Introduction
Planter er mye brukt til å produsere mat varer som fruktjuicer, men de kan også utvikles som plattformer for produksjon av høyere verdi biofarmasøytisk produkter 1-3. I begge tilfeller nedstrømsprosessering (DSP) begynner ofte med utvinning av væsker fra vev som blader eller frukter, etterfulgt av rensing av partikkelladede ekstrakter 4,5. For fremstilling av Biopharmaceuticals, kan kostnadene ved DSP utgjøre opptil 80% av de totale produksjonskostnadene 6,7, og dette delvis skyldes den høye partikkelbelastningen til stede i ekstrakter fremstilt av forstyrrende metoder så som blad-baserte homogenisering 8,9 . Selv om rasjonelt valg av filterlag som passer til partikkelstørrelsesfordelingen i ekstraktet kan øke filterkapasiteten og redusere kostnadene 10,11, kan forbedringen aldri overstige taket av absolutt kapasitet definert av antall partikler som må bibeholdes perenhet av filterområdet for å oppnå avklaring.
Taket kan løftes hvis færre partikler nå overflaten av de fineste filtrene i filtrerings toget, og dette kan oppnås hvis dispergerte partikler blandes med polymerer som er kjent som flokkuleringsmidler som fremmer aggregering for å danne store fnokker 12. Slike fnokker kan beholdes lenger oppstrøms av grovere og mindre kostbare posefiltre, redusere partikkelbelastningen nå finere og mer kostbare dybdefiltre. Polymerene skal ha sikkerhetsprofil som passer for sine applikasjoner, for eksempel for Biopharmaceuticals de må være i samsvar med god framstillingspraksis (GMP), og vanligvis de må ha en molekylvekt> 100 kDa og kan enten være nøytral eller belastes 13. Mens nøytrale flocculants generelt opptre ved kryssbinding spredt partikler forårsaker deres aggregering og dannelsen av flokker med diameter> 1 mm 11, ladede polymerer nøytralisere ansvaret for dispersed partikler, noe som reduserer deres løselighet og dermed forårsaker utfelling 14.
Flokkulering kan forbedres ved å justere parametere som buffer pH eller ledningsevne, og polymeren type eller konsentrasjon, for å samsvare med egenskapene til ekstraktet 15,16. For tobakkekstrakter forbehandlet med 0,5-5,0 g L -1 polyetylenimin (PEI), større enn 2 ganger økning i dybdefilter kapasitet ble rapportert i en 100 L pilot-skala prosess. Kostnaden for denne polymer er mindre enn € 10 kg -1 så sin innføring i prosessen resulterte i kostnadsbesparelser på rundt € 6000 for filtre og forbruksvarer per batch 16 eller enda mer når den kombineres med cellulosebasert filter hjelpemidler 17. Likevel er prediktive modeller nødvendig for å evaluere en priori økonomiske fordelene av flokkuleringsmidler fordi deres inkludering kan kreve hold trinn på 15-30 min 16,18, noe som resulterer i ytterligere investeringskostnader for lagringtanker. Men det er ikke mekanistiske modeller som kan forutsi utfallet av slike eksperimenter på grunn av den komplekse natur flokkulering. Derfor ble en mer hensiktsmessig utforming-av-eksperimenter (DoE) tilnærming 19 utviklet som beskrevet i denne artikkelen. En protokoll for den generelle DoE prosedyren har nylig blitt publisert 20.
Småskala enheter er nå tilgjengelig for high-throughput screening av flokkulering forhold 21. Imidlertid kan disse anordninger ikke realistisk å simulere forholdene under flokkulering av plante-ekstrakter fordi dimensjonene på reaksjonsbeholderen (~ 7 mm til brønnene på en 96-brønns plate), og partiklene eller fnokkene kan være mindre enn en størrelsesorden fra hverandre. Dette kan påvirke blande mønstre og dermed prediktiv kraft av modellen. Videre kan det være vanskelig å skalere ned prosesser som involverer utfelling som skyldes ikke-lineære endringer i blande oppførsel og bunnfallet staheten 22. Derfor skisserer denne artikkelen en benk-top-skala screening system med en gjennomstrømning på 50-75 prøver per dag, noe som gir resultater som er skalerbar fra den innledende 20 ml reaksjonsvolum til en 100 L pilot-skala prosess 16. Når det kombineres med en DoE tilnærming, gjør dette at prediktive modeller som skal brukes til prosessoptimalisering og dokumentasjon som en del av en kvalitet-for-designkonsept.
Metoden er beskrevet nedenfor, kan også tilpasses Biopharmaceuticals produsert i cellekultur-baserte prosesser, hvor flokkuleringsmidler også vurderes som et kostnadsbesparende verktøy 23. Den kan også brukes til å modellere utfelling av target-proteiner fra et urent ekstrakt som en del av en rensestrategi, som vist for β-glukuronidase produsert i raps, mais og soyabønner 24,25. En detaljert beskrivelse av flokkuleringsmiddel egenskaper kan finnes andre steder 16,26, og det er viktig å sikre at polymeren konsentrasjonersjoner er enten ikke-toksiske eller skadelige nivåer under i det endelige produkt 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utvikle en Tilstrekkelig Experimental Strategy
- Identifiser de miljømessige og prosessparametre som er relevante for flokkulering prosedyre skal etableres eller optimalisert, det vil si hvilke faktorer har sterkest effekt på flokkulering. Vanligvis er det flere slike parametere så en DOE metode som nylig beskrevet 20 er nødvendig på grunn av mangel på mekanistiske modeller.
- Velg parametere (faktorer) basert på litteraturdata 12, tidligere kunnskap og erfaring med systemet. Typiske faktorer inkluderer buffer pH, buffer ledningsevne, inkubasjonstid og temperatur, så vel som type polymer og konsentrasjon 15,16,27.
- Bruk de samme referansene (se 1.1) for å definere meningsfulle områder for hver numerisk faktor og nivåer for kategoriske faktorer.
- Definere de eksperimentelle resultatene (responser) som skal overvåkes og brukes til å evaluere effektiviteten av flokkulering. Avhengig av systemet, dennekan være filtrat eller supernatanten turbiditet, settling hastighet, samlet størrelse eller kapasiteten til en etterfølgende filter 16,23,28-30.
- Sikre analysene brukes til å måle responsen er kvantitative, robust og repeterbar / reproduserbare, slik at de resulterende data av høy kvalitet kan utvides med eksperimenter utført senere, eller av en annen operatør.
- Velg en DoE typen suiting rekke faktorer for å bli undersøkt, og graden av kunnskap som allerede er samlet om systemet. Bruk tilgjengelig litteratur for å identifisere en passende DoE typen 20.
- Velge en screening utforming dersom det er lite informasjon om flokkulering system som skal undersøkes, et stort antall parametre skal skjermes eller lite er kjent om meningsfulle områder for parameterne. Typiske screening design er full og delvis faktorielle design. Omfatte midtpunktene i utformingen dersom parametrene forventes å ha en ikke-lineær effekt, f.eks 19.
- Velg et svar overflate metodikk (RSM), for eksempel sentrale kompositt design (CCD) 31 eller optimal 32,33, hvis bare noen få faktorer med kjente områder må være preget presist.
- Sett opp DoE med egnet programvare for å sikre a priori kvalitetskriterier som brøkdel av design plass er oppfylt 20.
2. Forbered flokkulering Eksperimenter
Figur 1: Plant ekstrakt flokkulering arbeidsflyt: prosess skala (til venstre) og stasjonære maskiner skala (til høyre). Etter protein ekstraksjon med vandige buffere, er dispergert partikler av cellerester aggregeres ved tilsetning av flokkuleringsmidler. Aggregatene blir deretter fjernet ved en kaskade av pose og dybdefiltrering og kapasiteten på dissefiltre sammen med filtratet turbidities kan brukes direkte til å måle effektiviteten av flokkulering.
- Utvikle et generelt eksperimentelt arbeid Flow (figur 1).
- Bruke en uttrekkingsinnretning som resulterer i det samme partikkelstørrelsesfordeling forventet (eller allerede observert) ved den endelige anvendelse skala, for eksempel en spesialisert homogenisator. Hvis det er mulig, å utforme en skala-modell ned av ekstraktoren som beskrevet for homogenisering av tobakksblader 10.
- Definer ekstrakt volumene brukes under flokkulering eksperimenter (her 20 ml). Velge et volum som gjør at et representativt antall partikler som er til stede i reaksjonsbeholderen, for eksempel flokkulering eksperimenter i 20 ml porsjoner ga reproduserbare og skalerbare resultater for tobakkekstrakter inneholdende ~ 7% [w / v] faste stoffer 34 og partikkelstørrelser på ~ 0.5 um til ~ 3 mm 16.
- Designe overvåking og post-flokkulering operasjoner slik at they er representative for den endelige anvendelse skala, for eksempel ved å velge filtre med samme partikkelretensjon virkemåte som de som benyttes ved produksjonsskala.
- Dyrke planter som de Ekstrakter vil bli utledet.
- Bruk den samme planten linje, her tobakksplante cv. Petit Havana SR1, og dyrkningsbetingelser som skal brukes i løpet av produksjonen som tidligere beskrevet 33.
- Hvis andre råstoffer vil bli behandlet, forberede disse råstoff slik at de er representative for den endelige søknaden skala, for eksempel bruke autentiske buffere, ta hensyn til eventuelle utvannings trinn i prosessen, og holde seg til den forventede pH og konduktivitet, her pH 7,5 og ledningsevne 30 ms cm -1.
- Forbered Filtrering Utilities, turbiditet-overvåkningsutstyr og prøvetaking fartøy.
- Skjær filtermaterialene til ønsket størrelser, her 15 x 15 cm 2, hvis de ikke er klare til osse moduler. Sørg for at alle overvåking og analyse enheter er funksjonelle og merke alle prøverør.
- Selv om disse er enkle oppgaver, forberede disse elementene i tid for å sikre at de ikke vil føre til avbrudd i løpet av de faktiske flokkulering eksperimenter. Unngå forsinkelser fordi de kan påvirke resultatene gitt at flokkulering er en tidsavhengig prosess.
- Forbered Flocculant Stock Solutions. FORSIKTIG: Bruk egnet personlig verneutstyr ved håndtering av flokkuleringsmidler, f.eks hansker. Materialene kan være farlige (advarselsskilt i henhold til Europa UE 67/548 / EØF og 1999/45 / CE inkluderer N, Xi eller Xn). Unngå støv og henviser til sikkerhetsdatablad. Arbeid under en avtrekkshette.
- Velg et lager konsentrasjon for hver flokkuleringsmiddel, her 80,0 g L -1 for de to PEI flocculants som ble brukt. Velg konsentrasjoner så høyt som mulig for å unngå prøvefortynning når du legger flokkuleringsmiddelet, noe som vil redusere partikkel konsensjon og dermed påvirke Flokkulasjonseffektiviteten.
- Står for en hvilken som helst forhånds fortynning som gjenspeiler produsentens formulering av polymeren, for eksempel dersom polymeren allerede er tilført som en vandig 50% [w / v] løsning. Flokkuleringsmiddel lager oppløsninger av 4-8% [w / v] ble funnet å være den mest egnede hittil.
- Med tanke på de punktene som er omtalt ovenfor, sørg flokkuleringsmiddelet konsentrasjonen ikke genererer en svært tyktflytende løsning som hemmer pipettering, potensielt forårsake feil fordi den endelige flokkuleringsmiddelet konsentrasjonen ikke er riktig justert.
- Bruk samme lager konsentrasjon for alle flocculants hvis det er mulig, fordi dette vil forenkle oppsettet av en pipettering ordning (2,5) og dermed redusere sannsynligheten for feil.
- Juster pH og ledningsevne av hver flokkuleringsmiddelet stamløsning for å matche betingelsene for uttrekk, her pH 4-10 og ledningsevne 15-55 mS cm -1. Forbered enkeltaksjer for en enkelt flokkuleringsmiddel hvis mmalm enn ett sett av pH og / eller ledningsevnen betingelser blir testet for denne polymer.
- Forbered flokkuleringsmiddel stamløsninger fersk, ikke lenger enn 48 timer før bruk. Selv om flokkulering kan induseres med polymer lager er lagret i mer enn 4 uker, kan effektiviteten avta på grunn av polymerhydrolyse ved høye eller lave pH-verdier. Se produsentens dokumentasjon for ytterligere detaljer.
- Sørg for at de valgte for DoE parametrene kan justeres nøyaktig for hver prøve under forsøket, f.eks at det ikke er oppvarming / nedkjøling bad tilgjengelig for å justere rugetemperatur, her 4 ° C, 20 ° C og 37 ° C. Ved å blande under flokkuleringen er en del av forsøket, at blandeinnretningen er representativ for den endelige anvendelse skala i form av kritiske parametre slik som inngangseffekt.
- Konverter DoE Schedule inn en Pipettering Scheme.
- Konverter forskjellige flokkuleringsmiddel konsentrasjoner å være tested inn volumer av stamløsning som vil bli lagt til avtrekksprøver: dele den endelige flokkuleringsmiddel konsentrasjoner av aksje konsentrasjon og multipliser med prøvevolumet brukes i flokkulering eksperimenter. Identifisere den største resulterende sluttvolumet, for eksempel hvis 20 ml av prøven blandes med et maksimum på 2 ml flokkuleringsmiddel stamoppløsning av dette vil bli 22 ml.
- Beregn volum av buffer for å opprettholde det samme sluttvolum på alle flokkulering alikvoter basert på det største volum av flokkuleringsmiddel lager som skal tilsettes, for eksempel dersom 0,75 ml av flokkuleringsmiddel lager må tilsettes til en prøve og deretter 1,25 ml av buffer er nødvendig for å opprettholde endelig prøvevolum på 22 ml (2.5.1).
- Oppsummere volum av flokkuleringsmiddel stamløsning for hver polymer og flokkulering stand til å beregne den absolutte volum av stamløsning som er nødvendig for DOE.
- Slakte tobakk blader og Klargjør Extract.
- Fjern de seks øverste leaves (eller så mange som indikert av i prosess instruksjoner) fra tobakksplanter i en passende alder, for eksempel 6 uker gammel, og overføring til en passende utvinning enhet, for eksempel en homogenisator eller skrue trykk.
- Legge til tre volum av ekstraksjonsbuffer per gram biomasse, for eksempel 300 ml per 100 g, og bland i 8 min.
- Fremstille de enkelte ekstrakter med de passende buffere hvis denne er forskjellig pH og / eller ledningsevner blir testet. Her innebærer dette homogenisering av plantemateriale for 3 x 30 sek i en blender eller en juicer 34.
- Alternativt kan forberede ekstraktet på en måte som er representativ for den prosess som undersøkes.
- Delmengde Extract og Tilsett Buffer.
- Manuelt og grundig røring av ekstraktet under hele prosedyren for å sikre at prøvene er homogene med en jevn fordeling av partiklene.
- Nettopp fordele ekstraktet blant de pre-merkede reaksjonsrørene ved dekantering,her 20 ml i hvert fartøy. Frittstående 50 ml rør forenkle håndtering og er ideelle for 20 ml prøver.
- Tilsett volumet av hver utvinning buffer som kreves for å opprettholde det faste sluttvolumet for hver enkelt reaksjon rør ved hjelp av en passende pipette.
3. flocculate den planteekstrakter med ulike Polymers
- Pipette det nødvendige volum av flokkuleringsmiddel stamløsning, her 0,1-2,0 ml, til prøvene sekvensielt som indikert ved den randomiserte løp rekkefølgen av DOE. Bland hver prøve umiddelbart etter tilsetningen av flokkuleringsmiddel ved intens manuell risting i nøyaktig 20 sekunder.
- Om nødvendig, juster risting tid til andre fôr aksjer for å sikre grundig blanding, men strengt sikre konsistente blandetider for alle prøver. Husk at langvarig blanding kan føre til irreversible avbrudd i flokker og inkonsekvent påført kraft under risting kan forvrenge flokkulering resultater.
- Valgfritt: Endre fremgangsmåten beskrevet ovenfor for samtidig påføring av to eller flere flokkuleringsmidler.
- Alternativ 1: I stedet for en enkelt polymer legge en blanding av to eller flere flokkuleringsmidler, her PEI og kitosan. Bruk flokkuleringsmiddel kombinasjoner definert i DoE. Innlemme forholdet og absolutte konsentrasjoner av polymerer som enkelte parametre i løpet av DoE oppsett (1.1).
- Alternativ 2: Legg to eller flere polymerer sekvensielt til ekstraktet.
- Bruk de enkelte polymerkonsentrasjoner, deres type, og inkubasjonstiden mellom hver tillegg til ekstrakt, som flere faktorer i løpet av DoE oppsettet.
- Bruk også denne fremgangsmåten for å teste om den gjentatte tilsetning av en enkelt polymer kan forbedre flokkulering. Bruke en trinnvis tilsetning for å simulere langsom tilsetning av et flokkuleringsmiddel, for eksempel fire trinn, kan hver tilsetning av 0,25 ml 80 g L -1 flokkuleringsmiddel lager til et 20 ml volum over 4 min ligne tilsetningen av flokkuleringsmiddel meden strømningshastighet på 0,25 ml min-1.
- I alle tilfeller, identifisere et nytt maksimum endelig prøvevolum for dette oppsettet ved å legge de maksimale volum av alle flokkuleringsmidler til prøvevolumet, er her still 22 ml, og beregne de nødvendige volumer av flokkuleringsmiddel stamløsninger og buffere for volumjustering om nødvendig.
- Inkuber prøvene i de tidsrom som er definert i DOE, typisk 3-30 minutter, for å tillate at flokkedannelsen. Sørg for at alle andre inkubasjonsforhold, for eksempel temperatur, er angitt i henhold til DoE.
- Observere og dokumentere Floc formasjon. Spill fremdriften av flokkedannelsen etter behov, for eksempel som mm av flokkulat settling per minutt ved å måle høyden på de avsatte faststoffer. Hvis det er nødvendig, forlenge flokkulering i en lengre tidsperiode, for eksempel over natten.
- Filtrer flokkulert Extract.
- Bruk filter materiale som er utarbeidet tidligere (2,3) for å avklare flokkulerte ekstrakt etter den aktuelleinkubasjonstid ved dekantering av den flokkulerte prøvene gjennom filtermaterialet og inn i en ren beholder eller reaksjonsrør.
- Ikke re-suspendere de sediment flokkulater før filtrering og ved en hastighet på ~ 300 anvendelse av ekstrakten med ml min-1 til filteret, som svarer til 3-4 sekunder for en 20 ml prøve.
- Bekrefte utførelsen av filtreringstrinnet hvis et annet materiale som er benyttet i benk-topp eksperimenter sammenlignet med den endelige prosessen i form av partikkelansamlinger, for eksempel ved å måle partikkelstørrelsesfordelingen i begge prøvetyper 11.
- Analyser filtratet i form av turbiditet og / eller partikkelstørrelsesfordeling som kreves ved bruk av egnede enheter, for eksempel en turbidimeter.
- Valgfritt: gjenta analysen etter lengre inkubasjonstid, for eksempel 12-24 timer, for å undersøke dannelsen eller reformasjon av ustabile flokker.
- Bruk filter materiale som er utarbeidet tidligere (2,3) for å avklare flokkulerte ekstrakt etter den aktuelleinkubasjonstid ved dekantering av den flokkulerte prøvene gjennom filtermaterialet og inn i en ren beholder eller reaksjonsrør.
- Analysere prøvene i forhold til Pre-definerte Responses (1.1.3).
- Ta prøver fra filtratene og analysere dem for flere responsparametre, for eksempel konsentrasjonene av forskjellige målproteiner eller verdifulle produkter.
- Valgfritt: analysere supernatanten (for det meste faste stoffer) for de samme parametrene for å lukke massebalansen i prosessen. Spesielt kvantifisere effekten av flokkuleringsmidler på væskeutvinningen ved å sammenlikne de faststoffmasse som blir igjen etter prøvene blir behandlet eller ikke behandlet med flokkuleringsmiddel.
- Bekreft datakvalitet og overføre resultatene til DoE programvare.
- Se etter ekstremverdier i de innsamlede responsdata, for eksempel uventet høye verdier.
- Sørg for at alle svardata er riktig justert med tilhørende eksperimentelle forhold.
- Overføre resultatene til DoE programvare og sørge for at de vanlige og randomiserte sikt bestillinger blir ikke blandet sammen.
4. EvaluereDoE
- Bruk verktøy av DoE programvare innebygde dataanalyse for å utvikle en prediktiv modell som tidligere beskrevet 20.
- Velg en passende datatransformasjon modus hvis det er nødvendig å legge til rette for modellbygging, her log 10. Et forhold større enn 10 for nettsted vs. minste reaksjon verdi angir at en datatransformasjon kan være nødvendig. Identifisere den mest passende transformasjon bruke de riktige statistiske verktøy, for eksempel en boks-Cox tomt 35.
- Valgte en grunnmodell som (i) passer til den valgte DoE (1,2) og (ii) er enig med tidligere kunnskap om systemet under etterforskning basert på analyse av varians (ANOVA) verktøy av DoE programvare, for eksempel en andre polynomet ofte passer bedre til den observerte effekten av inkubasjonstid enn en første-ordens polynom.
- Fjern ubetydelige modell faktorer, for eksempel p> 0,05, eller faktor interaksjoner iterativt ved å fjerne dem,reby redusere modellen kompleksitet og øke sin prediktiv kraft.
- Bekreft modellkvalitet ved å sammenligne R2, justert R2 og spådd R2 sammen med normal sannsynlighetsplott av studentisert residual, rest-vs-run, spådde-vs-aktuelle og Box-Cox plotter 36. Alle R 2 verdier bør være innenfor en 0,2 rekkevidde.
- Pass på at den endelige modellen er enig med grunnleggende forutsetninger for fysikk og termodynamikk, f.eks ingen negative konsentrasjoner spådd.
- Bruke modellen til å forutsi forhold som er mest gunstig for systemet under etterforskning, her en lav turbiditet.
- Velg de viktigste svarene og deres foretrukne tilstander, for eksempel minimal turbiditet. Kombiner disse valgene ved å maksimere en ønskelig funksjon eller lignende verktøy, som er innebygd i funksjoner av flere DoE programvarepakker 36.
- Avhengig av den påtenkte anvendelse of modellen, velger bekreftelse går for å verifisere de optimale forhold og / eller prediktiv kraft av modellen generelt, for eksempel hvis forholdene spådd å være mest gunstig var ikke en del av den opprinnelige DoE velg som oppfølging eksperimenter.
5. Forbedre Modell og Kontroller Predictive Strøm
- Begrens den innledende design plass til de mest attraktive driftsforholdene, for eksempel lav turbiditet i 0-1,000 nefelometriske turbiditetsenheter (NTU) rekkevidde, basert på modellprediksjoner (4,2).
- Sett opp en ny DoE innenfor disse områdene, inkludert bare de faktorene som har blitt identifisert som viktig eller relevant (4.1.2)).
MERK: En faktor kan være betydelig i form av modellanalyse, men irrelevant for en prosess, dvs. dens effekt på et svar er <1% sammenlignet med andre faktorer. - Gjenta trinn 1 til 5,2 til kvaliteten på modellprediksjoner matcher requirements, for eksempel standardavviket for den modell som indikert ved programvare er tilstrekkelig for den tiltenkte anvendelse. Endre eksperimentell strategi hvis det er nødvendig for disse gjentakelser, f.eks bare bruke ett flokkuleringsmiddel i raffinement.
- Overfør og bekrefte resultatene fra skala-down modellen i pilotskala eller endelig produksjon skala.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flokkulering av tobakk ekstrakt med forskjellige polymerer
Fremgangsmåten beskrevet ovenfor ble med hell anvendt for å utvikle en fremgangsmåte for flokkulering av tobakkekstrakter under fremstillingen av et monoklonalt antistoff (HIV-nøytraliserende antistoff 2G12) og et fluorescerende protein (DsRed) (figur 1) 16, og har siden blitt overført til andre proteiner, inkludert lektiner, malaria vaksinekandidater og fusjonsproteiner (upubliserte data). Typisk er anvendelsen av flokkuleringsmidler redusert turbiditet av posen filtrert planteekstrakt fra ~ 6000 NTU (10 000 NTU etter ekstraksjon) til ~ 1000 NTU. I en innledende screening eksperimentet ble en 91-run IV-optimal design brukes til å teste 18 forskjellige polymerer i tre forskjellige konsentrasjoner (fordi denne faktoren påvirker Flokkulasjonseffektiviteten 13,27) og observerte flokkulering over en ~ 12 timers inkubasjon period (figur 2A og B). Den lange inkubasjonstiden kan være viktig å identifisere meningsfylte tidsrammer for flokkulering prosessen. Også pH-verdier på 4-8, ble testet fordi disse kan være relevant i fremtidige prosesser på grunn av egenskapene til bestemte målproteiner 13,25,27,37. Blant de 18 testede polymerer, seks ble funnet å redusere ekstrakt turbiditet etter pose filtrering i typiske ekstrakter med en ledningsevne på 25 mS cm -1.
Modellen ble raffinert ved å utelate alle ineffektive polymerer i to iterasjoner og deretter inkludert ekstra prosessparametere, slik som ledningsevne i 15-45 mS cm -1 rekkevidde, en inkubasjonstid på 5-75 minutter og en temperatur på 4-30 ° C, å generere modeller som er egnet for et bredere spekter av prosessbetingelser. Den prediktive kraft av modellen økte etter hver iterasjon, noe som resulterer i en svært pålitelig modell (Figur 3A). >
Etter fire iterasjoner, ble den sterkt ladet kationisk og forgrenede polymeren PEI funnet å være de mest effektive for aggregering av dispergerte partikler i tobakkekstrakter. Imidlertid er effektiviteten av denne polymer ble redusert med økende ekstrakt ledningsevne. Eiendommene molekyl størrelse, kostnad, struktur (forgrenet eller lineær), lade tetthet og grad av amin substitusjon (primær, sekundær, tertiær eller kvartær) ble testet som faktorer i en DoE og de to siste parametrene hadde størst effekt. Detaljene er beskrevet annet sted 16. Basert på denne kunnskapen av polymeregenskaper fra DOE resultatene ble fem andre polymerer valgt med molekylære egenskaper som ligner på PEI (ladningstetthet> meq g -1 og kvartære amin). En av disse fem polymerer vist større Flokkulasjonseffektiviteten ved høyere ledningsevne (Figur 3B) 11.
nt. "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Som en del av DoE tilnærming, ble det bekreftet at ingen av PEIS påvirket produktet utvinning under noen av de testede forholdene Faktisk kapasitet på dybdefiltre brukes senere til fjerne gjenværende dispergerte faststoffer økt med en faktor på 3.2 til 5.7, og nådde ~ 110 L m -2, avhengig av filtertype. Disse resultater ble også bekreftet i en 100 L pilot-skala fremgangsmåte, i hvilken for anvendelsen av flokkuleringsmidler redusert klaring -relaterte produksjonskostnader med> 50% og de totale produksjonskostnader med ~ 20%.
Figur 2: Effektiviteten av forskjellige flokkuleringsmidler under forskjellige prosessbetingelser (A). Pakk prøvene direkte etter flokkulering og bag filtrering kan fortsatt dukke opp grumset. (B) Etter settling i flere timer, turbiditeten avsamme prøver kan reduseres betydelig. Men turbiditet verdier hentet umiddelbart etter filtrering er ofte å foretrekke fordi utvidede hold ganger ikke kan være mulig i storskala produksjonsprosesser. (C) Flokkulering er også effektiv når den brukes til planteekstrakter som er generert med en skruepresse i stedet for en blender som antydet ved den klare rød væske ved bunnen av de 50 ml rør (den røde fargen er på grunn av tilstedeværelsen av det fluorescerende protein DsRed ). (D) blandinger av forskjellige flokkuleringsmidler kan også indusere flokkulering.
Fig. 3: Modeling flokkulering ved hjelp av et DOE metode (A) Nøyaktigheten av modellen forutsigelser økte etter hvert som antall av polymerer i modellen ble redusert fra initiale screening for avgrensning selv om antallet prosessparametre økte fra two til fem. (B) Skifte av polymertype (her fra en PEI til en annen) som følge av en endring i prosessparametre (her ledningsevne) opprettholder effektiv partikkel-flokkulering og tilsvarende lavt filtrat-uklarhet i forhold til ikke-behandlede kontrollekstrakt (fast rød linje). Feilfelt i A og B viser standardavvik modellprediksjoner. Stiplede røde linjene indikerer standardavvik av den ikke-behandlede ekstrakt (n = 10). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Flokkulering av tobakk trekker forberedt med en skrue-pressen
Flokkulering resultater ble også overført fra tobakkekstrakter tilberedt med en homogenisator til de forberedt med en skrue-pressen, som genererte færre spredte partikler i mm størrelsesområdet, men merpartikler i mikrometer størrelse. I et 29-run IV-optimal design, ble det vist at PEI er også effektiv for denne type av ekstraktet i et lignende konsentrasjonsområde, og at gjenvinningen av målproteinene er ikke påvirket (figur 2C). Dette viser (i) er den klumpdannelsesbetingelser som er identifisert for en type råstoff kan være til en viss grad overføres til andre råstoffer, noe som sparer tid under prosessutvikling, og (ii) at DOE strategi kan anvendes for å bekrefte dette overførbarhet ikke bare for enkelte prosess forhold, men over hele design plass.
Flokkulering eksperimenter med flokkuleringsmiddel blandinger
Kombinasjoner av flokkuleringsmidler kan være mer effektivt enn enkelt polymerer, for eksempel på grunn mer forbedret bygge bro mellom partikler 12. Derfor er metoden som er beskrevet ovenfor, ble tilpasset for å imøtekomme tilsetning av to polymerer (3.2) 26. Tre ikke-syntetiske polymerer ble testet alene, i kombinasjon med hverandre eller i kombinasjon med PEI. Den mest effektive flokkulering av tobakkekstrakter ble oppnådd med PEI alene, men en kombinasjon av PEI og kitosan eller polyfosfater kan redusere konsentrasjonen av PEI er nødvendig. Videre DoE tilnærming tillot oss å identifisere de mest effektive polymerkombinasjoner når utelate PEI (med eller uten kitosan og polyfosfater), og dermed bidra til å definere optimale flokkulering forhold i prosesser hvor PEI er uforenlig med målet protein, f.eks på grunn av nedbør, som rapportert for βglucuronidase 24,25. Videre DoE var i stand til å karakterisere en komplisert utforming plass hvor det ikke mekanistisk modell var tilgjengelig (figur 2D). Ved hjelp av ANOVA verktøy av DoE programvaren var det mulig å skille mellom pålitelige prognosemodeller og dårlig evaluert kolleger (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det viktigste å vurdere når du setter opp en DoE å karakterisere partikkel flokkulering er at design skal i prinsippet kunne oppdage og beskrive forventede eller mulige effekter 36,38, f.eks påvirkning av pH, polymertype og polymerkonsentrasjon 16. Derfor er det viktig å evaluere brøkdel av design plass (FDS) før de egentlige eksperimenter. FDS er den brøkdel av det flerdimensjonale eksperimentelle plass (dekket av konstruksjonsfaktorer, for eksempel pH) innenfor hvilken det er mulig å påvise forhåndsdefinerte forskjellene mellom to eksperimentelle resultater gitt et system av kjent variasjon, for eksempel påvisning av en forskjell i turbiditet på 250 NTU gitt en variasjon av 125 NTU. FDS kan økes ved å øke den utforming med flere løp, og bør ≥0.95 for utførelser som er beregnet til å lede prosesskontroll 36. Videre, hvis antall kjører ikke tillater than hele eksperiment utføres på en enkelt dag, blokkene bør være forhåndsdefinert i DOE å gjøre rede for batch-til-batch og dag-til-dag variabilitet. Når man arbeider med plantemateriale, løper inkludering av referanse i hver blokk (for eksempel ikke-behandlede kontroller) bidrar til å kompensere for variasjon, slik at sammenligning av data fra flere kjøringer hver normalisert til deres tilsvarende referansedrevet. I denne sammenheng, å øke antall gjentatte forsøk i DOE er også nyttig.
Når et stort antall polymerer er vist, er det tilrådelig å bruke de individuelle egenskaper av flokkuleringsmidler, f.eks ladningstetthet og molekylmassen, som adskilte numeriske faktorene i stedet for polymerene i seg selv som kategoriske faktorer. Dette reduserer antall eksperimenter fordi eksperimentelle design ofte trenger å bli replikert for kategoriske faktorer, mens flere nivåer med numeriske faktorer trenger bare et lite antall ekstra runs. Informasjonen contelt av forsøket øker også, og muliggjør identifikasjon av polymeregenskaper som gir bedre flokkulering, for eksempel en høy ladningstetthet som finnes i eksperimentene som beskrives her. CCD og RSM eksperimentell design er nyttig å etablere modeller med høy prediktiv kraft, slik at identifisering av robuste prosessbetingelser (for eksempel for å lede prosesskontroll), og brukes vanligvis til å følge opp screening design. Hvis antall faktorer og forhold nivåer under undersøkelsesresultater i DOE med mer enn 400 individuelle eksperimenter, kan det være tilrådelig å redusere antallet av faktornivåer eller bytte til andre konstruksjonstyper fordi antallet av prøven som lett kan håndteres med teknikken presenteres her er begrenset til ~ 100 per dag.
Fra et eksperimentelt synspunkt, må polymerene være stabil under de valgte forsøksbetingelser, f.eks de ikke må depolymerisere ved lav pH. Forsiktig fremstilling av flokkuleringsmiddelaksjer i form av konsentrasjon er også nødvendig for å oppnå reproduserbare resultater og høy kvalitet modeller. I denne sammenheng kan flokkuleringsmiddelet må være forbehandlet, f.eks hevelse ganger eller pH-justering for kitin, for å sikre fullstendig oppløsning, og således å oppnå en homogen løsning. Høyviskøse aksjer bør unngås fordi dette kan føre til pipettering feil ved overføring av polymeren til ekstrakt. Mange polymerer kan ha en sterk buffereffekt og bestanden har ekstreme pH-verdier, for eksempel pH ~ 9,5 til 8% [w / v] PEI. Dette kan påvirke pH i ekstraktet hvis stokken ikke er forhåndsjustert og vil forvrenge de eksperimentelle resultatene. For eksempel, hvis flokkuleringen er mer effektive ved høy pH-verdi og en ikke-pH-justert PEI lager brukes da en DOE kan tyde på at høye konsentrasjoner PEI er mer effektive. Imidlertid vil denne effekt være forårsaket av den høyere pH-verdi som følge av det større volum av lager som ble tilsatt, og ikke ved den økte polymerkonsentrasjon per se. Aksje konsentrasjoner som brukes skal også ligne de som brukes i store programmer for å unngå ulike utvanningseffekter mellom skalaer som kan påvirke partikkelkonsentrasjonen og dermed flokkulering. Noen leire-baserte flokkuleringsmidler så som kaolin inneholder et stort antall fine partikler som i seg selv som kan maskere flokkuleringseffekten, f.eks turbiditetsnedsettelse etter innledende filtrering, og andre responser bør velges for å evaluere effektiviteten av disse stoffene, f.eks nedstrøms filterkapasitet.
For dataanalyse er det viktig å evaluere de innsamlede resultater i form av ekstreme verdier, forskyvninger og generell konsistens, for eksempel ekstreme verdier kan indikere en copy-paste feil, et skifte i desimal eller en feil på utstyr / analytiske enheter. En grundig analyse vil sikre at bare data av høy kvalitet brukes til modellbygging. Under modellbygging er det viktig å hele tiden vurdere the bredt sett av kvalitetsindikatorer som tilbys av DoE programvare. De mest grunnleggende kriteriene er R2, justert R2 og spådde R 2 verdier, men normale rester, rester-vs-run og faktisk-vs-spådd plott (figur 4) er enda mer viktig fordi de gir informasjon om hver med ballen et eksperiment snarere enn en sum parameter. Videre sammenhengen i den endelige modellen og dens forutsigelser med de kjente mekanismer for flokkulering bør alltid undersøkes. Store avvik mellom spådommer og vitenskapelige forventninger kan oppstå fordi DoE modellene er bare beskrivende heller enn mekanistisk, f.eks modellene kan forutsi ekstremverdier på kantene av et design plass gjenspeiler bruken av polynom passende algoritmer.
Figur 4:. Kvalitetsindikatorer over Doe modeller normal tomt på studentisert residual skal ligne en rett linje så tett som mulig (A) med kun mindre avvik (grønne piler) akseptable for høy kvalitet modeller. Et buet utseende (C) med sterke avvik (røde piler) fra den ideelle linjen (rød) indikerer en dårlig modell, for eksempel på grunn av manglende viktige faktorer. Til syvende og sist, er spådd og eksperimentelle (faktiske) verdier skal samsvare (B) og igjen følger en rett linje. Avvik fra den ideelle linjen (rød sirkel og stiplet linje) indikerer dårlig modellprediksjoner (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Den DoE tilnærming kan bidra til å karakterisere flokkulering i komplekse mate aksjer som planteekstrakter, selv om det ikke er noen eksisterende data. Flokkulering av tobakkekstrakter ble optimalisert med en arbeidsbelastning av to viEKS og forbruksvarer kostnader av ~ € 500. Dette reduserte antall dybdefiltre som kreves for en enkelt pilot-skala batch involverer ~ 800 L av planteekstrakt med 60%, noe som oppnås en tilsvarende reduksjon i forbruksvarer kostnader.
Flokkuleringsmidlene ble også brukt til ulike planteekstrakter og cellekultur homogenates. Selv om den samme flokkuleringsmiddel var effektiv for alle disse råstoffer, polymerkonsentrasjonen måtte bli justert for å tilpasse de forskjellige konsentrasjoner av dispergerte partikler. I tillegg, når en effektiv polymeren er blitt identifisert, kan filtrering og / eller sentrifugering trinn må justeres for å passe forskjellige partikkelstørrelsesfordeling 11.
Metoden er beskrevet her kan enkelt tilpasses andre råstoffer, og er derfor også relevant for forskere og ingeniører utvikler avklaring strategier for pattedyrcellekulturer og mat / fôr produksjonsprosesser. especially plantebaserte prosesser vil dra nytte av de mellomliggende prøvevolumer foreslått her fordi planteekstrakter kan inneholde partikler opp til 1 mm i diameter som er uforenlige med mikroformater 21, f.eks fordi det blandings dynamikk variere på grunn av en partikkeldiameter til fartøy ratio diameter som er ikke representative for den prosessen skalaen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ingen interessekonflikter å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| 2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Catiofast VSH | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 ml | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 ml self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| Chitosan | Carl Roth GmbH | 5375.1 | Flocculating agent |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K700P 60D | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Polymin P | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| POLYTRON PT 6100 D | Kinematica | 11010110 | Homogenization device with custom blade tool |
| Protein A | Life technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
| TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
| Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
References
- Godfray, H. C. J., et al. Food Security: The Challenge of Feeding 9 Billion People. Science. 327, 812-818 (2010).
- Fischer, R., Schillberg, S., Buyel, J. F., Twyman, R. M. Commercial aspects of pharmaceutical protein production in plants. Curr. Pharm. Des. 19, 5471-5477 (2013).
- Pastores, G. M., et al. A Phase 3, multicenter, open-label, switchover trial to assess the safety and efficacy of taliglucerase alfa, a plant cell-expressed recombinant human glucocerebrosidase, in adult and pediatric patients with Gaucher disease previously treated with imiglucerase. Blood Cells Mol. Dis. 53, 253-260 (2014).
- De Paepe, D., et al. A comparative study between spiral-filter press and belt press implemented in a cloudy apple juice production process. Food Chem. 173, 986-996 (2015).
- Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
- Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
- Buyel, J. F. Process development trategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
- Hassan, S., Keshavarz-Moore, E., Ma, J., Thomas, C. Breakage of transgenic tobacco roots for monoclonal antibody release in an ultra-scale down shearing device. Biotechnol. Bioeng. 111, 196-201 (2014).
- Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
- Gregory, J., Barany, S. Adsorption and flocculation by polymers and polymer mixtures. Adv. Colloid Interface Sci. 169, 1-12 (2011).
- Zhou, Y., Franks, G. V. Flocculation mechanism induced by cationic polymers investigated by light scattering. Langmuir. 22, 6775-6786 (2006).
- Runkana, V., Somasundaran, P., Kapur, P. C. Mathematical modeling of polymer-induced flocculation by charge neutralization. J. Colloid Interface Sci. 270, 347-358 (2004).
- Hjorth, M., Jorgensen, B. U. Polymer flocculation mechanism in animal slurry established by charge neutralization. Water Res. 46, 1045-1051 (2012).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
- Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
- Yasarla, L. R., Ramarao, B. V. Dynamics of Flocculation of Lignocellulosic Hydrolyzates by Polymers. Ind. Eng. Chem. Res. 51, 6847-6861 (2012).
- Montgomery, D. C. Design and Analysis of Experiments. , John Wiley & Sons Incorporated. (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216 (2014).
- Espuny Garcia Del Real, G., Davies, J., Bracewell, D. G. Scale-down characterization of post-centrifuge flocculation processes for high-throughput process development. Biotechnol. Bioeng. 111, 2486-2498 (2014).
- Rathore, A. S., Sofer, G. Process Validation in Manufacturing of Biopharmaceuticals, 3rd edn, Vol. 1. , Taylor & Francis. (2012).
- Kang, Y., et al. Development of a Novel and Efficient Cell Culture Flocculation Process Using a Stimulus Responsive Polymer to Streamline Antibody Purification Processes. Biotechnol. Bioeng. 110, 2928-2937 (2013).
- Menkhaus, T. J., Eriksson, S. U., Whitson, P. B., Glatz, C. E. Host selection as a downstream strategy: Polyelectrolyte precipitation of beta-glucuronidase from plant extracts. Biotechnol. Bioeng. 77, 148-154 (2002).
- Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Synthetic polymers are more effective than natural flocculants for the clarification of tobacco leaf extracts. J. Biotechnol. 195, 37-42 (2014).
- Pearson, C. R., Heng, M., Gebert, M., Glatz, C. E. Zeta potential as a measure of polyelectrolyte flocculation and the effect of polymer dosing conditions on cell removal from fermentation broth. Biotechnol. Bioeng. 87, 54-60 (2004).
- Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
- Wang, S., Liu, C., Li, Q. Impact of polymer flocculants on coagulation-microfiltration of surface water. Water Res. 47, 4538-4546 (2013).
- Menkhaus, T. J., Anderson, J., Lane, S., Waddell, E. Polyelectrolyte flocculation of grain stillage for improved clarification and water recovery within bioethanol production facilities. Bioresour. Technol. 101, 2280-2286 (2010).
- Mune, M. A. M., Minka, S. R., Mbome, I. L. Optimising functional properties during preparation of cowpea protein concentrate. Food Chem. 154, 32-37 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnol. Bioeng. 109, 2575-2588 (2012).
- Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
- Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. Vol. 1. 1, Taylor & Francis. (2000).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. Response Surface Methods Simplified. , Productivity Press. (2005).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
- Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , Wiley. (2009).
