Identifizierung von MyoD Interaktom Gekoppelt Mit Tandem Affinity Purification zu Mass Spectrometry

Ekaterina Boyarchuk; Philippe Robin; Lauriane Fritsch; Véronique Joliot; Slimane Ait-Si-Ali

doi:10.3791/53924

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Methodenartikel

Identifizierung von MyoD Interaktom Gekoppelt Mit Tandem Affinity Purification zu Mass Spectrometry

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DOI:

10.3791/53924

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17. Mai 2016

Ekaterina Boyarchuk¹ , Philippe Robin¹ , Lauriane Fritsch¹ , Véronique Joliot¹ , Slimane Ait-Si-Ali¹

¹Epigenetics and Cell Fate, UMR 7216 CNRS, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS - Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité

In diesem Artikel

Zusammenfassung

MyoD ist ein myogener Transkriptionsfaktor mit einer starken Fähigkeit, die myogene Transdifferenzierung vieler vollständig differenzierter Nicht-Muskelzelllinien zu induzieren. Die epigenetischen Mechanismen, die an dieser Transdifferenzierung beteiligt sind, sind weitgehend unbekannt. Hier beschreiben wir eine Aufreinigungsmethode mit doppelter Affinität, gefolgt von Massenspektrometrie, um MyoD-Partner umfassend zu charakterisieren.

Zusammenfassung

Der Skelettmuskel terminale Differenzierung beginnt mit dem Einsatz von pluripotenten mesodermalen Vorläuferzellen zu Myoblasten. Diese Zellen haben immer noch die Möglichkeit, sich zu vermehren oder sie können unterscheiden und Sicherung in kernige Myotuben, die maturate weiter Muskelfasern zu bilden. Der Skelettmuskel terminalen Differenzierung wird durch die koordinierte Wirkung von verschiedenen Transkriptionsfaktoren orchestriert, insbesondere die Mitglieder der Muskel-regulierende Faktoren oder MRF (MyoD, Myogenin, Myf5 und MRF4), auch genannt die myogenen bHLH Transkriptionsfaktoren Familie. Diese Faktoren wirken mit Chromatin-Remodeling-Komplexe in aufwendigen Transkriptionsregulationsnetzskelett myogenesis zu erreichen. Dabei ist der Master MyoD myogenen Transkriptionsfaktor betrachtet in Muskel terminalen Differenzierung auszulösen. Diese Vorstellung wird durch die Fähigkeit von MyoD verstärkt nicht-Muskelzellen in Skelettmuskelzellen umwandeln. Hier haben wir einen Ansatz beschreiben MyoD zu identifizierenProteinpartner in erschöpfender Weise, um die verschiedenen Faktoren in Skelettmuskel terminalen Differenzierung beteiligt aufzuklären. Das langfristige Ziel ist es, die epigenetische Mechanismen bei der Regulation der Skelettmuskulatur Gene beteiligt zu verstehen, dh., MyoD Ziele. MyoD Partner werden durch die Verwendung Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) von einem heterologen System gekoppelt mit der Massenspektrometrie (MS) Charakterisierung, gefolgt von Validierung der Rolle der relevanten Partner während der Skelettmuskulatur terminalen Differenzierung identifiziert. kongenitale Myasthenie, Muskeldystrophie, Rhabdomyosarkom und Defekte in der Regeneration der Muskulatur: Aberrant Formen von myogenen Faktoren oder deren abweichende Regelung, sind mit einer Reihe von Muskelerkrankungen in Verbindung gebracht. Als solche bieten myogenen Faktoren einen Pool von potenziellen therapeutischen Ziele in Muskelerkrankungen, sowohl im Hinblick auf Mechanismen, die Krankheit selbst und regenerative Mechanismen verursachen, die Behandlung von Krankheiten zu verbessern. Somit ist die detaillierte underding der intermolekularen Wechselwirkungen und die genetischen durch die myogene Faktoren gesteuert Programme ist für das rationale Design von effizienten Therapien unerlässlich.

Einleitung

Eukaryotische mehrzellige Organismen werden aus verschiedenen Organen und Geweben besteht. Jedes funktionale Gewebe hat ein spezifisches Gen-Musterausdruck, der bei jedem Differenzierungsschritt bestimmt wird. Zelldifferenzierung beinhaltet die Aktivierung von spezifischen Genen, Wartung ihrer Expression und, im allgemeinen, die von einem Satz von Genen, beteiligt an der Zellproliferation silencing. Skelettmuskeldifferenzierung oder Myogenese, ist somit ein mehrstufiges Verfahren, das mit der Bestimmung von mesodermalen Stammzellen in Myoblasten beginnt, und dann führt zur terminalen Differenzierung dieser Myoblasten in erste mono nukleiert, und dann mehrkernigen, My....