Method Article

Identifizierung von MyoD Interaktom Gekoppelt Mit Tandem Affinity Purification zu Mass Spectrometry

DOI:

10.3791/53924

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May 17th, 2016

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1Epigenetics and Cell Fate, UMR 7216 CNRS, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS - Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MyoD ist ein myogener Transkriptionsfaktor mit einer starken Fähigkeit, die myogene Transdifferenzierung vieler vollständig differenzierter Nicht-Muskelzelllinien zu induzieren. Die epigenetischen Mechanismen, die an dieser Transdifferenzierung beteiligt sind, sind weitgehend unbekannt. Hier beschreiben wir eine Aufreinigungsmethode mit doppelter Affinität, gefolgt von Massenspektrometrie, um MyoD-Partner umfassend zu charakterisieren.

Abstract

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Der Skelettmuskel terminale Differenzierung beginnt mit dem Einsatz von pluripotenten mesodermalen Vorläuferzellen zu Myoblasten. Diese Zellen haben immer noch die Möglichkeit, sich zu vermehren oder sie können unterscheiden und Sicherung in kernige Myotuben, die maturate weiter Muskelfasern zu bilden. Der Skelettmuskel terminalen Differenzierung wird durch die koordinierte Wirkung von verschiedenen Transkriptionsfaktoren orchestriert, insbesondere die Mitglieder der Muskel-regulierende Faktoren oder MRF (MyoD, Myogenin, Myf5 und MRF4), auch genannt die myogenen bHLH Transkriptionsfaktoren Familie. Diese Faktoren wirken mit Chromatin-Remodeling-Komplexe in aufwendigen Transkriptionsregulationsnetzskelett myogenesis zu erreichen. Dabei ist der Master MyoD myogenen Transkriptionsfaktor betrachtet in Muskel terminalen Differenzierung auszulösen. Diese Vorstellung wird durch die Fähigkeit von MyoD verstärkt nicht-Muskelzellen in Skelettmuskelzellen umwandeln. Hier haben wir einen Ansatz beschreiben MyoD zu identifizierenProteinpartner in erschöpfender Weise, um die verschiedenen Faktoren in Skelettmuskel terminalen Differenzierung beteiligt aufzuklären. Das langfristige Ziel ist es, die epigenetische Mechanismen bei der Regulation der Skelettmuskulatur Gene beteiligt zu verstehen, dh., MyoD Ziele. MyoD Partner werden durch die Verwendung Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) von einem heterologen System gekoppelt mit der Massenspektrometrie (MS) Charakterisierung, gefolgt von Validierung der Rolle der relevanten Partner während der Skelettmuskulatur terminalen Differenzierung identifiziert. kongenitale Myasthenie, Muskeldystrophie, Rhabdomyosarkom und Defekte in der Regeneration der Muskulatur: Aberrant Formen von myogenen Faktoren oder deren abweichende Regelung, sind mit einer Reihe von Muskelerkrankungen in Verbindung gebracht. Als solche bieten myogenen Faktoren einen Pool von potenziellen therapeutischen Ziele in Muskelerkrankungen, sowohl im Hinblick auf Mechanismen, die Krankheit selbst und regenerative Mechanismen verursachen, die Behandlung von Krankheiten zu verbessern. Somit ist die detaillierte underding der intermolekularen Wechselwirkungen und die genetischen durch die myogene Faktoren gesteuert Programme ist für das rationale Design von effizienten Therapien unerlässlich.

Introduction

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Eukaryotische mehrzellige Organismen werden aus verschiedenen Organen und Geweben besteht. Jedes funktionale Gewebe hat ein spezifisches Gen-Musterausdruck, der bei jedem Differenzierungsschritt bestimmt wird. Zelldifferenzierung beinhaltet die Aktivierung von spezifischen Genen, Wartung ihrer Expression und, im allgemeinen, die von einem Satz von Genen, beteiligt an der Zellproliferation silencing. Skelettmuskeldifferenzierung oder Myogenese, ist somit ein mehrstufiges Verfahren, das mit der Bestimmung von mesodermalen Stammzellen in Myoblasten beginnt, und dann führt zur terminalen Differenzierung dieser Myoblasten in erste mono nukleiert, und dann mehrkernigen, Myotuben . Somit Myoblasten "bestimmt" Zellen, die noch in der Lage zu proliferieren, aber sie sind auf die Skelettmuskelabstammungslinie gebunden und somit ausschließlich in Skelettmuskelzellen entweder während der embryonalen Entwicklung oder im Erwachsenenmuskelregeneration unterscheiden kann. Der Prozess der Skelettmuskulatur Terminal unterscheidenzierung wird durch eine spezifische genetische Programm orchestriert , die aus dem Zellzyklus der Myoblasten - Vorläuferzellen mit dem Permanent Ausgang beginnt , die mit 1 der Proliferation assoziierten Genen, wie E2F Zielgenen auf eine definitive silencing führt. Tatsächlich während des Prozesses der terminalen Differenzierung, Proliferation Myoblasten Stillstand ist ein entscheidender Schritt, der die Expression von Skelettmuskel - spezifischen Genen und die Fusion von Myoblasten in Myotuben 2 vorausgeht. Ein solches Programm ermöglicht erwachsenen Muskelstammzellen, auch Satellitenzellen genannt, während des Regenerationsprozesses folgende Skelettmuskelverletzung zu unterscheiden.

Mammalian myogenesis auf eine Familie von myogenic basischen Helix-Loop-Helix kritisch abhängig ist (bHLH) Transkriptionsfaktoren MyoD, Myf5, MRF4 und Myogenin bezeichnet häufig als die Familie der Skelettmuskulatur Bestimmung Faktoren oder MRF (Muscle Regulatory Factors) 3. Jeder von ihnen spielt eine wesentliche Rolle in der Beschreibung und den difzierung von Skelettmuskelzellen und eine spezifische Expressionsmuster April 05-07. Die Aktivierung von Myf5 und MyoD bildet die bestimmend Schritt, die Zellen in die myogenen Linie, und anschließende Expression der Myogenin löst myogenesis mit der Aktivierung von Skelettmuskel spezifische Gene, wie MCK (Muscle Creatine Kinase) begeht. Myogenen bHLH - Transkriptionsfaktoren wirken mit Mitgliedern der MEF2 - Familie bei der Aktivierung von Muskel Gene von zuvor stillen loci 8. Sie stimulieren auch Skelettmuskel Gentranskription als Heterodimere mit ubiquitären bHLH - Proteinen, E12 und E47, wie E - Proteine ​​bekannt, die in verschiedenen Gen-regulatorischen Regionen 8 sogenannte E-Boxen binden. Twist, Id (Inhibitor der Differenzierung) und andere Faktoren negativ diesen Prozess regulieren, durch die Bindung 8 mit MyoD für E - Proteine ​​konkurrieren.

MyoD wird als wichtiger Akteur betrachtet bei der Auslösung von Muskel terminale Differenzierung 9 da hat es die Fähigkeit , eine myogenic Bestimmung / Differenzierung (trans-Differenzierung) Programm in vielen ausdifferenzierten nicht Muskelsysteme 10-13 zu induzieren. Tatsächlich induziert gezwungen Expression von MyoD die trans-Differenzierung verschiedener Zelltypen , auch diejenigen , die aus einem anderen embryologischen Ursprungs 12. Zum Beispiel MyoD können Hepatozyten, Fibroblasten, Melanozyten, Neuroblasten und Adipozyten in muskelähnliche Zellen umwandeln. Die trans-differentiative Wirkung von MyoD beinhaltet eine abnormale Aktivierung des genetischen Programms myogene (insbesondere seine Zielgene) in einem nicht-muskuläre Umgebung gleichzeitige zum Silencing des ursprünglichen genetischen Programms (insbesondere Proliferationsgene).

In proliferierenden Myoblasten wird MyoD ausgedrückt , ist aber nicht imstande, seine Zielgene selbst aktivieren , wenn es um ihre Promotoren bindet 14-16. Daher ist für die Anforderung MyoD kontinuierlich in undifferenzierte Myoblasten exprimiert werden bleibt ganz elusive. MyoD konnte seine Zielgene aufgrund Rekrutierung von repressiven Chromatin-modifizierende Enzyme in proliferierenden Myoblasten vor dem Laden von Chromatin - Remodeling - Enzyme 14,17 Aktivierung unterdrücken . Zum Beispiel Myoblasten in wuchernden, MyoD mit Transkriptions Korepressor KAP-1, Histon-Deacetylasen (HDACs) und repressive Lysin-Methyltransferasen (KMZ) verbunden sind, einschließlich Histon H3 Lysin 9 oder H3K9 und H3K27 Kmts und unterdrücken aktiv seine Zielgene Ausdruck durch eine lokal repressiven Chromatinstruktur 14,17 etablieren. Wichtig ist , zeigte eine kürzlich veröffentlichten Bericht , dass MyoD ist selbst durch die H3K9 KMT G9a was zu einer Hemmung der Aktivität transaktivierend 16 direkt methyliert.

Die epigenetische Mechanismen in dieser Transdifferenzierung nicht-Muskelzellen durch MyoD sind weitgehend unbekannt. Bemerkenswerterweise sind einige Zelllinien resistent gegen MyoD-induzierte Transdifferenzierung. So wird in HeLa-Zellen, MyoD ist entweder inaktiv oderkönnte sogar als Repressorfunktion anstatt Aktivator der Transkription aufgrund des Fehlens der Expression der BAF60C Untereinheit des Chromatin - Remodeling - Komplexes SWI / SNF 18. Dieses Modell kann somit der Wahl sein, um besser die Mechanismen der MyoD-induzierte Gen Repression zu charakterisieren. Es ist auch geeignet , um die Fähigkeit von MyoD dem Test an seinem Zielloci mit seinen zugehörigen Partner repressive Chromatin - Umgebung zu induzieren und daher die MyoD abhängigen repressive Mechanismen aufzudecken Myoblasten in proliferierenden terminalen Differenzierung zur Feinabstimmung.

Hier beschreiben wir das Protokoll für die Identifizierung von MyoD Partner unter Verwendung von Tandem Affinity Purification (TAP-Tag), die mit der Massenspektrometrie (MS) Charakterisierung. Die Verwendung von HeLa-S3-Zellen stabil Flag-HA-MyoD exprimieren erlaubt genug Material bekommen die MyoD Komplexe aus fraktionierten Kernextrakten zu reinigen. Die Identifizierung von MyoD Partner im heterologen System wurde von validati gefolgtauf in einem relevanten System.

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Protocol

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1. Herstellung von HeLa-S3 Nuclear Salz-gebundene und Chromatin-gebundenen Fraktionen

  1. Sammlung der Zellen
    1. Wachsen HeLa-S3 Flag-HA-MyoD und HeLa-S3 Flag-HA (Kontrollzelllinie) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin (Wachstums Medium) bei 37 ° C und 5% CO 2 in einer feuchten Inkubator.
      Hinweis: HeLa-S3 - Zellen stabil exprimieren Flag-HA-MyoD und HeLa-S3 transduzierten Zellen mit dem leeren Vektor (HeLa-S3 Flag-HA) entweder festgelegten Protokoll in beschriebenen werden könnte: 19,20, oder von den Autoren zur Verfügung gestellt.
    2. Amplify Zellen bis zu 10 vollständig konfluenten 150 mm-Schalen von jeder Zelllinie (HeLa-S3 Flag-HA-MyoD und HeLa-S3 Flag-HA-Zellen).
    3. Die überstehende Flüssigkeit (enthalten nicht adhärenten Subpopulation) in 5 L Spinner.
    4. Waschen Sie die anhaftende Subpopulation mit 10 ml PBS pro 150 mm Schale, trypsinize Zellen für 1 min bei Raum temtur (0,05% Trypsin-EDTA-Lösung, 2 ml für eine 15-cm-Schale).
    5. 4 ml des Mediums pro 150 mm Schale und sammeln die Zellen in 50-ml-Röhrchen.
    6. Kombinieren Sie den Überstand aus Schritt 1.1.3 (in der 5 L Spinner) und den Zellen aus Schritt 1.1.5, 500 ml frischem vorgewärmten Wachstumsmedium für jede Zelllinie.
    7. Übertragen Zellsuspension in 5 L spinner und wachsen Zellen für mindestens 60 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2 in einer feuchten Inkubator.
    8. In 500 ml frisches Wachstumsmedium und wachsen Zellen für 24 Stunden.
    9. 1 l frischem Wachstumsmedium und wachsen Zellen für 24 Stunden.
    10. Nehmen Sie 1 ml der Zellsuspension, die Zellen zu zählen und zu überprüfen, die Lebensfähigkeit der Zellen. Farbe 30 ul Zellsuspension mit 30 ul 0,4% Trypanblau und zählen am Leben (nicht blau) Zellen unter dem Mikroskop mit Zählkammer.
    11. Halten Sie die Zelldichte bei 2 - 6 x 10 5 Zellen / ml von täglich frischem Wachstumsmedium Zugabe; nicht mehr als 1 x 10 6 Zellen / ml. Das MaximumVolumen für einen 5-l-Spinner 2,5 L.
      Hinweis: Für die folgenden Schritte gehen von Chargen von 2-2,5 l Kultur bei einer Dichte 1 x 10 6 Zellen / ml. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.12 - 1.1.14 etwa 20 l zu sammeln (≈ 20 g trockenes Pellet) jeder Zelllinie vor dem nächsten Schritt fortfahren.
    12. Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C und den Überstand zu verwerfen.
    13. Die Zellen in 100 ml eiskaltem PBS durch Pipettieren und Zentrifugieren bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C, um das Pellet zu waschen.
    14. Wiederholen Sie die Wäsche durch Resuspendieren der Zellen mit 25 ml eiskaltem PBS, die Suspension in 50-ml-Röhrchen übertragen und bei 500 g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert.
      Anmerkung: Die Zellpellets können entweder sofort verwendet oder in flüssigem Stickstoff eingefroren und mehrere Tage bei -80 ° C gelagert.
  2. Isolierung der Nuclei
    Hinweis: Führen Sie die Schritte 1.2.1 - 1.4.3 im Kühlraum.
    1. Pre-Chill buffers und Homogenisatoren.
    2. Wenn gefrorene Material, schnell bei 37 ° C, um die Zellpellets in einem Wasserbad auftauen.
    3. Resuspendieren von 20 g (≈ 20 ml) der Zellen in 20 ml (ein Volumen gleich der Größe des Pellets Zelle) des hypotonischen Puffers A (Tabelle 3) auf den ersten 10 ml des Puffers verwendet, dann Zugabe von 5 ml, dann Zugabe weitere 5 ml. Waschen Sie die Pipetten gut mit frischem Puffer, um die maximal Zellen zu erhalten.
    4. Transfer 40 ml Zellsuspension in die vorgekühlten Homogenisator mit einem eng anliegenden Stößel.
    5. Homogenisieren Zellen mit 20 Schlägen in einem Homogenisator (20 in und aus Bewegungen) und Zellsuspension in 50-ml-Röhrchen übertragen.
    6. Waschen den Homogenisator mit 7 ml Saccharosepuffer (1/3 des anfänglichen Zellvolumen, Tabelle 3) das Maximum von Zellen zu gewinnen. Übertragen Sie diese Suspension schnell in die 50-ml-Röhrchen aus Schritt 1.2.5, um die Kerne zu erhalten und die Leckage zu begrenzen.
    7. Stain ein 30-ul-Aliquot mit 30 ul 0,4% trypan blau, unter dem Mikroskop zu analysieren, um die Lyse Effizienz zu steuern (wenn die Lyse erfolgreich ist, sollten alle Kerne blau sein). Falls erforderlich, wiederholen Homogenisierungsschritt.
    8. Zentrifuge für 7 min bei 10.000 × g und 4 ° C, um die Kerne zu pelletieren. Speichern Sie den Überstand als Zytoplasmafraktion.
  3. Herstellung von Kernsalz extrahierbar (SE) Fraktion
    1. Resuspendieren Kerne Pellet in 8 ml Saccharosepuffer (ein Volumen gleich der Größe der Kerne Pellet). Hinzufügen tropfen unter Mischen gründlich auf einem Vortex - 8 ml Hochsalzpuffer (1 Kerne Pelletvolumen, Tabelle 3) zu einer Endkonzentration von 300 mM NaCl zu erhalten. Inkubieren für 30 min auf Eis und mischen alle 5 min.
    2. Verringern NaCl-Konzentration auf 150 mM durch Zugabe von 8 ml (1/3 des Gesamtvolumens) Sucrose-Puffer. Zentrifuge für 10 min bei 13.000 xg und 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand (Kern Salz extrahierbare Fraktion, SE).
      Hinweis: Entweder gehen 1.3.3 zu treten oder die SE verlassenFraktion auf Eis während der Herstellung von Chromatin-gebundenen Fraktion und dann Ultrazentrifuge gleichzeitig beide Fraktionen.
    3. Ultrazentrifuge SE für 30 min bei 85.000 × g bei 4 ° C. Nehmen Überstand (≈ 26 ml).
    4. Frieren 100 ul aliquoten in flüssigem Stickstoff. Gehen Sie 2 "Protein-Komplex Reinigung" zu dem Schritt, den Rest des Extraktes verwenden.
      Hinweis: Das Aliquot als Eingabesteuerung während Schritt 5.1.1 verwendet werden soll.
  4. Herstellung von Chromatin-gebundenen Fraktion
    1. Resuspendieren des Pellets (aus Schritt 1.3.5.) Sorgfältig in 7 ml (ein Volumen gleich der Größe des Pellets) Sucrose-Puffer.
    2. Hinzufügen CaCl 2 auf eine Endkonzentration von 1 mM (28 & mgr; l 0,5 M CaCl 2 für 14 ml Suspension) MNase (Schritt 1.4.4) und mischen zu aktivieren.
    3. Vorheizen Suspension für 1 min bei 37 ° C.
    4. In 70 ul Mikrokokken-Nuclease (MNase) Endkonzentration von 0,0025 U / ul (1/200 Verdünnung von 0,5 zu erhaltenU / ul Lager) und mischen.
    5. Inkubieren genau 12 min bei 37 ° C. Mischen Sie alle 4 Minuten.
    6. Sofort legen Sie die Reaktion auf Eis.
    7. MNase Aktivität, fügen Sie 112 ul 0,5 M EDTA pH 8,0 (1/125 Verdünnung) bis zu einer Endkonzentration von 4 mM zu stoppen. Inkubieren für 5 min auf Eis.
    8. Beschallen 5 mal für 1 min bei hoher Amplitude, zwischen zwei sonications erlauben eine Pause von 1 min (10 min insgesamt).
    9. Ultrazentrifuge für 30 Minuten bei 85.000 xg und 4 ° C.
    10. Die überstehende Flüssigkeit (Nukleosomen angereicherte Fraktion, NE, ≈ 12 ml).
    11. Frieren 50-ul-Aliquot in flüssigem Stickstoff. Gehen Sie 2 "Protein-Komplex Reinigung" zu dem Schritt, den Rest des Extraktes verwenden.
      Hinweis: Das Aliquot als Eingabesteuerung während Schritt 5.1.1 verwendet werden soll.

2. Proteinkomplexe Reinigung

Hinweis: Gehen Sie parallel Auszüge aus jeder Zelllinie (HeLa-S3 Flag-HA-MyoD und die Kontrolle, HELa-S3 Flag-HA).

  1. Flag- basierte Reinigung
    1. Vorwäsche Flag Harz. Verwenden Sie 600 ul Flag Harz (von der handelsüblichen 50% Lager) für jeden experimentellen Punkt (SE und NE-Fraktionen für jede Zelllinie).
    2. Transfer von Harz in 15 ml - Röhrchen, Resuspendieren in 13 ml kaltem tegn (Tabelle 3), Zentrifuge für 2 min bei 1000 xg Überstand und zu entfernen. 5-mal wiederholen. Nach dem letzten Wasch Resuspensierbereich Flag Harz in gleichen Volumen tegn (300 & mgr; l für jeden experimentellen Punkt).
    3. Für jeden experimentellen Punkt, mischen 600 ul gewaschenen Flag Harz und die entsprechenden Proteinextrakte (in einem 15-ml-Röhrchen für die 12 ml NE und in einem 50-ml-Röhrchen für die 26 ml SE Fraktionen, jeweils). Inkubieren auf einem rotierenden Rad über Nacht bei 4 ° C.
    4. Zentrifuge für 2 min bei 1000 × g bei 4 ° C, zur Seite legen Sie den Überstand und halten bei 4 ° C, bis das Ergebnis des Reinigungseffizienz-Test (2.2).
    5. Für die SE Proben, resuspendieren Flag Harzin 4 ml tegn und in ein 15-ml-Tube. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal, jedes Mal auf den gleichen 15-ml-Röhrchen übertragen zu vermeiden Perlen zu verlieren. Zentrifuge 2 min bei 1000 × g und 4 ° C, und entfernen Sie den Überstand.
    6. Wasch Flag Harz 7 mal in einem 15 ml Röhrchen unter Verwendung von 13 ml tegn und Zentrifugieren 2 min bei 1000 xg und 4 ° C.
    7. Nach der letzten Waschung Resuspension in 1 ml tegn und Transfer in ein 1,5 ml schwach bindende Rohr. Zentrifuge 2 min bei 1000 xg und 4 ° C und den Überstand entfernen.
    8. Resuspendieren in 200 ul Flag-Peptid-Lösung bei 4 mg / ml bei pH 7,8 für jeden experimentellen Punkt. Mischen Sie die Perlen und Peptid. Mit 200 & mgr; l tegn Puffer und Inkubation bei 4 ° C für mindestens 4 Stunden oder über Nacht gebundenen Proteine ​​eluieren.
    9. Zentrifuge für 2 min bei 1000 × g bei 4 ° C und übertragen das Harz und der Überstand (Flag Eluat) auf eine leere Spin-Säule platziert in einem 2-ml-Röhrchen.
    10. Zentrifugieren Sie die Spalte, sammeln die übrig gebliebenen Überstand in der 2-ml-Röhrchen.
    11. Sammeln Sie die Flag Harz durch tegn Puffer auf die Säule Zugabe und mit dem zweiten Flag Elution mit 200 ul Flag Peptidlösung (4 mg / ml) über Nacht bei 4 ° C für jeden experimentellen Punkt fortfahren.
    12. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.9 - 2.1.10 zweite Elution zu sammeln. Kombinieren ersten und zweiten Eluate.
  2. Test von Reinigungseffizienz
    Hinweis: Während der Schritt 2.1.11 - 2.1.12, führen SDS-PAGE und Silberfärbung (2.2.1 - 2.2.2).
    1. Nehmen Sie sich 15 ul der Eluate, fügen Sie 5 ul 4x Ladepuffer und 2 ul 10x Reduktionsmittel, kochen für 5 min bei 96 ° C und betreiben ein SDS-Polyacrylamid von 4 - 12% Gel gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    2. Stain das Gel mit Silberfärbung Kit (folgen Sie den Anweisungen des Herstellers). Wenn es deutliche Unterschiede in der Proteinmuster zwischen Flag-HA-MyoD und Flag-HA Mock Eluate ist, insbesondere die Band von Flag-HA MyoD (etwa 50 kDa, 1A), gehen Sie zum nächsten steSeite
  3. Hämagglutinin (HA) -basierte Reinigung
    1. Wasch HA-Harz, indem sie in 15 ml-Röhrchen übertragen, Resuspendieren in 13 ml tegn und Zentrifugieren 2 min bei 1.000 × g bei 4 ° C. Waschschritt wiederholen 5-mal. Nach dem letzten Wasch resuspendieren Perlen in gleichen Volumen tegn Puffer.
      Hinweis: Die Lautstärke eingestellt werden, müssen entsprechend der Leistungsfähigkeit von Flag-basierte Reinigung. Beginnen Sie mit 300 & mgr; l aus dem handelsüblichen 50% Lager für jeden experimentellen Punkt.
    2. Übertragen HA Harz für jeden experimentellen Punkt in ein 1,5 ml geringe Bindungsrohr. Zentrifuge 2 min bei 1.000 × g bei 4 ° C, das Maximum des Waschpuffer (Tabelle 3) zu beseitigen , und die Eluate von Flag-basierten Reinigung in die HA - Harz hinzuzufügen.
    3. Die Röhrchen auf dem sich drehenden Rad über Nacht bei 4 ° C.
    4. Zentrifuge für 2 min bei 1000 × g bei 4 ° C, zur Seite legen Sie den Überstand und halten bei 4 ° C, bis das Ergebnis des Reinigungseffizienz-Test (2.3.12.).
    5. ReAussetzung der HA Harz in 0,5 ml tegn, übertragen auf einen neuen Tief 1,5-ml-Röhrchen zu binden. Wiederholen Sie einmal Aufwirbelung auf den gleichen 1,5-ml-Röhrchen Zugabe zu vermeiden, Perlen und Zentrifuge 2 min bei 1000 × g und 4 ° C zu verlieren. Überstand entfernen.
    6. Waschen Perlen 8-mal um 1 ml tegn jedes Mal mit, Zentrifugieren 2 min bei 1000 × g und 4 ° C und Entfernen von Überstand (nicht zu verlieren Kügelchen). Nach der letzten Waschung, übertragen Sie die Perlen in 0,5-ml-Röhrchen.
    7. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich. Füge 100 & mgr; l HA freie Peptidlösung (4 mg / ml) bei pH 7,8 auf Kügelchen gebundenen Proteine ​​zu eluieren. Inkubieren auf dem rotierenden Rad über Nacht bei 4 ° C.
      Anmerkung: Die Menge des HA-Peptids angepasst werden muss in Abhängigkeit von der Fülle der Komplexe.
    8. Zentrifuge für 2 min bei 1000 × g bei 4 ° C und übertragen das Harz und der Überstand (HA Eluat) auf eine leere Spin-Säule platziert in einem 2-ml-Röhrchen.
    9. Zentrifugieren Sie die Spalte mit der linken Überstands in der 2-ml-Röhrchen zu sammeln.
    10. Führen Sie eine zweite Elution mit 100 ul HA-Peptid (4 mg / ml) für jeden experimentellen Punkt. Inkubieren auf dem rotierenden Rad über Nacht bei 4 ° C. Wiederholen Sie Schritt 2.3.8 - 2.3.9 auf den zweiten Elution sammeln.
    11. Kombinieren ersten und zweiten Eluate.
    12. Test - Reinigungswirkungsgrad durch SDS-PAGE und Silberfärbung (siehe Schritte 2.2.) (1A).
    13. Konzentriere das Eluat HA bis 30 & mgr; l unter Verwendung von Zentrifugal-Filtereinheiten mit einer 10 kDa cut-off (Nennmolekulargewichtsgrenze, NMWL) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    14. Teilen Sie die konzentrierten Proben in zwei Teile: 22,5 (3/4) und 7,5 (1/4) ul. Schnellfrost 1/4 der Proben in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Verwenden Sie den 3/4 Teil für Schritt 3.
      Hinweis: Der 1/4 gefrorenen Teil ist durch Western-Blot zur Bestätigung der Massenspektrometrie Ergebnisse verwendet werden (siehe Schritt 5.1).

3. Massenspektrometrie-Analyse

Hinweis: Die folgenden Schritte sollten mit dem Mass Spectrometry Facility besprochen werden, die die Analyse durchführen wird.

  1. Nachtrag 3/4 (22,5 ul) der Proben mit 7,5 ul 4x Ladepuffer und 3,3 ul 10x Reduktionsmittel und kochen für 5 min bei 96 ° C.
  2. Laden Sie die Proben auf einem SDS-Polyacrylamid von 4 - 12% Gel. Führen Gel bei 150 V konstant für 5 Minuten, damit alle Proteine ​​des Gels ohne Trennung einzugeben.
  3. Waschen Sie das Gel mit Wasser; fix für 20 - 30 min mit Fixierungslösung (10% Essigsäure, 50% Methanol, 40% besonders sauberes Wasser), dann die festen Gel 5-mal in extrem sauberes Wasser waschen.
  4. Schneiden Sie die Bänder, die die Proteine, lagern in 1 ml Wasser in einem 1,5-ml-Röhrchen und senden Massenspektrometrie-Anlage enthält.

4. Datenanalyse

Hinweis: Dies ist eine allgemeine Anleitung für die Analyse ist. Die genauen Schritte hängen von der speziellen Art der von MS Einrichtung angegebenen Datenverwendet , um die Analyse (zB 21,22) durchzuführen.

  1. Vergleichen Sie die Liste der identifizierten Proteine ​​in "MyoD" Eluate mit der Liste von entsprechenden negativen Kontrollpräparat erhalten. Ausschließen aus der Analyse der Proteine ​​in beiden Listen gefunden.
  2. Entfernen Sie Proteine, die ≤2 Gesamtzahl der identifizierten Peptide aus den verbleibenden Liste haben.
  3. Zugang funktionelle Annotation und funktionelle Klassifizierung der erhaltenen Liste von Proteinen DAVID Bioinformatik - Ressourcen (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) und klassifizieren die Liste der Proteine ​​23,24.
  4. (Optional) Entfernen der Liste "Tramper", geladene nichtnukleare Proteine ​​mit starken zufälliges Bindung zu 25 negativ geladene DNA. Diese enthalten Zytoskelett, zytoplasmatische, mitochondriale Membran und Rezeptorproteine ​​(Proteinfaltung, Zytoskelett und Sonstiges Gruppe Proteine ​​in den Tabellen 1 und 2).
  5. Vergleichen der erhaltenen Listen der MyoD Interaktoren von SE und NE Fraktionen gemeinsame Proteine ​​und Proteine ​​, die für jede Fraktion (Abbildung 2) spezifisch zu identifizieren.

5. Bestätigung der Identifizierten Interacter durch Western Blot

  1. Bestätigung in HeLa-S3 Flag-HA-MyoD und HeLa-S3 Flag-HA
    1. Thaw Eluatproben bei dem Schritt 2.3.14 (7,5 ul) auf Eis erhalten. Liste 12 ul tegn Puffer, 10 & mgr; l 4x Ladepuffer und 3 ul 10fach Reduktionsmittel. Boil Proben für 5 min bei 96 ° C.
    2. Bereiten Eingangsabtastwerte für das Western-Blotting.
      1. Auftauen Aliquots aus den Schritten 1.3.9 und 1.4.11 und Proteinkonzentration zu messen, zum Beispiel BCA Kit (Herstellerangaben beachten).
      2. Verwenden Sie 15 ug des Proteins pro Spur. Messen Sie die entsprechende Menge des Extrakts und justieren Volumen der Probe bis zu 15 & mgr; l mit tegn Puffer.
      3. In 5 ul 4x Ladepuffer und1,5 ul 10x Reduktionsmittel. Boil Proben für 5 min bei 96 ° C.
    3. Führen Sie eine Western-Blot-Analyse mit Antikörpern von Interesse (spezifisch für Partner Kandidat bei MS-Analyse identifiziert) unter Verwendung von 15 ul Eluatproben. Verwenden Eingangs Extrakte als Kontrolle der endogenen Proteinspiegel (3A).
  2. Bestätigung im Relevant Cellular System
    1. Vorbereitung der gesamten Kernextrakt von C2C12 Maus-Myoblasten.
      1. Wachsen C2C12 - Maus - Myoblasten in DMEM Medium mit 15% fötalem Kälberserum, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin bei 37 ° C und 5% CO 2 in einer feuchten Inkubator. Überschreiten Sie niemals 80% Zellkonfluenz Zellen in proliferativen Zustand zu halten.
      2. Wachsen mindestens zwei 150 mm-Schalen von C2C12 für einen Punkt (ein Antikörper), der Immunpräzipitation (IP). Saugen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml PBS.
      3. Abkratzen der Zellen und sammeln in 15-ml-Tube. Centrifuge bei 250 xg für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen.
      4. Schätzen das Volumen des Zellpellets (= V Zelle). Sanft das Pellet in 3 Volumen V Zelle von hypotonischen Puffer B Cytoplasmamembran (Tabelle 3) zu stören.
      5. Hinzufügen 0,44 x V Zellvolumen von 10% NP-40 zu erreichen Endkonzentration von 1% (v / v). vorsichtig umdrehen das Rohr mehrmals zu mischen.
      6. Hinzufügen 0,89 x V Zellvolumen von SR (Tabelle 3) , um die Kerne Integrität zu bewahren. Vorsichtig wird das Röhrchen mehrmals die Suspension und Zentrifuge für 5 min bei 2000 xg zu homogenisieren Kerne zu pelletieren.
      7. Entfernen Sie den Überstand (Cytosol-Fraktion). Schätzen Sie das Volumen der Kerne Pellet (= V Nuk). Resuspendieren Kerne Pellet in einem Volumen V Nuk von Saccharose - Puffer.
      8. Hinzufügen tropfen während gründliches Mischen auf einem Vortex einem Volumen V nuc Hochsalzpuffer in einer Endkonzentration von 300 mM zu erhaltenNaCl, und 30 min auf Eis inkubieren. Mischen Sie alle 5 Minuten.
      9. In einem Volumen V Nuk von Saccharose - Puffer (zu verringern NaCl - Konzentration auf 150 mM) und CaCl 2 (Endkonzentration 1 mM). Mischen.
      10. Vorheizen Suspension für 1 min bei 37 ° C, fügen Mikrokokken-Nuklease zu bekommen Finale der Konzentration 0,0025 U / ul (1/200 ab Lager von 0,5 U / ul). Mischen.
      11. Inkubieren genau 12 min bei 37 ° C. Mischen Sie alle 3 min.
      12. Unmittelbar danach Reaktion auf Eis und fügen EDTA (Endkonzentration 4 mM) MNase Aktivität zu stoppen. Inkubieren für 5 min auf Eis.
      13. Beschallen 5 mal für 0,5 min jeweils bei hoher Amplitude. Zwischen zwei sonications, eine Pause von 0,5 min (5 min insgesamt) ermöglichen.
      14. Ultrazentrifuge für 30 Minuten bei 85.000 xg und 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand (Gesamtkernextrakt).
      15. Messen Sie die Proteinkonzentration des gesamten Kernextrakt, zum Beispiel unter Verwendung von BCA-Kit (Herstellerangaben beachten) und fahren Sie immediately 5.2.2 Schritt.
    2. Immunopräzipitation (IP) von endogenem MyoD.
      1. Um vorab klar die Extrakte, Waschen 10 ul Protein G-Agarosekügelchen für jeden Punkt IP.
        1. Übertragen Sie die benötigte Menge an Protein G Agarose-Kügelchen in ein 1,5-ml-Röhrchen, Resuspension in 1,4 ml kaltem tegn, Zentrifuge für 2 min bei 1800 × g und entfernen Sie den Überstand. 3-mal wiederholen.
      2. Mischen vorgewaschene Protein G-Agarosekügelchen mit dem entsprechenden Volumen der gesamten Kernextrakt. Verwenden Sie 500 ug Gesamt-Kernextrakt Protein pro IP-Punkt.
      3. Inkubieren auf einem rotierenden Rad bei 4 ° C für 2 Stunden, um die Extrakte vorge löschen.
      4. Zentrifuge für 5 min bei 1800 × g bei 4 ° C. Halten Sie den Überstand.
      5. Mix 5 ug MyoD Ab oder 5 ug Kaninchen-IgG mit 500 ug bereits geklärten Gesamtkernextrakten in 1,5 ml geringe Bindungsröhrchen. In tegn bis zu 1 ml Puffer. Inkubieren auf einem rotierenden Rad bei 4 ° C über Nacht.
        Hinweis: Führen Sie die fach Schritte während Schritt 5.2.2.3.
      6. Vorwäsche 7,5 ul Protein A / G Lager Perlen Lösung pro IP-Punkt.
        1. Übertragen Sie das benötigte Volumen der Kugeln in ein 1,5-ml-Röhrchen, resuspendieren Perlen in 1 ml tegn und Zentrifuge bei 1800 × g bei 4 ° C für 2 min. Entfernen Sie den Überstand. 3-mal wiederholen.
      7. Resuspendieren Protein A / G - Kügelchen in 1,5 ml Blockierungslösung (Tabelle 3) und Inkubieren auf einem rotierenden Rad über Nacht bei 4 ° C.
      8. Zentrifuge Gesamtkernextrakten inkubiert mit Abs (Schritt 5.2.2.5) bei 16.000 xg für 10 min bei 4 ° C. Halten Sie den Überstand.
      9. Zentrifuge blockiert Protein A / G-Harz (Schritt 5.2.2.7) bei 1.800 × g für 2 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren in 1 ml tegn Puffer. Re-Zentrifuge bei 1800 × g für 2 min bei 4 ° C auszuwaschen Blocking-Puffer.
      10. Resuspendieren blockiert Protein A / G-Harz in 1 ml tegn Puffer und aliquoten in neue proteinbindungsarmen Rohre 7,5 ul blo zu erhaltencked Protein A / G Harz pro IP-Punkt. Zentrifuge bei 1.800 × g bei 4 ° C für 2 min und so viel wie möglich von dem Überstand zu entfernen.
      11. Fügen Sie die Gesamtkernextrakten mit dem ABS inkubiert (oder Kontroll-IgG) mit dem A / G-Harz. Mischen und Inkubieren für 2 Stunden bei Raumtemperatur (RT) auf einem rotierenden Rad.
      12. Centrifuge Suspension 1800 × g bei RT für 2 min. Überstand verwerfen, Resuspendieren in 1 ml Waschpuffer und Transfer Suspension in neue niedrige Bindungs ​​Rohre. bei RT inkubieren 5 min auf einem sich drehenden Rad.
      13. Zentrifuge Suspension bei 1.800 × g bei RT für 2 min, Resuspension in 1 ml Waschpuffer und Inkubation für 5 min bei RT auf einem rotierenden Rad. Wiederholen 4 mal. Für die letzte Wasch Übertragung auf einen neuen Tiefbindungsrohr.
      14. Entfernen Maximum des Überstands. In 7 ul Waschpuffer, 7 ul 4x Ladepuffer und 3 ul 10x Mittel an die Kügelchen zu reduzieren, mischen und kochen für 5 min bei 96 ° C.
      15. Führen Sie eine Western-Blot-Analyse mit Antikörpern von interest (spezifisch für Partner Kandidat für die Immun gefällte Protein). Verwenden 1% (5 ug) von Eingangs Extrakte als Kontrolle der endogenen Proteinspiegel (3B).

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Results

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Um die Regulierung der Aktivität MyoD verstehen, unternahmen wir die erschöpfende Charakterisierung der MyoD Komplexe mittels biochemischer Reinigung, basierend auf der Immunreinigung einer Doppel tagged Form MyoD gefolgt von Massenspektrometrie (MS). Die Verwendung von HeLa-S3-Zelllinie exprimiert Flag-HA-markierten MyoD und eine Linie Kontrollzelle, die Flag-HA erlaubt genug Material bekommen die MyoD-Komplex zu reinigen, indem Sie doppelt Affinitätsreinigung von Flag-HA-MyoD durchführ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das vorgestellte Verfahren erlaubt eine erschöpfende Identifizierung von Partnern eines Transkriptionsfaktors, MyoD. Es zeigte sich MyoD Partner in einem heterologen System resistent gegen MyoD-induzierte Differenzierung, nämlich HeLa-S3-Zellen. Somit definitions identifiziert MyoD Partner ubiquitär exprimiert. Diese umfassen allgemein und sequenzspezifischen Transkriptionsfaktoren, Chromatin-modifizierende Enzyme, RNA - Prozessierung Proteine, Kinasen (Tabellen 1 und 2). Da HeLa-S3-Zel...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Arbeit im Ait-Si-Ali-Labor wurde unterstützt von der Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Institut National du Cancer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot und die "Wer bin ich?" Laboratory of Excellence #ANR-11-LABX-0071, finanziert von der französischen Regierung im Rahmen des Programms "Investments for the Future", das von der ANR unter dem Zuschuss #ANR-11-IDEX-0005-01 betrieben wird. EB wurde durch einen INCA Zuschuss unterstützt.

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Materials

, , ,

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell lines
HeLa-S3ATCCCCL-2.2
C2C12ATCCCRL-1772
Equipment
SpinnerCorning778531
Homogenisator:  Dounce Homogenisator Wheaton432-1273 und 432-1271
Rührwerk für SpinnerBellco778531
UltraschallgerätDiagenodeUCD 200
HämozytometerMarienfeld Superior 640610
Niedrig bindende RöhrchenSorenson27210
Leere Spin-SäuleBio-Rad7326204
Reagenzien
SDS-Polyacrylamid 4-12%  GelLife TechnologiesNP0336BOX
4x Ladepuffer Life TechnologiesNP0007
10x ReduktionsmittelLife TechnologiesNP0004
SilberfärbekitLife technologiesA8592
Zentrifugalfiltereinheiten, 10KMilliporeUFC501024
Protein G AgarosekügelchenSigma-AldrichP4691
Protein A/G  HarzThermo Scientific53132
Flag Harz (Anti-Flag M2-Agarose-Affinitätsgel)Sigma-AldrichA2220
HA Harz (monoklonale Anti-HA Agarose)Sigma-AldrichA2095
MNaseSigma-AldrichN3755
Flagfreies Peptid (DYKDDDDK)Ansynth Service BVKundenspezifische SyntheseResuspendierung von bis zu 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8
HA freies Peptid (YPYDVPDYA)Ansynth Service BVKundenspezifische SyntheseResuspendierung von bis zu 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8
Protein-Assay-Kit auf Bicinchoninsäure-Basis: BCA-KitThermo Scientific23225
Protease-InhibitorenSigma-AldrichS8830
Luminol-basiertes verbessertes Chemilumineszenz-Substrat (ECL) HRP-SubstratLebenstechnologien34075
BSA Sigma-AldrichA9647
Spermien-DNA von geschertem Lachs (Desoxyribonukleinsäure-Natriumsalz aus Lachshoden)Sigma-AldrichD1626
Spermin-TetrahydrochloridSigma-AldrichS1141
SpermidinSigma-AldrichS0266
GlycerinSigma-AldrichG5516
PBSSigma-AldrichD8537
MOPS LaufpufferLife TechnologiesNP0001
DMEM (hoher Glukosegehalt)Sigma-AldrichD0822Vorwärmen  bei 37&Grad; C vor Gebrauch
: Trypsin-EDTA (0,05 % PhenolrotLife Technologies25300-054
SerumGE, Gesundheitswesen, Life Sciences PAA A15-102Jede Charge Serum muss zuerst auf Ihre Zellen getestet werden.
Penicillin und Streptomycin Life technologies15140-122
Trypanblau-Lösung, 0,4%Life technologies15250-061
Wasser (steril gefiltert)Sigma-AldrichW3500
Antikörper
HA aus Ratte (12CA5)Roche11583816001
FlagSigma-AldrichA8592
MyoDSanta Cruzsc-32758Zur Verwendung für Western Blotting
MyoDSanta CruzSC-760Zur Verwendung für Immunpräzipitation und Western Blotting
CBFbetaSanta CruzFL-182 
HP1alphaEuromedex2HP2G9
HP1betaEuromedex1MOD1A9AS
HP1gammaEuromedex2MOD1GC
Suv39h1Cell Signaling Technology8729
BAF47BD Biosciences612111
Myf5Santa CruzSC-302
TubulinSigma-AldrichT9026
ActinSigma-AldrichA5441
IgG MausSanta CruzSC-2025
IgG KaninchenSanta CruzSC-2027
Ziege Anti-Ratte -HRPSigma-AldrichA9037
Ziege Anti-Kaninchen -HRPSigma-AldrichA6154 
Anti-Maus für Ziegen -HRPSigma-AldrichA4416

References

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