Methodenartikel
Die Erzeugung von Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen in vitro ermöglicht den Zugang zu großen Mengen an Herzgewebe in vitro für die Grundlagenforschung und klinische Anwendungen. Dieses Protokoll verwendet den atrialisierenden Faktor Grem2, um sowohl die Anzahl der erhaltenen Kardiomyozyten zu erhöhen als auch Kardiomyozyten mit einem atrialen Phänotyp zu erzeugen.
Protokolle für die Populationen von Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen zu erzeugen, wurden entwickelt, aber diese in der Regel Zellen aus gemischten Phänotypen ergeben. Die Forscher interessiert Studien führen spezifische myocyte Subtypen Beteiligung erfordern eine gerichtete Differenzierung Ansatz. Durch die Behandlung kann Maus embryonale Stammzellen (ES - Zellen) mit Grem2, sezerniertes BMP - Antagonist, für die atriale Kammerbildung in vivo erforderlich ist, eine große Anzahl von Herzzellen mit einem atrial - Phänotyp erzeugt werden. Verwendung des konstruierten Myh6-DsRed-Nuc pluripotenten Stammzelllinie ermöglicht die Identifizierung, Selektion und Reinigung von Kardiomyozyten. In diesem Protokoll werden Embryoidkörpern von Myh6-DsRed-Nuc Zellen erzeugt, um die hängenden Tropfen Verfahren und in der Schwebe gehalten, bis die Differenzierung Tag 4 (d4) verwendet wird. Bei d4 Zellen werden mit Grem2 behandelt und plattiert auf Gelatine-beschichteten Platten. Zwischen d8-d10 großen öffentlichen Flächen in den Kulturen beobachtet werden und weiter expandieren und mAture durch d14. Molekular-, histologische und electrophysiogical Analysen zeigen Zellen in Grem2 behandelten Zellen atrial artigen Eigenschaften eine in - vitro - Modell die Bereitstellung zur Untersuchung der Biologie des atrialen Kardiomyozyten und ihre Reaktion auf verschiedene pharmakologische Mittel zu erwerben.
Pluripotente Stammzellen sind ein leistungsfähiges Werkzeug zum Erzeugen und Zellen aus einer Vielzahl von schwer zugänglichen Geweben für Grundlagenforschung und präklinische Studien, insbesondere beim Menschen 1-5 studieren. Die richtige Modulation der Entwicklungs-Signalwege können die Differenzierung pluripotenter Stammzellen auf die gewünschte phänotypische Schicksal lenken. Viele Protokolle wurden entwickelt , Kardiomyozyten (CMs) aus pluripotenten Stammzellen 6-14 zu erzeugen. Diese Protokolle umfassen im allgemeinen Modulation TFGβ -Superfamilie (Activin, BMP und TGF & bgr;) und Wnt Wege durch timed Zugabe von exogenen Wachstumsfaktoren ....
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1. Herstellung von Zellkulturmedien, Lösungen und Reagenzien.
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Vor der Differenzierung sollte pluripotenten Stammzellen kompakt und frei von spontaner Differenzierung sein. Die Zellen , die in 1A gezeigt sind bereit für hängende Tropfen vereinzelnden und verwendet werden , wie in 5.1 des Protokolls beschrieben. Die Zellen in 1B gezeigt werden spontan differenzieren und sind nicht zur Herstellung von hängenden Tropfen verwendet werden.
Die Platten, die in .......
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Dieses Protokoll erzeugt routinemßig Kulturen mit einem hohen Prozentsatz der CMs, die charakteristisch für die atriale lineage sind. Wie bei jeder Differenzierung Protokoll sollte die Qualität der mESCs vor der Differenzierung besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden. mESCs sollten routinemäßig für die richtige Morphologie (Abbildung 1A) überwacht werden. Jede spontane Differenzierung , die vor der Bildung von EBs auftritt , wird stark die Effizienz der Kardiogenese begrenzen und sollte vor der Passag.......
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Die Autoren dieses Manuskripts haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
": Training in Untersuchungsprogramm in Herz-Kreislauf-Mechanismen" (JB) Diese Arbeit wurde durch NIH Zuschüsse HL083958 und HL100398 (AKH) und 2T32HL007411-33 unterstützt.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Nicht-essentielle Aminosäuren | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Gewebekulturplatten | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bakterielle Petrischalen | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bakterielle Petrischalen | VWR | 25384-092 | |
| 6-Well-Gewebekulturplatten | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 rekombinantes Protein | R& Ampere; D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterilfiltereinheiten | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatine (aus Schweinehaut) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Steril | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, kein Calcium, kein Magnesium | Life Technologies | 14200 |
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