFalcon352350
Absolute Ethanol (200 proof)Fisher ScientificBP2818-500
RNase freies WasserFisher ScientificBP2484-100
RNase Dekontaminationsreagenz, RNase AWAYinvitrogen10328-011
2-MercaptoethanolVWREM-6010
RNA Extraktionskit, RNeasy Plus Micro KitQiagen74034
DNase Kit, RNase-freies DNase SetQiagen79254
DNaseSigmaD5025-15KUschaft 10 mg/ml in 0,15 M NaCl
Propidium IodidSigmaP4170-10MGschaft 10 & micro; g/ml im PBS
Mikrofluidischen Elektrophoresesystem (TapeStation 2200)Agilent

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
  2. Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21(2013).
  3. Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
  4. Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
  5. Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
  6. Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
  7. Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
  8. Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
  9. Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
  10. Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
  11. Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
  12. Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).
  13. Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
  14. Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
  15. Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
  16. Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
  17. Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782(2013).
  18. Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
  19. Kwong, K., Lee, L. -Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
  20. Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
  21. Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
  22. Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
  23. Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
  24. Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Luftweginnervierende NeuronenIsolation der Nodose GanglienFast Blue Tracingfluoreszenzaktivierte ZellsortierungGangliendissolutionDichtegradientenzentrifugationRNA Extraktionsprotokollmikrofluidische Elektrophoresevagale afferente Neuronenperiphere Neurobiologie

Verwandte Artikel