Entwicklung eines In Vitro Assay Kontraktionsfunktion von mesenchymalen Zellen, die Unterzog Epithelial-mesenchymale Transition zur Bewertung

Summary

Hier beschreiben wir die Entwicklung und Anwendung eines Gelkontraktionsassays zur Bewertung der kontraktilen Funktion in mesenchymalen Zellen, die einen epithelial-mesenchymalen Übergang durchlaufen haben.

Abstract

Fibrose ist häufig an der Pathogenese verschiedener chronisch fortschreitender Krankheiten wie der interstitiellen Lungenerkrankung beteiligt. Pathologisches Kennzeichen ist die Bildung von fibroblastischen Herden, die mit der Schwere der Erkrankung verbunden ist. Es wird vorgeschlagen, dass mesenchymale Zellen, die aus den fibroblastischen Herden bestehen, aus mehreren Zellquellen stammen, einschließlich ursprünglich residenter intrapulmonaler Fibroblasten und zirkulierender Fibrozyten aus dem Knochenmark. In jüngster Zeit sollen auch mesenchymale Zellen, die eine epithelial-mesenchymale Transition (EMT) durchlaufen haben, zur Pathogenese der Fibrose beitragen. Darüber hinaus kann EMT durch die Transformation des Wachstumsfaktors β induziert werden, und EMT kann durch proinflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor α verstärkt werden. Der Gelkontraktionsassay ist ein ideales in vitro Modell zur Beurteilung der Kontraktilität, die eine der charakteristischen Funktionen von Fibroblasten ist und zur Wundheilung und Fibrose beiträgt. In dieser Arbeit wird die Entwicklung eines Gelkontraktionsassays zur Bewertung der kontraktilen Fähigkeit von mesenchymalen Zellen demonstriert, die einer EMT unterzogen wurden.

Introduction

Fibrose ist in der Pathogenese verschiedener chronisch progressive Erkrankungen, wie interstitielle Lungenerkrankung, Herzfibrose, Leberzirrhose, terminalem Nierenversagen, systemischer Sklerose, Autoimmunerkrankung und ¹ beteiligt. Unter interstitiellen Lungenerkrankungen, ist idiopathischer pulmonaler Fibrose (IPF) ist eine chronische progressive Krankheit und zeigt eine schlechte Prognose. Pathologisches Merkmal der IPF ist die Entwicklung von fibroblastischen Foci von aktivierten Fibroblasten und Myofibroblasten besteht, die mit der Prognose assoziiert sind. Die Ursprünge solcher Lungenfibroblasten vorgeschlagen von mehreren mesenchymalen Zellen abgele....

Protocol

1. Vorbereitung und Kultur von Lungenepithelzellen

1. Kultur A549 humanen Lungenepithelzellen (adhärente Zelllinie) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, 100 IU / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin.
2. Entfernen und entsorgen Sie die Zellkulturmedien von Kulturschale und wäscht einmal mit 5: - 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Nach dem Waschen aspirieren sofort die PBS.
3. 2 ml Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (0,05%) und inkubiere bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 3 min.
4. Sammle die abgelösten Zellen in Zentrifugenröhrchen, enthaltend Zellkulturmediu....

Results

Während EMT, verlieren Epithelzellen epithelialen Marker, wie E-Cadherin, und gewinnen die Expression von mesenchymalen Marker, wie Vimentin und α-smooth muscle ^4,5 Aktin. Inkubation von menschlichen A549 Lungenepithelzellen mit TGF-β1 und TNF-α induziert EMT. Das Erscheinungsbild der normalen A549 - Zellen sind Cobble Stein wie Form und Dreiecksform , die ein Merkmal von Epithelzellen (3A), aber nachdem sie mit TGF-β1 und TNF-α stimuliert, änderte sich das Au.......

Discussion

Das Protokoll in dieser Studie entwickelt umfasst zwei Schritte. Der erste Schritt wird durchgeführt, EMT zu induzieren, während der zweite Schritt ist die Gelkontraktion Assays. Da es wichtig ist, um zu bestätigen, dass die Zellen EMT unterzog, Stufe 2 bietet eine hervorragende Ergänzung zu den morphologischen und Veränderungen der Genexpression. Frühere Studien zeigten , dass EMT von A549 - Zellen durch TGF-β1 induzierten wurde nur ^24; aber, wie wir vorher ^10, TNF-α - Behandlung berichtet wurden .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	sigma aldrich	11965-092	Für A549 Medium
FBS	GIBCO	10437
Transforming Growth Factor-β 1, menschliche, rekombinante	Wako Laborchemikalien	209-16544
Rekombinantes humanes TNF-α	Forschung & Forschung D systems	210-TA/CF
E-Cadherin (24E10) Kaninchen-mAb-Zellsignaltechnologie		#3195	1:3.000 Verdünnung
Vimentin (D21H3) Kaninchen-mAb-Zellsignaltechnologie		#5741	1:3.000 Verdünnung
Anti-α-Tubulin-Antikörper	sigma aldrich	T9026	1:10.000 Verdünnung
Monoklonales Anti-Aktin, α-Antikörper für glatte Muskeln& nbsp;	sigma aldrich	A5228	1:10.000 Verdünnung
Anti-N-Cadherin Antikörper	BD Transduction Laboratories	#610920	1:1.000 Verdünnung
Anti-Maus IgG, HRP-linked Whole Ab Sheep (sekundärer Antikörper)	GE Healthcare	NA931-100UL	1:20.000 Verdünnung
Anti-Kaninchen IgG, HRP-linked Whole Ab Donkey (sekundärer Antikörper)	GE Healthcare	NA934-100UL	1:20.000 Verdünnung
Blockierungsreagenz	GE Healthcare	RPN418	2% in TBS-T
6 Well Clear Flat Bottom TC-behandelte Multiwell-Zellkulturplatte, mit Deckel	Corning	#353046
100 mm Zellkulturschale	TPP	#93100
DMEM,	Pulverlebensdauer Technologien	12100-046	Für 4&fach; DMEM
Typ 1 Kollagen Gel	Nitta Gelatine	Cellmatrix Typ I-A
24 Well Zellkulturplatte	AGC TECHNO GLASS	1820-024
Gel Dokumentationssystem	ATTO	AE-6911FXN	Gel-Imager
Gel-Analysesoftware	ATTO	Densitograph, Version 3.00	Analysesoftware im Bundle mit AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0,05 %), Phenolrot-Life-Technologien		25300054
24-Well-Platten, unbehandelt	IWAKI	1820-024
Trypanblau-Lösung, 0,4 %	Life-Technologien	15250-061
RNA-Extraktionskit	Qiagen	74106
Lebenstechnologien	reverse Transkriptase	18080044
Echtzeit-PCR-System	Stratagene	Mx-3000P
SYBR grünes PCR-Kit	Qiagen	204145
Protease-Inhibitor-Cocktail (100x)	life technologies	78429
PVDF-Membran	ATTO	2392390
Protein-Assay-Kit	bio-rad	5000006JA
Polyacrylamid-Gel	ATTO	2331810
Western-Blotting-Detektionsreagenz	GE Healthcare	RPN2232
Kalte CCD-Kamera	ATTO	Ez-Capture MG/ST
Trypsin-Inhibitor	Sigma Aldrich	T9003-100MG
Polyoxyethylen (20)Sorbitan-Monolaurat	Wako Laborchemikalien	163-11512
Polyoxyethylen (9)-octyiphenylether	Wako Laborchemikalien	141-08321