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Die Differenzierung der Atrial Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen Mit dem BMP-Antagonisten Grem2

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DOI:

10.3791/53919

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10. März 2016

 , 
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Vanderbilt University, 3Department of Cell & Developmental Biology, Vanderbilt University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Erzeugung von Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen in vitro ermöglicht den Zugang zu großen Mengen an Herzgewebe in vitro für die Grundlagenforschung und klinische Anwendungen. Dieses Protokoll verwendet den atrialisierenden Faktor Grem2, um sowohl die Anzahl der erhaltenen Kardiomyozyten zu erhöhen als auch Kardiomyozyten mit einem atrialen Phänotyp zu erzeugen.

Zusammenfassung

Protokolle für die Populationen von Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen zu erzeugen, wurden entwickelt, aber diese in der Regel Zellen aus gemischten Phänotypen ergeben. Die Forscher interessiert Studien führen spezifische myocyte Subtypen Beteiligung erfordern eine gerichtete Differenzierung Ansatz. Durch die Behandlung kann Maus embryonale Stammzellen (ES - Zellen) mit Grem2, sezerniertes BMP - Antagonist, für die atriale Kammerbildung in vivo erforderlich ist, eine große Anzahl von Herzzellen mit einem atrial - Phänotyp erzeugt werden. Verwendung des konstruierten Myh6-DsRed-Nuc pluripotenten Stammzelllinie ermöglicht die Identifizierung, Selektion und Reinigung von Kardiomyozyten. In diesem Protokoll werden Embryoidkörpern von Myh6-DsRed-Nuc Zellen erzeugt, um die hängenden Tropfen Verfahren und in der Schwebe gehalten, bis die Differenzierung Tag 4 (d4) verwendet wird. Bei d4 Zellen werden mit Grem2 behandelt und plattiert auf Gelatine-beschichteten Platten. Zwischen d8-d10 großen öffentlichen Flächen in den Kulturen beobachtet werden und weiter expandieren und mAture durch d14. Molekular-, histologische und electrophysiogical Analysen zeigen Zellen in Grem2 behandelten Zellen atrial artigen Eigenschaften eine in - vitro - Modell die Bereitstellung zur Untersuchung der Biologie des atrialen Kardiomyozyten und ihre Reaktion auf verschiedene pharmakologische Mittel zu erwerben.

Einleitung

Pluripotente Stammzellen sind ein leistungsfähiges Werkzeug zum Erzeugen und Zellen aus einer Vielzahl von schwer zugänglichen Geweben für Grundlagenforschung und präklinische Studien, insbesondere beim Menschen 1-5 studieren. Die richtige Modulation der Entwicklungs-Signalwege können die Differenzierung pluripotenter Stammzellen auf die gewünschte phänotypische Schicksal lenken. Viele Protokolle wurden entwickelt , Kardiomyozyten (CMs) aus pluripotenten Stammzellen 6-14 zu erzeugen. Diese Protokolle umfassen im allgemeinen Modulation TFGβ -Superfamilie (Activin, BMP und TGF & bgr;) und Wnt Wege durch timed Zugabe von exogenen Wachstumsfaktoren und / oder kleine Moleküle 10,12-15. Diese Protokolle sind im allgemeinen wirksam bei der der Prozentsatz der Zellen zu erhöhen, die CMs werden, aber es fehlt die Spezifität, eine gemischte Population von Zellen zu erzeugen darstellt atrialen, ventrikulären und Knoten / Leitungssystem Abstammungen. Um bestimmte Herz zu studieren Subtypen eine gerichtete Differenzierung approACH ist nicht erforderlich.

Gremlin2 (Grem2, die auch als Protein mit Bezug zu Dan und Cerberus oder PRDC kurz) ist ein sezerniertes BMP - Antagonist, der für die richtige Herzdifferenzierung und Vorhofkammer Bildung während der Herzentwicklung in Zebrabärbling 16 notwendig ist. Die Behandlung von Differenzierung embryonaler Stammzellen mit Grem2 an Differenzierung Tag 4, kurz nach Spitzen Expression von mesodermalen Marker T-Brachyurie und Cerberus wie 1, erhöht die Ausbeute an CMs und erzeugt einen Pool von Zellen überwiegend aus der Vorhof Linie 14.

Rekombinante Grem2 wird verwendet , um die differenzierenden Zellen zu behandeln und kann 17 unter Verwendung von Standard - Protein - Produktionstechniken hergestellt werden oder können im Handel erworben werden. Es ist in wässrigen Lösungen sehr gut löslich und können exogen zu Kulturen mit der gewünschten Zeitpunkt zugesetzt werden.

Die Differenzierung kann mittels RT-qPCR quantifiziert werden verfolgt Expression von Markern repräsentativvon Herz-Kreislauf-Vorläufern, Herz-Vorläufern und engagierte CMs. Immunofluoreszenz können auch zur Identifizierung und Visualisierung der räumlichen Verteilung der kardialen Zelltypen verwendet werden.

Anwendungen, die reine Populationen erfordern, werden leichter durchgeführt, wenn ein Reportersystem mit CMs zu identifizieren und zu isolieren. Zu diesem Zweck haben wir die & alpha; MHC-DsRedNuc Konstrukts in die Maus CGR8 ES - Zelllinie 14 eingeführt. CGR8 Zellen wachsen und bleiben pluripotent ohne Feeder - Zellen, Expansion und Differenzierung Assays zu erleichtern 18. Die ES - Zelllinie enthält eine DsRed - fluoreszierende Protein codierende Sequenz mit einem Kernlokalisierungssignal unter der herzspezifischen alpha - Myosin schwere Kette (& agr; MHC- oder Myh6) Genpromotor. Unter Verwendung dieser Zellen kann CMs leicht zur Quantifizierung identifiziert und isoliert werden, Zellsortierung, Elektrophysiologie, Drogen-Bildschirme, und Mechanismen der atrial Differenzierung zu studieren.

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Protokoll

1. Herstellung von Zellkulturmedien, Lösungen und Reagenzien.

  1. Bereiten 500 ml Maus-embryonalen Stammzellen (MESC) Medien durch Vermischen und sterile Filterung (0,2 um Porengrße) 445 ml Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM), 50 ml hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS), 5 ml 100X konzentrierte L- Glutamin Ersatz, 5 & mgr; l rekombinantem Maus Leukemia Inhibitory Factor (LIF) bei 1 x 10 7 Einheiten pro ml, und 1,43 ul ß-Mercaptoethanol (Endkonzentration 50 uM). Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung.
  2. Bereiten 500 ml Embryoidkörper (EB) Differenzierungsmedien durch Mischen und sterile Filterung 391 ml Iscove modifiziertem Dulbecco Medium (IMDM), 100 ml hitzeinaktiviertem FBS, 5 ml 100X konzentrierte L-Glutamine Ersatz, 5 ml 100X konzentrierte Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA) und 2,86 ul ß-Mercaptoethanol (Endkonzentration 100 uM). Lagern bei einer 4˚ C bis zur Verwendung.
  3. Bereiten Sie 0,2% w/ v Lösung von Gelatine mit 500 ml filtriert, destilliertem H 2 O 1 g Schweinehautgelatine Pulvermisch Durch Autoklavieren sterilisieren. Beachten Sie, dass die Gelatine nicht vollständig löslich bei RT in Wasser sein kann. Nachdem die Gelatine Autoklavenbehandlung vollständig aufgelöst werden sollte. Lagern Sie bei RT bis zur Verwendung.
  4. Bereiten Grem2 rekombinantes Protein-Aliquots von 50 ug Pellet lyophilisierter Grem2 in 100 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung aufgelöst (PBS), supplementiert mit 0,1% BSA ein 0,5 & mgr; g / & mgr; l Stammlösung herzustellen. Aliquot 20 ul dieser Stammlösung in fünf sterile 1,5 ml Zentrifugenröhrchen und lagern bei -80˚ C bis zur Verwendung.
  5. Bereiten Sie PBS gemäß veröffentlichten Protokollen oder Kauf als 10fach und verdünnen 1:10 mit filtriert destilliertem H 2 O , um eine 1X machen Verdünnung arbeiten 19. Sterilisieren PBS vor der Verwendung im Autoklaven. Lagern Sie bei RT bis zur Verwendung. In einigen Schritten, DPBS ohne Ca 2+ und Mg 2+ verwendet wird. Dies ist purchased als 1X-Lösung. Bestellinformationen sind in der Tabelle der Reagenzien enthalten.

2. Herstellung von Gelatine beschichtete 10 cm Gewebekulturschalen

  1. In einem sterilisierten Gewebekulturhaube 5 ml 0,2% ige Gelatinelösung zu jeder 10 cm-Gewebekulturschale für die Beschichtung. Platz Gerichte im Inkubator bei 37 ° C für mindestens 30 Minuten oder bis zu 4 Tage.

3. Herstellung von Gelatine beschichtete 6-Well-Gewebekulturplatten

  1. In einem sterilisierten Gewebekulturhaube 1 ml 0,2% Gelatine in den jede Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturplatte. Platz Platten im Inkubator bei 37 ° C für mindestens 30 Minuten oder bis zu 4 Tage.

4. Embryonic Stem Cell Culture

  1. Thawing mESCs
    1. Bereiten Sie MESC Medien in einem sterilisierten Gewebekultur Haube Erwärmung auf RT. 10 ml RT Medien zu einer Gelatine beschichtete 10 cm Teller.
    2. Entfernen 1 Fläschchen mESCs , die etwa 1 x 10 6 Zellen ausKryolagerung. Halten Cryovial mit einer Zange, in einem Wasserbad 37 ° C. Vorsichtig schwenken, bis Zellsuspension und nur ein kleiner Eiskristall bleibt in der Mitte der Ampulle aufgetaut ist. Trocknen Sie Fläschchen mit einem Einweg-fusselfreien wischen und zu sterilisieren mit 70% EtOH.
    3. In einem sterilen Gewebekultur Haube aufgetauten Zellen entfernen Cryovial eine P1000 Spitze mit und Transfer zu 10 cm Schale in 4.1.1) hergestellt.
    4. Platz 10 cm Schale in 37 ˚C befeuchteten Zellkultur - Inkubator mit 5% CO 2 und gleichmäßig Zellen verteilen , indem Sie vorsichtig auf die Platte vorne bewegen nach hinten, dann von Seite zu Seite. Allow Zellen zu befestigen O / N oder zumindest 6 h zu plattieren.
    5. Das erste, was die nächsten Morgen Check-Zellen für die Befestigung eines Hellfeldmikroskop. Einige Zelltrümmer und tote Zellen werden in den Medien zu beachten. Das ist normal. Absaugen Medien von Speisen und ersetzen mit 10 ml frisch MESC Medien.
    6. Weiter täglich Medien auf Zellen zu verändern Differenzierung zu verhindern.
  2. Passagierung mESCs
    1. Passage-Zellen, wenn 60-70% konfluent. Vorbereitung der Zellen für Passagierung durch Medien und Spülen mit 5 ml sterilem 1X DPBS ohne MgCl 2 und CaCl 2 abgesaugt. 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung. Der Platz im Inkubator bei 37 ° C für 5 min.
    2. Während Zellen werden inkubiert, neue 10 cm-Schale herzustellen, indem man Gelatinelösung abgesaugt und mit 10 ml RT MESC Medien hinzufügen. Nach 5 Minuten überprüfen Sie die Zellen für die Ablösung. Wenn Zellen haften bleiben, weiterhin bei 37 ° C für 2 Minuten zu einem Zeitpunkt, zu brüten, bis sie vollständig abgelöst.
    3. Quench Trypsin-EDTA durch Zugabe von 3 ml MESC Medien. Übertragen Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen und Spinn bei 200 xg für 5 Minuten zu pelletieren. Absaugen Medien von Pellets und resuspendieren in 10 ml MESC Medien.
    4. Je nach Split-Verhältnis gewünscht, fügen 0,5-1,0 ml Zellsuspension in jede Schale, hergestellt in Schritt 4.2.2). Legen Gericht in Inkubator und gleichmäßig verteilen Zellen durch leichtes Bewegen von hinten nach vorne dann von Seite zu Seite. Alleow Zellen O / N oder für mindestens 12 h zu befestigen.
      HINWEIS: Ein Split-Verhältnis von 1.10 Uhr bis 01.20 Uhr ist üblich für die meisten MESC Linien. Dieses Verhältnis kann in Abhängigkeit von der Leitung verwendet, passage Nummer und gewünschte Konfluenz auf der neuen Schale variieren. Für 1:10 Splitverhältnis 1 ml der Zellsuspension in 9 ml MESC Medien und Platte in einer frisch mit Gelatine beschichtete 10 cm Gericht zubereitet.

5. Herstellung von Embryoidkörpern

HINWEIS: Alle Schritte außer Zentrifugation in einem sterilen Gewebekulturhaube durchgeführt.

  1. Herstellung von Zellsuspension in EB Medien
    1. Bei 70% Konfluenz (in der Regel 24 bis 48 Stunden nach der Durchgang), die Zellen für EB Bildung verwenden. Vorbereitung der Zellen für EB Bildung durch Ablösen und Pelletierung nach den Abschnitten 4.2.1) - 4.2.3).
      Anmerkung: (. ZB sehr wenig Zelltod, keine Verschmutzung, richtige Morphologie) Es ist am besten zu Passage Zellen mindestens ein Mal nach dem Auftauen und prüfen Sie für die Gesundheit und ein robustes Wachstum (e.g., Populationsverdopplungen alle 24-48 h) vor auftretenden zur Herstellung von EBs zu verwenden.
    2. Re-suspend Pellet in 5 ml EB Medien. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer oder automatisierten Zellzähler.
    3. Verdünnte Zellsuspension in erforderliche Volumen von EB Medien eine Endkonzentration von 25 Zellen / & mgr; l (oder 2,5 x 10 3 Zellen / ml) herzustellen. Man beachte, dass jeder Deckel einer Petrischale hält etwa 60 EBs und erfordert etwa 1,3 ml der Zellsuspension. In diesem Schritt wird ein ausreichendes Volumen der Zellsuspension herzustellen, die gewünschte Anzahl von EBs zu erzeugen. Wenn beispielsweise 240 EBs für Experiment erforderlich sind, vorzubereiten 5,2 ml bei 2,5 x 10 3 Zellen / ml.
      HINWEIS: mESCs, die nicht für EB Bildung verwendet werden, können durch Drehen nach unten, Resuspendieren in MESC Medien für zukünftige Experimente verwendet werden, und Beschichtung wie in Abschnitt 4.2 beschrieben.
  2. Erstellung von Embryoidkörpern
    1. Bereiten sterile 10 cm bakterielle Petrischalen Tropfenbildung zum Aufhängen durch Zugabe von 2 ml 1X PBS auf den Boden des eACH.
    2. Übertragen EB Suspension aus Schritt 5.1) zu einer sterilen Lösung Becken.
    3. Entfernen Deckel aus vorbereiteten Petrischale und vorsichtig sechzig, 20 ul Tropfen EB Suspension auf der inneren Oberfläche abscheiden. Erledigen Sie dies effizient einen Mehrkanal-Pipette, ausgestattet mit 6 Tipps. Jede 20 ul Tropfen hat jetzt 500 Zellen.
    4. Vorsichtig Deckel auf die untere Hälfte der bakteriellen Petrischale ersetzen, man aufpassen, nicht Tropfen hängen zu entfernen. Platzieren Sie Gerichte in Zellkultur-Inkubator bei 37˚ C. Nach 2 Tagen werden die Zellen bereit zu waschen, wie in 5.3 beschrieben).
  3. Wash-down von Embryoidkörpern
    Hinweis: Alle Wash-Down Schritte werden in einer sterilen Gewebekulturhaube durchgeführt.
    1. Nach 2 Tagen EB sind zum Waschen bereit nach unten und Transfer zu 6 cm bakteriellen Petrischalen. Vorwärmen 3 ml EB Medien pro Petrischale auf RT. Jede 6 cm bakterielle Petrischale kann 2 Deckel effektiv halten wert Tropfen hängen.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass eine nicht-beschichteten Petrischale f zu verwenden,oder dieser Schritt (siehe Materialien Tabelle). Verwenden Sie keine Gewebekulturschale oder einer anderen Oberfläche verwenden, die Zelladhäsion fördert. EBs sollten in Medien, bis sie bereit suspendiert bleiben plattiert werden, wie in Abschnitt 6 beschrieben.
    2. Entfernen Sie 10 cm Petrischalen aus Inkubator aufnehmen und in sterile Gewebekultur Kapuze. Sorgfältig Deckel mit EBs entfernen und in einem 45-Grad-Winkel kippen.
    3. Mit einem 5 ml serologische Pipette mit 3 ml RT EB Medien, vorsichtig waschen EBs in einen Pool an der Unterseite des Deckels. inspizieren Sie vorsichtig den Deckel für EBs, die an die Oberfläche geklebt werden und wieder spülen, falls nötig.
    4. Nachdem alle EBs Übertragung auf eine 6 cm Petrischale zu waschen.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 5.3.2) -5.3.4) für alle EVGs. Jede 6 cm Petrischale sollte EBs enthalten zwei 10 cm Deckel. Legen Sie alle Gerichte wieder in Inkubator bei 37 ° C für zwei weitere Tage.
      HINWEIS: EBs, die zu nahe beieinander sind, in Suspension kann zusammenhalten und große Aggregate bilden. Dies kann sich negativ auf Herz Differenzierung Effizienz auswirkensowie deutlich die Zahl der zur Verfügung stehenden EBs reduzieren. Um zu verhindern, Aggregation, sollte EBs jeden Tag und durch sanft hin und her bewegt getrennt geprüft werden, dann einer Seite zur anderen. Die Verwendung von Bakterien Gerichte in den frühen Differenzierungsschritte notwendig EB Befestigung an der Schale zu verhindern und ermöglichen EBs in Suspension zu wachsen.

6. Auflage und Behandlung von EBs Mit Grem2

  1. Bereiten Sie Grem2 Behandlungsmedium durch ausreichendes Volumen an Lager Zugabe (0,5 ug / ul) Grem2 auf RT EB Medium für eine endgültige Verdünnung von 1 bis 5 & mgr; g / ml.
    HINWEIS: Die wirksame Konzentration für die Behandlung von EBs variiert in Abhängigkeit von der Zelllinie und die spezifische Aktivität des aktuellen Menge Grem2. Es wird empfohlen, vor der Dosis zu verwenden, wird eine maximale Wirksamkeit zu finden titriert. Für die CGR8 MESC Linie routinemäßig verwenden wir 3-5 ug / ml Grem2. Wirksame Konzentrationen von Grem2 für Vorhof Myocytenbildung produzieren schnell Vertrags Zellen zwischenTage 7-8, die während jeder Vertiefung weit verbreitet sind. Wenn Auftraggeber Phänotyp in behandelten Kulturen nicht beobachtet wird, wird empfohlen, dass die Grem2 im Bereich titriert werden Dosis angegeben.
  2. Bereiten 6-Well-Gewebekulturplatten, die durch Gelatine-Beschichtungslösung Absaugen aus jeder Vertiefung und Zugabe von 2 ml RT Grem2 Behandlungsmedien. Entfernen EBs aus Inkubator aufnehmen und in sterile Gewebekultur Kapuze.
  3. Mit Hilfe eines P1000 auf 100 & mgr; l Transfer 30 EBs von 6 cm Petrischalen in jede Vertiefung. Platz EBs in Inkubator und gleichmäßig verteilen, indem Sie vorsichtig Platte nach vorne zu bewegen zurück dann von Seite zu Seite.
    1. Nach EBs zu Gelatine beschichteten Vertiefungen angebracht sind, ersetzen Grem2 Medien 10 alle zwei Tage bis zum Tag 10. Nach dem Tag, beenden alle zwei Tage die Grem2 Behandlung und fügen Sie frische EB Medien gesunde Zellen zu erhalten.
      HINWEIS: Nach dem Anbringen EBs wird entlang der Oberfläche der beschichteten Platte abflachen.

7. Zelldissoziationsmedium für RT-qPCR Analysis

  1. Zelldissoziation mit Trypsin-EDTA
    1. Absaugen Medien aus jeder Vertiefung und spülen Sie zweimal mit 1 ml pro Vertiefung von sterilen DPBS minus Ca 2+ und Mg 2+.
    2. 0,5 ml 0,25% sterile Trypsin-EDTA-Lösung in jede Vertiefung, aus denen Zellen gesammelt werden.
    3. Legen Sie die Platte im Inkubator bei 37 ° C für 5 min.
    4. Nach 5 min Kontrollzellen für die Dissoziation. Wenn noch Zellen zu Boden des Bohrlochs Hahn verbunden bleiben sanft zu lösen. Wenn Klopfen Zellen nicht lösen, legen Sie wieder in Inkubator und überwachen alle 2 Minuten, bis die Zellen vollständig abgelöst werden.
    5. Neutralisieren Trypsin-EDTA-Lösung durch Zugabe von 0,5 ml EB Medien in jede Kammer.
    6. Übertragen gesamten 1 ml der Zellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    7. Pellet Zellen in einer Tischzentrifuge 5 min bei 300 x g zu drehen.
    8. Absaugen Medien von Pellets und sich nach der Lyse sofort oder zu speichern Pellet bei -70 ° C bis zur Lyse bereit. Lang term Lagerung von Pellets wird nicht empfohlen, da dies zu einer Verschlechterung der RNA führen kann.
  2. Zellyse und Molekulare Analyse
    1. An diesem Punkt werden die Zellen für die RNA-Isolierung bereit, eine kommerzielle Säule-Extraktions-Kits oder unter Verwendung von RNA-Extraktion Reagenz nach den Protokollen, die von den Herstellern geliefert (siehe Tabelle der Materialien). Nach der Isolierung, reverse transkribierten RNA und verwenden cDNA für RT-qPCR - Analyse unter Verwendung von Standardtechniken 20, 21.
      HINWEIS: Die Primer dieses Labor für RT-qPCR sind in Tabelle 1 aufgeführt Atrial Identität bestätigt wird eine Kombination von RT-qPCR unter Verwendung von Expression von atriale und ventrikuläre Gene und Elektro zum Handeln Rekordpotentialdauer zu betrachten (siehe Abschnitt 8). Eine Auswahl von Genen wird in diesem Protokoll als ein Beispiel für zuverlässige atriale und ventrikuläre Marker enthalten. Weitere Informationen über atriale und ventrikuläre Genexpression in Zusammenhang mit der pluripotenten Stammzelldifferenzierung in Referenz 14 gefunden.

8. Elektrophysiologische Analyse

  1. Zelldissoziationsmedium mit Kollagenase
    1. Absaugen Medien aus jeder Vertiefung und zweimal mit 1 ml pro Vertiefung von sterilem PBS spülen.
    2. 0,5 ml von 1 mg / ml Kollagenase-Lösung zu jeder Vertiefung.
    3. Legen Sie die Platte im Inkubator bei 37 ° C für 10 min.
    4. Nach 5 min Kontrollzellen für die Dissoziation. Wenn weiterhin Zellen aneinander oder dem Boden des Bohrlochs tap befestigt bleiben sanft zu lösen. distanziere ferner die Zellen durch vorsichtiges Zerreiben mit einem P1000.
      HINWEIS: Patch-Clamp-Aufnahmen Zellen zu erleichtern, sollte bis eine Suspension Einzelzelle verrieben werden erreicht.
    5. 0,5 ml EB Medien in jede Vertiefung und mischen durch Pipettieren.
    6. Übertragen gesamten 1 ml der Zellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    7. Pellet Zellen in einer Tischzentrifuge 5 min bei 300 x g zu drehen.
    8. Aspirat Medien von Zellpellets.
    9. Re-suspend-Zellen in 500& mgr; l PBS mit 10% FBS, sicher zu sein, in eine Einzelzellsuspension zu verreiben.
  2. Elektrophysiologische Charakterisierung.
    HINWEIS: Viele ausgezeichnete Protokolle wurden in dieser Zeitschrift zur Verwendung von Einzelzell Patch-Clamp zu messen Zellmembran Potentiale veröffentlicht. Ausführliche Informationen darüber , wie ausführen einzelne Zelle Patch den Neuling Leser klemmen wird 21-24 auf diese Protokolle bezeichnet. Im Folgenden werden spezifische Informationen für dieses Protokoll, das der erfahrene electrophysiologist herzustellen und zu hand MESC CMs wird dazu beitragen, abgeleitet Charakterisierung für den Subtyp.
    1. Bereiten intrazelluläre Aufnahme Lösung, bestehend aus den folgenden: 10 mM HEPES-Puffer, 5 mM MgATP, 2 mM EGTA, 110 mM Kaliumglutamat, 10 mM KCl, und 10 mM NaCl. Einzustellen Lösung auf einen pH von 7,2 unter Verwendung von NaOH.
    2. Bereiten Sie extrazelluläre Aufnahme (Bad) Lösung , bestehend aus den folgenden: 2 mM HEPES, 10 mM Glucose, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5,4 mM KCl und 137mM NaCl. Einzustellen Lösung auf einen pH von 7,4 unter Verwendung von NaOH.
    3. Bereiten Sie eine Glaspipette, die 2-5 MOhm Widerstand misst, wenn sie mit Recording-Lösung unter Verwendung von Standard-Borosilikatglas mit Filament verfüllt.
    4. Transfer 100 ul der suspendierten Zellen in Aufnahmekammer enthält, extrazelluläre Aufzeichnungslösung eine P200 verwenden.
      HINWEIS: Die Zellen in Suspension geroutet werden kann oder die Handhabung zu erleichtern und Verwendung zur medikamentösen Behandlung und / oder Perfusion Assays kann auf einen mit Gelatine beschichteten Deckgläschen ausgesät werden, wie in 8.2.5 beschrieben).
    5. Bereiten Sie Gelatine beschichtete Glasplättchen durch einen Durchmesser von 10 mm Deckglas in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte platziert und Abdecken mit Gelatinelösung wie in Abschnitt 3.1) dieses Protokoll beschrieben.
      1. Nach mindestens 30 absaugen Gelatinelösung min und 100 l suspendierten Zellen direkt gesamte 6-Well-Platte in Inkubator Deckglas und Platz für mindestens 2 Stunden oder bis die Zellen gebunden haben. Nachdem die Zellen angeschlossen haben, remove Deckglas und in mit extrazellulären Aufzeichnungslösung Aufnahmekammer.
        HINWEIS: Um die & alpha; MHC-DsRed fluoreszierende Herz Reporter MESC Linie Bei der Verwendung kann CMs durch ihre rot fluoreszierende Kerne identifiziert werden. Wenn kein Herz Reporter Linie verwenden, spontan kontrahier Zellen können für Messungen beobachtet und isoliert werden. Pluripotente Stammzellen abgeleitet CMs sind in der Regel kleiner und abgerundet, die charakteristische rechteckige Morphologie von voll ausgebildeten erwachsenen Kardiomyozyten fehlt.
    6. Nehmen Sie alle Aufnahmen bei 37 ° C. Patch-Einzelzellen unter Verwendung von Ganzzellklemme in Current-Clamp-Modus mit einem Borosilicatglas pipettieren von 2-5 MOhm Widerstand. Verwenden Sie sanfte Unterdruck Gigaohm Dichtung vor der Gewinnung ganze Zelle Zugang zu erreichen. Tragen Sie eine schnelle Unterdruckmembran zu zerreißen und Sie erhalten Zugang ganze Zelle vor der Membranpotentiale der Aufnahme.
    7. Evoke Aktionspotentiale unter Verwendung von 4 ms depolarisierenden Strominjektionen.
      HINWEIS:Für PSC-derived CMs erforderliche Strommenge reproduzierbar zu Aktionspotentialen auslösen kann variieren. Um eine optimale Schwellenstrom zu finden, bei einem relativ niedrigen Strom und Zunahmestartauslösestromamplitude in einer schrittweisen Art und Weise, bis reproduzierbare Aktionspotentiale erhalten werden.
      HINWEIS: Aktionspotentialdauer für Grem2-induzierte Vorhofmyozyten sind in der Regel im Bereich von 20 bis 40 ms und es fehlt ihnen eine Plateauphase (6B).

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Ergebnisse

Vor der Differenzierung sollte pluripotenten Stammzellen kompakt und frei von spontaner Differenzierung sein. Die Zellen , die in 1A gezeigt sind bereit für hängende Tropfen vereinzelnden und verwendet werden , wie in 5.1 des Protokolls beschrieben. Die Zellen in 1B gezeigt werden spontan differenzieren und sind nicht zur Herstellung von hängenden Tropfen verwendet werden.

Die Platten, die in ...

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Diskussion

Dieses Protokoll erzeugt routinemßig Kulturen mit einem hohen Prozentsatz der CMs, die charakteristisch für die atriale lineage sind. Wie bei jeder Differenzierung Protokoll sollte die Qualität der mESCs vor der Differenzierung besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden. mESCs sollten routinemäßig für die richtige Morphologie (Abbildung 1A) überwacht werden. Jede spontane Differenzierung , die vor der Bildung von EBs auftritt , wird stark die Effizienz der Kardiogenese begrenzen und sollte vor der Passag...

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Offenlegungen

Die Autoren dieses Manuskripts haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

": Training in Untersuchungsprogramm in Herz-Kreislauf-Mechanismen" (JB) Diese Arbeit wurde durch NIH Zuschüsse HL083958 und HL100398 (AKH) und 2T32HL007411-33 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
GMEMLife Technologies11710
FBSLife Technologies10082
GlutamaxLife Technologies35050
LIFEMD MilliporeESG1107
ß-MercaptoethanolSigmaM3148
IMDMSigmaI3390
Nicht-essentielle AminosäurenSigmaM7145
10 cm GewebekulturplattenSarstedt83.3902
10 cm Bakterielle PetrischalenVWR25384-342
6 cm Bakterielle PetrischalenVWR25384-092
6-Well-GewebekulturplattenSarstedt83.3920
Gremlin 2 rekombinantes ProteinR& Ampere; D Systems2069-PR-050
SterilfiltereinheitenThermo Fisher09-741-02
Gelatine (aus Schweinehaut)SigmaG1890
10X PBS, SterilSigmaP5493
BSA Sigma5470
0,05 % Trypsin-EDTA-LösungLife Technologies25300054
DPBS, kein Calcium, kein MagnesiumLife Technologies14200

Referenzen

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