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Methodenartikel

Entwicklung eines

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DOI:

10.3791/53974

⸱

10. Juni 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Laboratory, The University of Tokyo Hospital, 2Department of Respiratory Medicine, The University of Tokyo Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Entwicklung und Anwendung eines Gelkontraktionsassays zur Bewertung der kontraktilen Funktion in mesenchymalen Zellen, die einen epithelial-mesenchymalen Übergang durchlaufen haben.

Zusammenfassung

Fibrose ist häufig an der Pathogenese verschiedener chronisch fortschreitender Krankheiten wie der interstitiellen Lungenerkrankung beteiligt. Pathologisches Kennzeichen ist die Bildung von fibroblastischen Herden, die mit der Schwere der Erkrankung verbunden ist. Es wird vorgeschlagen, dass mesenchymale Zellen, die aus den fibroblastischen Herden bestehen, aus mehreren Zellquellen stammen, einschließlich ursprünglich residenter intrapulmonaler Fibroblasten und zirkulierender Fibrozyten aus dem Knochenmark. In jüngster Zeit sollen auch mesenchymale Zellen, die eine epithelial-mesenchymale Transition (EMT) durchlaufen haben, zur Pathogenese der Fibrose beitragen. Darüber hinaus kann EMT durch die Transformation des Wachstumsfaktors β induziert werden, und EMT kann durch proinflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor α verstärkt werden. Der Gelkontraktionsassay ist ein ideales in vitro Modell zur Beurteilung der Kontraktilität, die eine der charakteristischen Funktionen von Fibroblasten ist und zur Wundheilung und Fibrose beiträgt. In dieser Arbeit wird die Entwicklung eines Gelkontraktionsassays zur Bewertung der kontraktilen Fähigkeit von mesenchymalen Zellen demonstriert, die einer EMT unterzogen wurden.

Einleitung

Fibrose ist in der Pathogenese verschiedener chronisch progressive Erkrankungen, wie interstitielle Lungenerkrankung, Herzfibrose, Leberzirrhose, terminalem Nierenversagen, systemischer Sklerose, Autoimmunerkrankung und 1 beteiligt. Unter interstitiellen Lungenerkrankungen, ist idiopathischer pulmonaler Fibrose (IPF) ist eine chronische progressive Krankheit und zeigt eine schlechte Prognose. Pathologisches Merkmal der IPF ist die Entwicklung von fibroblastischen Foci von aktivierten Fibroblasten und Myofibroblasten besteht, die mit der Prognose assoziiert sind. Die Ursprünge solcher Lungenfibroblasten vorgeschlagen von mehreren mesenchymalen Zellen abgeleitet werden, einschließlich ursprünglich resident Lungen Fibroblasten und Fibrozyten aus Knochenmark zirkuliert. Vor kurzem epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) wurde mit der Bildung von mesenchymalen Zellen 2, in Verbindung gebracht werden vorgeschlagen und zur Pathogenese von fibrotischen Erkrankungen beizutragen.

Es wird vermutet, dass EMT spielt eine wichtige Rolle im Prozess der fötalen Entwicklung, Wundheilung, und das Fortschreiten von Krebs, einschließlich der Tumorinvasion und Metastasierung 3. Nach dem Prozess des EMT, erhalten Epithelzellen die Fähigkeit der mesenchymalen Zellen , die durch Verlust von epithelialen Marker, wie E-Cadherin, und durch Expression von mesenchymalen Marker, wie Vimentin und α-smooth muscle actin (SMA) 4,5. Frühere Studien zeigten die Hinweise , dass EMT Verfahren hat sich mit der Entwicklung von Gewebefibrose in der Niere und der Lunge 6 7 verbunden. Darüber hinaus fördert die chronische Entzündung fibrotischen Erkrankung 8; Ferner, wie inflammatorische Zytokine wie Tumor - Nekrose - Faktor -Superfamilienmitglied 14 (TNFSF14; LIGHT), Tumor - Nekrose - Faktor (TNF) -α, und Interleukin-1β wurden EMT 9-12 gezeigt , zu verbessern.

Collagen-Gel Kontraktion Assay, ein Kollagen-basierte Zellkontraktion Test, bei dem Fibroblasten in Typ I eingebettet sindKollagengel dreidimensional, ist ein ideales in vitro - Modell für die Bewertung der Kontraktilität. Kontraktionsfähigkeit ist eines der charakteristischen Funktionen von Fibroblasten und trägt zu einer normalen Wundheilung und Fibrose 13. In diesem Test wird angenommen, dass die Bindung von Fibroblasten Integrin-abhängige Mechanismen Kollagen durch sollen Typ I mechanische Spannung unter bestimmten Bedingungen zu erzeugen, und damit zur Gewebekontraktion führen.

Hierbei wird die Entwicklung der Gelkontraktion Assays berichtet angepasst werden, um die Übernahme der kontraktilen Funktion in den Zellen zu bewerten, die EMT unterzog. Dieser Bericht zeigt, dass sich diese modifizierte Test zur Bewertung der Kontraktilität in mesenchymalen Zellen geeignet ist, die EMT unterzog.

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Protokoll

1. Vorbereitung und Kultur von Lungenepithelzellen

  1. Kultur A549 humanen Lungenepithelzellen (adhärente Zelllinie) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, 100 IU / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin.
  2. Entfernen und entsorgen Sie die Zellkulturmedien von Kulturschale und wäscht einmal mit 5: - 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Nach dem Waschen aspirieren sofort die PBS.
  3. 2 ml Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (0,05%) und inkubiere bei 37 ° C und 5% CO 2 für 3 min.
  4. Sammle die abgelösten Zellen in Zentrifugenröhrchen, enthaltend Zellkulturmedium, zentrifugieren die Röhrchen bei RT für 4 min bei 150 × g.
  5. Resuspendieren der Zellen in 2 ml Zellkulturmedium pelletieren und eine Probe für die Zellzählung entfernen. Zählen Sie die Anzahl der Zellen einer Zählkammer mit Trypanblau-Färbung mit der Lebensfähigkeit der Zellen zu überprüfen.
  6. Seed A549-Zellen auf10 cm Polystyrol - Platten in einer Dichte von 0,5-1,0 x 10 6 Zellen / Schale mit 10 ml Medium für Gelkontraktion Assays. Seed die Zellen auf 6 - Well - Polystyrol - Platten mit einer Dichte von 0,5 bis 1,0 × 10 5 Zellen / Vertiefung mit 2 ml Medium für EMT Bestätigung. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 24 Std.

2. EMT Verfahren

  1. Zugabe von 10 & mgr; l von TGF-β1 (5 ug / ml) und 10 & mgr; l TNF-α (10 ug / ml) auf die Platte für Gelkontraktion Assay ausgesät in Schritt 1.6. Hinzufügen 2 ul TGF-β1 (5 ug / ml) und 2 & mgr; l TNF-α (10 ug / ml) auf die Platte für EMT Bestätigung ausgesät in Schritt 1.6. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 für 48 Stunden.

3. Bestätigung der EMT Verfahren durch PCR und Western Blot

  1. Bestätigen Änderung in der Morphologie (von Kopfsteinähnliche Form auf die Spindel) der behandelten Zellen unter Verwendung von Phasenkontrastmikroskopie.
    Hinweis: Normal A549 Zellen haben Cobble stone förmig und dreieckig geformte Optik , die ein Merkmal von Epithelzellen, aber nach Stimulation mit TGF-β1 und TNF-α, erscheinen die Zellen lang und spindelförmige daß ähnelt Mesenchymzellen 14,15.
  2. Bewerten Sie die Expression eines epithelialen Marker, wie zum Beispiel E-Cadherin und mesenchymalen Marker, wie zB N-Cadherin, Vimentin und α-Glattmuskelaktin unter Verwendung von PCR oder Western-Blot.
    1. Extrahieren der Gesamt - RNA aus den Zellen unter Verwendung von RNA - Extraktions - Kits 16 und synthetisieren cDNA unter Verwendung von reverser Transkriptase 17 gemäß dem Protokoll des Herstellers.
    2. Messen Sie die Expression von mRNA - Spiegel unter Verwendung von Echtzeit - PCR - System 18 und monomeren Cyaninfarbstoff PCR - Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Die spezifischen Primer für GAPDH (Glycerinaldehyd - 3-phosphat - Dehydrogenase), ACTA2 (alpha-Actin-2), CDH1 (Cadherin-1; E-Cadherin) und VIM (Vimentin) sind in Tabelle 1 gezeigt .
    3. Lysieren die Zellen eine Lyse - Puffer (Tabelle 2) Lösung , die 1% Protease - Inhibitor - Cocktail verwendet. Messen alle Probenproteinkonzentrationen unter Verwendung eines Protein - Assay - Kit 19,20, und die gleichen Mengen an Protein zu einem Polyacrylamidgel.
      1. Führen SDS - Gel-Elektrophorese und halbtrockenen Transfer der Proteine ​​auf eine PVDF - Membran 21. Inkubieren Sie die Membran mit primären Antikörpern in Blocking-Puffer mit 1 - 2 Stunden. Nach der Inkubation waschen zweimal die Membran mit Waschpuffer und Inkubation der Membran 1 Stunde mit dem zweiten Antikörper.
        Hinweis: Lesen Sie die Materialien / Ausrüstung Tabelle für Antikörper und in diesen Studien verwendeten Verdünnungen. Siehe Tabelle 2 für die Komponenten der Blocking - Puffer.
      2. Waschen Sie die Membran mit Waschpuffer zweimal. Machen Sie Fotos von der Membran mit der Western - Blot - Nachweis - Kit 22 eine kalte CCD - Kamera 11,23 verwenden.

4. Gelkontraktion Assay zur Beurteilung von EMT

  1. Aspirieren den konditionierten Medien aus dem Zellkulturgefäß, und wäscht gut mit von 5 bis 10 ml PBS abgestorbene Zellen zu entfernen. Nach dem Waschen aspirieren sofort die PBS.
  2. 2 ml 0,05% Trypsin / EDTA und Inkubation bei 37 ° C und 5% CO 2 für 3 min.
  3. Sammeln Sie die abgelösten Zellen in Zentrifugenröhrchen, das DMEM mit Trypsin-Inhibitor ergänzt (1 mg / ml), Zentrifuge die Röhrchen bei RT für 4 min bei 150 × g.
  4. Mix Typ-1-Kollagen-Gel mit destilliertem Wasser, und 4 × konzentriert DMEM anpassen, um die Volumina einer Kollagenkonzentration von 1,75 mg zu erreichen / ml und 1 × DMEM Konzentration. Achten Sie darauf, während dieser Schritt das Gel-Medium auf Eis zu halten.
    Hinweis: Um 6 ml Gel-Medium zu machen, gut mischen 3,5 ml Typ-1-Kollagen-Gel (3 mg / ml), 1,5 ml 4 × konzentriert DMEM, und 1 ml destilliertem Wasser.
  5. eine Probe für die Zellzählung Resuspendieren des Zellpellets in 500 & mgr; l PBS und zu entfernen. Grafdie Anzahl der Zellen, die ein Hämozytometer mit Trypanblau-Färbung mit der Lebensfähigkeit der Zellen zu überprüfen.
  6. Füge das Gelmedium das Volumen einzustellen , um eine Zelldichte von 3,0 × 10 5 Zellen zu erreichen / Vertiefung (6,0 × 10 5 Zellen / ml) und sanft , aber es schnell und ohne Gelbildung durch Pipettieren gemischt.
  7. Dispense 0,5 ml des Gemisches in jede Vertiefung einer 24-Well nicht behandelten Platte schnell und sorgfältig gepflegte zylindrische Form zu machen. Achten Sie darauf , keine Luftblasen zu ermöglichen , die Gele (1A) zu verunreinigen.
    Hinweis: Das Gelmedium, die Zellen enthält, viskos ist und kann leicht gelieren und Form sichelförmige Form in dem Bohrloch.
  8. Inkubiere die Platte für 15 min in einem Zellinkubator bei 37 ° C, 5% CO 2 und 95% Feuchtigkeit vollständig zu gelieren.
  9. Lösen sich von der Platte Gelen ohne Brechen durch einen sterilisierten Spatel in einer Weise bewegt einen Umfang in eine Richtung zu ziehen. Mit einem Spatel übertragen sanft die Gele bis 60 mm Gewebekulturschalendie 5 ml DMEM / 1% FBS mit oder ohne TGF-β1 (5 ng / ml) und TNF-α (10 ng / ml).
  10. Sie vorsichtig die Gerichte schütteln Gele auf dem Medium schweben zu gewährleisten. Inkubieren in einem Zellinkubator bei 37 ° C, 5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit.

5. Messung der Gel-Größe

  1. Messen der Größe Kollagengel nach 0, 24, 48 und 72 h ein Bildanalysesystem verwendet wird.
    1. Schalten Sie das Geldokumentationssystem (2A), und stellen Geschirr in die Lichtabschirmungs Schrank. Dann nehmen Sie den Deckel von Geschirr im Schrank.
    2. Öffnen Sie die zugehörige Gel Analysesoftware. Klicken Sie auf die "Bildaufnahme-Taste" in der Menüleiste, um das Bild der Gele im Schrank zu zeigen. Klicken Sie dann auf "Acquire" in der Menüleiste Bilder der Gele (2B) zu nehmen.
    3. Klicken Sie auf die "Erkennung Taste" in der Menüleiste (Abbildung 2C) und stellen Sie den Messbereich (gelber Kreis in 2C) durch Ziehen der Maus. Klicken Sie dann auf die "Auto-detect - Taste" in der Menüleiste (siehe Taste in 2D). Die Software erkennt automatisch die Gele zeigt eine Heatmap (2D).
    4. "OK" klicken , zu extrahieren , die Umrisse der Gele durch Bildverarbeitung und auf Gebieten , die von der Gliederung (Abbildung 2E) umgeben berechnen. Nachdem die Fläche berechnet wird, wird die berechnete Fläche in separaten Popup-Fenster angezeigt.
      Hinweis: Wenn die Gele einander während der Bildgebung überlappen, Gele bewegen vorsichtig mit einer sterilen Pipettenspitze.

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Ergebnisse

Während EMT, verlieren Epithelzellen epithelialen Marker, wie E-Cadherin, und gewinnen die Expression von mesenchymalen Marker, wie Vimentin und α-smooth muscle 4,5 Aktin. Inkubation von menschlichen A549 Lungenepithelzellen mit TGF-β1 und TNF-α induziert EMT. Das Erscheinungsbild der normalen A549 - Zellen sind Cobble Stein wie Form und Dreiecksform , die ein Merkmal von Epithelzellen (3A), aber nachdem sie mit TGF-β1 und TNF-α stimuliert, änderte sich das Au...

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Diskussion

Das Protokoll in dieser Studie entwickelt umfasst zwei Schritte. Der erste Schritt wird durchgeführt, EMT zu induzieren, während der zweite Schritt ist die Gelkontraktion Assays. Da es wichtig ist, um zu bestätigen, dass die Zellen EMT unterzog, Stufe 2 bietet eine hervorragende Ergänzung zu den morphologischen und Veränderungen der Genexpression. Frühere Studien zeigten , dass EMT von A549 - Zellen durch TGF-β1 induzierten wurde nur 24; aber, wie wir vorher 10, TNF-α - Behandlung berichtet wurden ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Danksagungen

Wir danken Dr. Tadashi Koyama für die technische Hilfe. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von JSPS KAKENHI Grant Numbers 23249045, 15K09211, 15K19172; ein Stipendium für die Forschungsgruppe für Atemversagen des japanischen Ministeriums für Gesundheit, Arbeit und Soziales; ein Stipendium für die Erforschung allergischer Erkrankungen und Immunologie, Japan.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEMsigma aldrich11965-092Für A549 Medium
FBSGIBCO10437
Transforming Growth Factor-β 1, menschliche, rekombinanteWako Laborchemikalien209-16544
Rekombinantes humanes TNF-αForschung & Forschung D systems210-TA/CF
E-Cadherin (24E10) Kaninchen-mAb-Zellsignaltechnologie#31951:3.000 Verdünnung
Vimentin (D21H3) Kaninchen-mAb-Zellsignaltechnologie#57411:3.000 Verdünnung
Anti-α-Tubulin-Antikörpersigma aldrichT90261:10.000 Verdünnung
Monoklonales Anti-Aktin, α-Antikörper für glatte Muskeln& nbsp;sigma aldrichA52281:10.000 Verdünnung
Anti-N-Cadherin AntikörperBD Transduction Laboratories#6109201:1.000 Verdünnung
Anti-Maus IgG, HRP-linked Whole Ab Sheep (sekundärer Antikörper)GE HealthcareNA931-100UL1:20.000 Verdünnung
Anti-Kaninchen IgG, HRP-linked Whole Ab Donkey (sekundärer Antikörper)GE HealthcareNA934-100UL1:20.000 Verdünnung
BlockierungsreagenzGE HealthcareRPN4182% in TBS-T
6 Well Clear Flat Bottom TC-behandelte Multiwell-Zellkulturplatte, mit DeckelCorning#353046
100 mm ZellkulturschaleTPP#93100
DMEM,Pulverlebensdauer Technologien12100-046Für 4&fach; DMEM
Typ 1 Kollagen GelNitta GelatineCellmatrix Typ I-A
24 Well ZellkulturplatteAGC TECHNO GLASS1820-024
Gel Dokumentationssystem ATTOAE-6911FXNGel-Imager
Gel-AnalysesoftwareATTODensitograph, Version 3.00Analysesoftware im Bundle mit AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0,05 %), Phenolrot-Life-Technologien25300054
24-Well-Platten, unbehandeltIWAKI1820-024
Trypanblau-Lösung, 0,4 %Life-Technologien15250-061
RNA-ExtraktionskitQiagen74106
Lebenstechnologienreverse Transkriptase18080044
Echtzeit-PCR-SystemStratageneMx-3000P
SYBR grünes PCR-KitQiagen204145
Protease-Inhibitor-Cocktail (100x)life technologies78429
PVDF-MembranATTO2392390
Protein-Assay-Kitbio-rad5000006JA 
Polyacrylamid-GelATTO2331810
Western-Blotting-DetektionsreagenzGE HealthcareRPN2232
Kalte CCD-KameraATTOEz-Capture MG/ST
Trypsin-InhibitorSigma AldrichT9003-100MG
Polyoxyethylen (20)Sorbitan-MonolauratWako Laborchemikalien163-11512
Polyoxyethylen (9)-octyiphenyletherWako Laborchemikalien141-08321
für

Referenzen

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