Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Nachweis der miRNA-Expression in Brustkrebspatientinnenproben mittels miRNA-in-situ-Hybridisierung.
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Methodenartikel
Clinicopathological Analyse von miRNA Expression in Mammakarzinomen von miRNA Verwendung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In diesem Artikel beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für den miRNA-Nachweis in Brustkrebsgewebe unter Verwendung einer In-situ-Hybridisierung mit einer Digoxigenin-markierten LNA-Sonde (Locked Nucleic Acid). Die Sonde wurde mit Anti-DIG-Antikörpern gegen alkalische Phosphatase erkannt und später unter Verwendung eines alkalischen Phosphatasesubstrats entwickelt, das Fluoreszenzsignale erzeugt. Hier haben wir die miRNA-in-situ-Hybridisierungstechnik (MISH) verwendet, um die Expression von miR-489 in Geweben von Brustkrebspatientinnen zu analysieren. Mit dieser Technik kann die Lokalisation von miRNA von Interesse in einzelnen Gewebeproben nachgewiesen werden. Diese Technik kann verwendet werden, um die Expression der gewünschten miRNA im Tumorgewebe mit der im angrenzenden normalen Gewebe zu vergleichen und die spezifischen Strukturen zu identifizieren, die für die Expression dieser miRNA verantwortlich sind. Diese Technik kann sehr nützlich sein, um bestimmte klinische Fragen zu beantworten, wie z. B. die Rolle spezifischer miRNA bei der Entstehung von Krebs. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Brustepithelzellen signifikant höhere Spiegel an miR-489 exprimieren als benachbarte Tumorzellen.
Einleitung
Brustkrebs ist eine der häufigsten bösartigen Tumoren in der ganzen Welt die weibliche Bevölkerung zu beeinflussen. Mehr als 1,3 Millionen Fälle von Brustkrebs werden jedes Jahr weltweit 1,2 berichtet. Obwohl Tumorzellen traditionell als biologisch homogen und hochproliferative angesehen worden sind, hat sich gezeigt, dass Brustkrebs ist genetisch und klinisch heterogen. Der Widerstand gegen vorherrschende Krebsmedikamente ist ein Markenzeichen von fortgeschrittenem Brustkrebs, in der Mehrzahl der Patienten durch die Erleichterung der Tumorprogression und Metastasierung Abstand 3 auf die Mortalität führt.
MicroRNAs (....
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Protokoll
Diese Studie wurde von der Institutional Review Board der Universität Chonnam Hwasun Hospital und University of South Carolina genehmigt. TMA-Proben zusammengesetzt von Brustkrebs und abgestimmt angrenzenden normalen Brustgewebe wurden durch die Biobank der Chonnam National University Hwasun Hospital, ein Mitglied des Korea Biobank-Netzwerk zur Verfügung gestellt.
1. Herstellung der Lösung
- Bereiten Sie 1 l DNase und RNase freies Wasser. Nehmen Sie alle chemischen Lösungen mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser. Behandlung 1 l Wasser mit 500 & mgr; l DEPC und Inkubation für 3 Stunden bei Raumtemperatur. Autoklav, das ....
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Ergebnisse
Menschliche Brustkrebsgewebe wurde verwendet, miRNA-489-Expression zu bestimmen. Brustdrüsenkanal und Epithelzellen wurden in zwei Patienten (1A und 1B) signifikant höher miRNA-489 Ebenen als benachbarte Tumorgewebe zu exprimieren gefunden. Dies zeigt deutlich, dass miRNA-489 Expression im Tumorgewebe verloren gegangen ist, Tumor unterdrückende Aktivität von miRNA-489 hindeutet. Weiter zu bestätigen diese Ergebnisse, Tumorgewebe und benachbarten normalen.......
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Diskussion
Das Ziel dieser Studie war es, die Höhe der miRNA - Expression in Brustkrebsgewebe mit miRNA in - situ - Hybridisierung zu bestimmen. Es ist zu beachten, dass in diesem Experiment sind alle Bedingungen für die Brustkrebsgewebe optimiert. Eine weitere Optimierung könnte für andere Gewebetypen erforderlich. Alle Lösungen müssen mit DEPC Wasser hergestellt werden und alle Behälter verwendet werden, sollten mit DEPC behandeltem Wasser und anschließend autoklaviert gespült werden. Selbst geringe RNase Konta.......
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Offenlegungen
Es gibt nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss (5R01 CA178386-03) und den USC ASPIRE-1 Zuschuss an HC unterstützt. Wir danken Vrushab Gowda für seine Hilfe beim Manuskript.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| ELF-97 | Lebenstechnik | E6604 | |
| 50x Denhard't | Lebenstechnologie | ||
| t-RNA | Roche | 109541 | Rekonstitution in DEPC-Wasser |
| Heringsspermien DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blockierung | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Vor Gebrauch bei 16,1 RCF abdrehen und Überstand nehmen |
| miR-489 Sonde | Exiqon | 38599-01 | |
| Nukleasefrei BSA | Roche | ||
| Primärer Antikörper-Anti-DIG | Roche | ||
| Diethylpyrocarbonat | Sigma | 1609478 |
Referenzen
- Shah, N. R., Chen, H. MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment. World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).
- Tang, H., et al. miR-185 sup....
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Nachdrucke und Genehmigungen
