Murine Hind Gliedmaßen langen Knochen Dissection und Knochenmark-Isolation

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Dissektion von langen Knochen der Hintergliedmaßen (Femure und Tibiae) von der Labormaus. Des Weiteren beschreiben wir eine schnelle Technik zur Knochenmarkisolierung aus diesen Knochen, bei der Zentrifugation zur Entnahme von Knochenmark aus dem Knochenmarkraum eingesetzt wird.

Zusammenfassung

Die Untersuchung des Knochens und des Knochenmarks ist in vielen Forschungsbereichen von entscheidender Bedeutung, einschließlich der grundlegenden Knochenbiologie, Immunologie, Hämatologie, Krebsmetastasierung, Biomechanik und Stammzellbiologie. Trotz der Bedeutung des Knochens in einem gesunden und pathologischen Zustand ist er jedoch ein weitgehend untererforschtes Organ, da es an Fachkenntnissen über die Knochendissektion und die Isolierung des Knochenmarks mangelt. Mäuse sind ein gängiger Modellorganismus zur Untersuchung von Auswirkungen auf Knochen und Knochenmark, was eine standardisierte und effiziente Methode zur Dissektion langer Knochen und zur Isolierung des Knochenmarks für die Verarbeitung großer experimenteller Kohorten erforderlich macht. Wir beschreiben ein einfaches Dissektionsverfahren zur Entfernung des Femurs und der Tibia, das für Downstream-Anwendungen geeignet ist, einschließlich, aber nicht beschränkt auf histomorphologische Analysen und Krafttests. Darüber hinaus skizzieren wir ein schnelles Verfahren zur Isolierung von Knochenmark aus den langen Knochen durch Zentrifugation mit begrenzter Handhabungszeit, ideal für die Zellsortierung, primäre Zellkultur oder DNA-, RNA- und Proteinextraktion. Das Protokoll ist für eine schnelle Verarbeitung von Proben optimiert, um experimentelle Fehler zu begrenzen, und ist standardisiert, um die Variabilität von Benutzer zu Benutzer zu minimieren.

Einleitung

Das Studium der langen Knochen und der Zellen des Knochenmarks ist zentral für eine Vielzahl von Forschungsdisziplinen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Knochenbiologie, Krebsbiologie, Immunologie, Hämatologie und Biomechanik. Der Knochen ist ein hochdynamisches Organ, das zusammen mit dem Knorpel das Skelett bildet, um die inneren Organe mechanisch gegen Belastungen zu stützen und zu schützen. Darüber hinaus sind die mineralischen Bestandteile des Knochens eine Speichersenke für die kritischen Signalmoleküle Kalzium und Phosphor sowie andere Faktoren¹. Schließlich beherbergen Knochen das Knochenmark und bilden zusammen mit stoffwechselaktiven knochenbildenden Osteoblasten und knochenresorbierenden Osteoklasten die Stammzellnische, die für die Aufrechterhaltung hämatopoetischer und lymphatischer Zellpopulationen notwendig ist.

Knochen und Knochenmark sind bei vielen Erkrankungen betroffen, was oft zu Knochenmarkfunktionsstörungen, starken Knochenschmerzen und pathologischen Frakturen führt. Knochen ist eine häufige Metastasierungsstelle bei vielen soliden Tumoren, vor allem bei Brustkrebs und Prostatakrebs, wo Tumorzellen direkt in die Knochenmarknische eingreifen, um den Teufelskreis der Knochenmetastasierung einzuleiten und hämatopoetische Stammzellen zu verdrängen^2,3. Hämatopoetische Malignome wie Myelom und Leukämie sind gekennzeichnet durch eine Dysfunktion des Knochenmarks sowie eine Deregulierung des gesunden Knochenumbaus¹. Auch andere nicht-maligne Skeletterkrankungen sind aktive Forschungsgebiete wie Arthrose, Osteoporose, Skoliose und Rachitis. Selbst bei einem ansonsten gesunden Menschen führt ein biomechanisches Versagen eines Knochens zu einer schmerzhaften Fraktur. Alle diese Erkrankungen stellen aktive Forschungsbereiche dar, mit dem Ziel, neue Präventionsmaßnahmen und Behandlungsschemata zu identifizieren, um Morbidität und Mortalität zu reduzieren.

Um die Fülle der Rollen des Knochens und des Knochenmarks zu erforschen, sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen, ist es für Forscher von entscheidender Bedeutung, eine einfache und effiziente standardisierte Methode zum Sezieren der langen Knochen der Maus für die schnelle Verarbeitung großer in vivo Experimente zu haben. Das hier skizzierte Dissektionsprotokoll eignet sich für alle Analysen langer Knochen, einschließlich Ex-vivo-Bildgebung, Histologie, Histomorphometrie und Krafttests. In ähnlicher Weise ist eine standardisierte Knochenmarkisolierungsmethode mit hoher Knochenmarkzellrückgewinnung und geringer Variabilität zwischen den Anwendern wichtig für experimentelle Analysen wie die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) oder quantitative PCR (qPCR) sowie für nachgelagerte Anwendungen wie die primäre Zellkultur von Knochenmarkzellen.

Protokoll

Alle tierischen Arbeit wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee in Übereinstimmung mit den Empfehlungen in dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health skizzierte genehmigt.

1. Hind Gliedmaßen langen Knochen Dissection

1. Euthanize die Maus gemäß den Richtlinien des Instituts.
2. Bewegen Sie die Maus in Rückenlage und bringen durch alle vier Beine durch die Maus Fußballen unter dem Sprunggelenk feststecken.
3. Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol, gründlich die Beine Begießen.
4. Machen Sie einen kleinen Schnitt auf der rechten Seite der Mittellinie in den Unterbauch, knapp oberhalb der Hüfte.
5. Ziehen Sie den Einschnitt in den Beinen und vorbei am Sprunggelenk.
6. Ziehen Sie die Haut zurück und schneiden Sie die Quadrizeps-Muskel proximalen Ende des Oberschenkelknochens verankert die Vorderseite des Oberschenkels zu entlarven und Stift aus dem Bein aus, um den Stift in einem 45-Grad-Winkel von der Platine platzieren.
7. Mit dem blade der Schere gegen die hintere Seite des Oberschenkels, schneiden Sie die Beinbeuger aus dem Kniegelenk entfernt.
8. Ziehen Sie die Haut zurück, und die hinteren Oberschenkelmuskeln zu proximalen Ende des Oberschenkelknochens verankert die hintere Seite des Oberschenkels zu entlarven und Stift aus dem Bein aus, um den Stift in einem 45-Grad-Winkel von der Platine platzieren.
9. Mit der Zange, halten das distale Ende des Femurs, direkt über dem Kniegelenk. Führen Sie die Klingen der Schere auf beiden Seiten der Femurschaft in Richtung des Hüftgelenks, wobei darauf geachtet, nicht zu schneiden, in den Oberschenkelknochen selbst.
10. Nach dem Hüftkopf zu erreichen, durch die Schere leicht zu öffnen angezeigt, drehen Sie die Schere mit der oberen Klinge der Schere direkt über dem Hüftkopf Bewegen des Oberschenkels zu verrücken, man aufpassen, nicht die Knochen unterhalb des Hüftkopfes zu schnappen.
11. Fassen Sie den oberen Teil des Oberschenkelschaft mit der Zange, schneiden Sie das Weichgewebe aus dem Hüftkopf entfernt es aus der Hüftpfanne zu lösen.
12. Ziehen Sie die gesamte Beinknochen, einschließlichFemur, Knie und Schienbein, nach oben und weg vom Körper, Schneiden sorgfältig das Bindegewebe und Muskulatur verbindet das Bein auf die Haut entfernt.
13. Vorwagt das Sprunggelenk und wieder die Schere in einer Drehbewegung verwenden, um die Tibia zu verrücken.
14. Greifen die distale Ende der Tibia, dabei nicht die Sehnen zu trennen, ziehen Sie die Tibia nach oben und weg vom Körper und dem Stift Bord.
15. Schneiden jegliches verbleibende Bindegewebe den langen Knochen am Knie an der Maus befestigt.
16. Entfernen Sie alle zusätzlichen Muskel oder Binde am Femur befestigt Gewebe und der Tibia.
17. Für alle Anwendungen , die den Knochen erfordern intakt (Histologie, Histomorphometrie, biomechanische Tests, etc.) Zu bleiben, mit Standard-Haus Protokolle (wie in ^4-7) um fortzufahren. Um Knochenmark zu isolieren, gehen Sie zu Abschnitt 2.

2. Lange Knochenpräparation für Knochenmark-Isolation

1. Mit Hilfe der Pinzette fassen Sie den Oberschenkelknochen mit der Patella abgewandten einnd das proximale Ende (Hüftkopf) nach unten.
2. Vorwagt, das Kniegelenk und die Schere in einer Drehbewegung der Tibia zu verrücken und Femur.
3. Schneiden Sie Bindegewebe zusammen, um den Oberschenkel und Schienbein zu halten.
4. Mit Hilfe der Pinzette fassen Sie den Oberschenkelknochen mit dem vorderen abgewandten Seite und dem proximalen Ende (Hüftkopf Ende) nach unten.
5. Führen Sie die Schere, um die Femurschaft zu den Kondylen nach oben.
6. Vorsichtig drehen die Schere hin und her die Kondylen, die Patella zu entfernen, und die Epiphyse die Metaphyse zu belichten.
7. Entfernen Sie alle zusätzlichen Muskel oder Binde am Femur befestigt Gewebe mit einer Pinzette, Schere und Kimwipes.
8. Mit Hilfe der Pinzette greifen die Tibia mit der vorderen Seite abgewandten und dem distalen Ende (Knöchel Ende) nach unten.
9. Wenn die Tibiaepiphyse intakt ist, führen die Schere der Tibia Welle auf die Kondylen.
10. Drehen Sie vorsichtig die Schere hin und her die Kondylen zu entfernen und Epiphyse die Metaph aussetzenlyse.
11. Entfernen Sie alle Muskeln oder Binde an der Tibia befestigt Gewebe mit einer Pinzette, Schere und Kimwipes.

3. Bone Marrow Isolation

1. Drücken eine 18 G Nadel durch den Boden eines 0,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
2. Legen Sie die langen Knochen (maximal 2 Oberschenkel- und 2 tibiae) in das Rohr, Knie-Ende nach unten am Ende nach unten und den Deckel schließen.
3. Nest der 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
4. Zentrifugiere die Röhrchen bei nested ≥10,000 xg in einer Mikrozentrifuge für 15 Sekunden.
5. Stellen Sie sicher, dass das Knochenmark wurde aus den Knochen durch visuelle Inspektion gesponnen worden. Die Knochen sollte erscheinen weiß und es sollte eine große visuelle Pellet in dem größeren Rohr sein.
6. Entsorgen Sie die 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit den Knochen.
7. Hängen Sie das Knochenmark in geeigneten Lösung (zB PBS, Kulturmedien, FACS - Puffer) und fahren Sie mit experimentellen Protokoll (DNA, RNA oder Proteinisolierung,FACS-Analyse oder primäre Zellkultur).

Ergebnisse

Das hier beschriebene Protokoll ist für eine schnelle Präparation der Maus Femur und Tibia mit einem Minimum an Beschädigung des Knochengewebes optimiert. Diese Technik ist für eine Anzahl von Downstream - Analysen geeignet, einschließlich Biomechanik Studien Histomorphometrie (1A - B) und Histologie (1C) ^4,7. Der Vertreter histomophometric micoCT 3D - Rekonstruktion (1A - B) zeigt , dass sowohl die Spongiosa und kortikalen Schale aufrechterhalten werden, die für eine genaue Quantifizierung der standardisierten Strukturparameter für Knochenhistomorphometrie ermöglicht, einschließlich trabekulären Anzahl, Dicke und Beabstandung; Knochenvolumen; und kortikalen Dicke unter anderem Maßnahmen ^8. Der Vertreter histologischen Schnitt zeigt eine H & E - gefärbten Formalin-fixierten und entkalkt Tibia (1C). Das Bild zeigt die Integrität sowohl des verkalkten bein und zelluläre Knochenmark für die histologische Analyse.

Das Knochenmark Isolierungsverfahren bewahrt die Sterilität des Knochenmarks Raum, hat eine geringe Handhabung Kontamination zu reduzieren, und nicht das Schneiden des langen Knochens erfordert, wodurch Verlust von Knochenmark-Ausbeute. Das Knochenmark ist geeignet für viele Downstream - Anwendungen, einschließlich Durchflusszytometrie ⁵ und PCR - Analysen. Darüber hinaus kann dieses Verfahren verwendet werden , um Knochenmark für die primäre Zellkultur von Knochenmarkzellen zu isolieren, einschließlich der Osteoklasten und Osteoblasten (2A - B) ^4,6.

Abbildung 1. Histomorphologische und histologische Analysen der Maus langen Knochen. Dreidimensionale microCT Rekonstruktion einer Maus Tibia (A) , um die äußere Rindenschale zeigt und (B trong>) Spongiosa (Maßstab = 0,5 mm). (C) Histologische H & E-Färbung eines entkalkt und schnittene Tibia (4x). Bilder mit freundlicher Genehmigung von Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Primäre Knochenmarkzellkultur für die Differenzierung von Osteoklasten und Osteoblasten. (A) TRAP - Färbung für mehrkernige Osteoklasten nach 7 Tagen in osteoclastogenic Medien (4x). (B) Die alkalische Phosphatase (violette Farbe) für Osteoblasten und Alizarin rot (rote Farbe) Fleck für die Mineralisierung nach 21 Tagen in osteogenen Medien. Bilder mit freundlicher Genehmigung von Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA.iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Wir stellen eine einfache und effiziente Methode zur Entnahme von langen Knochen der Maus und der anschließenden Knochenmarkisolierung vor. Diese Methode erhält die hohe strukturelle und zelluläre Integrität der Knochen und des Knochenmarks und hat eine geringe Bearbeitungszeit, wodurch die Wahrscheinlichkeit von benutzerinduzierten Frakturen oder Knochenbewertungen, die nachgelagerte Analysen beeinflussen können, minimiert wird. Darüber hinaus erfordert die Zentrifugationsmethode zur Isolierung des Knochenmarks kein Schneiden des Knochenmarks, um den Knochenmarkraum freizulegen, oder Flüssigkeit, um das Knochenmark zu spülen, wodurch potenzielle Kontaminationspunkte reduziert werden. Darüber hinaus hat die Zentrifugentechnik einen relativ hohen Durchsatz mit geringerem Arbeitsaufwand als andere Methoden, wodurch die Verarbeitungszeit verkürzt wird.

Eine hohe Variation ist In-vivo-Mausstudien aufgrund der hohen phänotypischen Variation von Maus zu Maus inhärent. Um den Forschungseffekt teurer und arbeitsintensiver Mausstudien zu maximieren, ist es entscheidend, technische experimentelle Fehler zu minimieren^9,10. Die Zeit von der Tiertötung bis zur nachgelagerten Analyse oder Gewebefixierung führt zu experimentellen Variationen, die subtile Veränderungen überwinden und große Unterschiede zwischen den Gruppen verringern können. Daher ist eine schnelle Verarbeitung der Proben für eine genaue Datenanalyse unerlässlich. Die hier beschriebenen Techniken zur Dissektion langer Knochenknochen und zur Isolierung des Knochenmarks sind für die schnelle Verarbeitung von Tieren und Proben optimiert, um technische Abweichungen zu reduzieren.

Dieses Protokoll kann in vielen Forschungsbereichen angewendet werden, einschließlich der Untersuchung des Knochengewebes selbst oder der Befragung der Zellen des Knochenmarks. Darüber hinaus wird dieser unkomplizierte Ansatz zur Dissektion langer Knochen es Forschern in verwandten Bereichen ermöglichen, Knochenbeiträge direkt zu befragen, um unser Wissen über Knochenmarkfunktionsstörungen bei bisher wenig untersuchten Pathologien zu erweitern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Pinboard
Pins
70% Ethanol
Dissektionschere
Präparierzange
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
16 G Nadel
1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen
0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen Mikrozentrifuge