Introduction
Metástasis representan más del 90% de las muertes causadas por tumores sólidos. El hueso es el órgano más frecuentemente afectado por la metástasis de varios tipos de cáncer, especialmente de mama y de próstata. Cuando se diagnostica en la clínica, las metástasis óseas por lo general ya han entrado en etapas avanzadas, ya sea con o osteolíticas osteoblásticas alteraciones en el hueso, a menudo acompañadas con síntomas neurológicos.
Los estudios anteriores se centraron principalmente en las metástasis óseas osteolíticas abiertas 1-3, sin embargo, actualmente hemos comprensión de micrometástasis en los huesos limitado antes de la aparición del proceso de osteolítica. Esto es al menos en parte debido a la falta de modelos y enfoques experimentales apropiadas. Modelos de ratones genéticamente modificados de cáncer de mama a menudo metástasis a los pulmones, pero mucho menos eficientemente a los huesos 4. Del mismo modo, los tumores trasplantados ortotópicamente raramente desarrollan metástasis óseas espontáneas, con un poco de 4T1 carcinom mamaria hueso-tropicaluna sub-clones y MSP sobreexpresa PYMT modelo de ratón transgénico como excepciones 5-7. Perforación Intra-tibial puede entregar las células del cáncer a los huesos 8-10, sino que también incurre en el daño y la inflamación de los tejidos locales. Actualmente inyección intracardiaca de líneas celulares de cáncer de mama ha sido el enfoque principal para investigar la colonización hueso 11-13. Sin embargo, después de las células cancerosas se introducen en ventrículo izquierdo sólo una proporción limitada finalmente alcanzará hueso y médula ósea, lo que hace difícil realizar un seguimiento de metástasis microscópicas de una forma cuantificable.
En este estudio, hemos establecido una técnica, a saber, la arteria intra-ilíaca (IIA) de inyección 14, para entregar selectivamente las células cancerosas en los tejidos de las extremidades traseras, enriqueciendo así las células cancerosas en la médula y la médula ósea sin causar daño a los tejidos locales. Debido a la especificidad de hueso, este enfoque también permite tiempo suficiente para que las células de cáncer indolente para colonizar el tiempo antes de la unaimals sucumben a los tumores primarios o metástasis en otros órganos vitales. Cuando se combina con una variedad de otras técnicas, tales como imágenes de bioluminiscencia, la tinción de inmunofluorescencia y la histomorfometría ósea, la inyección IIA es potencialmente útil para una amplia gama de fines de investigación relacionadas con la metástasis en los huesos, especialmente el seguimiento de la progresión de las células cancerosas individuales a múltiples celdas micrometástasis. En particular, hemos demostrado que la inyección IIA nos permite visualizar las interacciones entre las células de cáncer y varios tipos de células que rodea en el microambiente de la médula.
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Protocol
Todo el trabajo de los animales se realizó de acuerdo a las directrices del cuidado de animales de la Facultad de Medicina Baylor.
1. Preparación de la célula
Nota: Las diferentes líneas celulares de cáncer se pueden utilizar para la inyección IIA dependiendo de los propósitos de investigación. Hemos utilizado líneas celulares de cáncer de mama MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 y línea celular de cáncer de próstata C4-2 en nuestra investigación. Utilizamos típicamente tanto las buenas prácticas agrarias y las células de cáncer de luciferasa de luciérnaga marcado para nuestro estudio y mostramos aquí algunos datos de la línea celular MCF7 marcado con GFP-luciferasa.
- Mantener las células en DMEM que contenía 10% de FBS y 0,1 mg / ml de penicilina-estreptomicina a 37 ° C en 5% de CO 2.
- Antes de la inyección IIA, trypsinize células en 80 a 90% de confluencia con una solución / EDTA 0,25% de tripsina. Utilice PBS fría para lavar las células dos veces, y volver a suspender las células en 10 ml de PBS para el recuento celular. Para eliminar de PBS, centrifugar las células a 800 xg durante 5 min.
- células resuspendera una concentración de 5 x 10 6 células / ml en PBS enfriado en hielo.
- Utilice 100 l GFP y las células de cáncer de luciferasa de luciérnaga marcado para la inyección de AII de un ratón.
Nota:. Por lo tanto, el número de células recibidas por cada animal es 5 x 10 5 puede necesitar ser modificado en base a la agresividad de las líneas celulares de este número. - Mantenga las suspensiones de células en hielo.
Las vibraciones pueden ser necesarios para evitar la agregación de células cada pocos minutos hasta que esté listo para la inyección: nota. Para algunas líneas celulares (tales como MDA-MB-231), pueden ser necesarios procedimientos más estrictos (por ejemplo, pasan a través de 45 micras filtro de células) para evitar la agregación. Tenga en cuenta que la obstrucción de los vasos puede causar necrosis de los tejidos, y por lo tanto confundiendo a los experimentos.
2. Preparación de los animales
- Para el tratamiento del dolor de los animales, dar 5 mg / kg / día carprofeno (u otro analgésico) con suplemento dietético para los ratones no menos de 24 horas antes de la cirugía. Administraruna dosis de 0,1 mg / ml de buprenorfina por vía subcutánea 60 minutos antes de la cirugía. Nota: es un procedimiento opcional para implantar palet estradiol en la parte posterior de animales para proporcionar estradiol adicional. Esto acelerará el cultivo de células ER + cáncer (por ejemplo, las células MCF-7) 9.
- Anestesie A 4 - 6 semanas de edad de ratón (aproximadamente 20 g) con ketamina (80 - 100 mg / kg) y xilazina (10 -12,5 mg / ml) mediante inyección intraperitoneal.
- Para confirmar el nivel adecuado de sedación de un ratón de 20 g por pizca dedo del pie y la observación de una reducción del 50% en la frecuencia respiratoria y rosa membranas mucosas (por ejemplo, la piel de oreja de ratón y la piel de la pata). Mantener el seguimiento de estos signos vitales cada 15 minutos durante la cirugía. Nota: No movimiento del animal indica que el animal es suficientemente anestesiado y listo para la cirugía.
- Utilice ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad.
- Afeitar el ratón en el bajo vientre, en especial la zona de la ingle derecha, donde la cirugía y la inyeccióntener lugar.
Nota: Esto no es necesario si se utilizan ratones desnudos atímicos. - Ponga el ratón sobre su espalda, separar las patas en sus posiciones naturales y se adhieren a los dedos de los pies de cartón disección móvil con cinta.
- Limpie el área de la ingle derecha con hisopos de algodón estériles empapadas etanol isopropílico 70%, seguido con betadine lavado quirúrgico varias veces.
3. La vena ilíaca común y la arteria Localización y Separación
- Hacer una incisión en la piel de 1,0 - 1,2 cm de largo entre el 4 y 5 de los pezones en el abdomen inferior derecho utilizando Nº 10 de carbono cuchillas de bisturí de acero estériles, celebrada en un mango Nº 3. A continuación, utilice un paño quirúrgico estéril para cubrir el cuerpo de un animal, excepto el sitio de la incisión.
- Mover el animal al estándar del banco microscopio de disección de la parte superior. Utilice un aumento de 4X para inyección.
- Bajo 4X aumento del microscopio de disección, insertar unas pinzas romas de separación entre el tejido adiposo y el peritoneum, y empujar los tejidos hacia el exterior en ambos lados para exponer los vasos ilíacos y nervios (ver Figura 1).
Nota: La arteria aorta entre de la línea media y la parte inferior de ramas de la arteria se denomina arteria ilíaca común. Aquí es donde la inyección se lleva a cabo. - Utilice un par de pinzas finas rectas de romper el tejido conectivo (como una membrana) entre los vasos y el nervio, más cerca de los vasos.
- Cambiar las pinzas finas directamente a la mano izquierda. Coge un par de pinzas finas en ángulo utilizando la mano derecha. Inserte las pinzas mano derecha en misma posición en la que los tejidos conectivos se han roto. Y luego pegar las pinzas de la mano derecha a través, por debajo de los vasos.
- Al mismo tiempo, insertar la pinza de la mano izquierda en los tejidos conectivos en el lado izquierdo de los vasos para guiar la pinza de la mano derecha pasando.
- Una vez que la pinza de la mano derecha coge por debajo de los vasos, tratar de separar los vasos de la TI que rodeaN ú mero un poco más, y luego mantenerlos en la parte superior de la pinza de la mano derecha.
- El uso de fórceps de la mano izquierda para entregar la punta de una sutura de seda 4-0 a la pinza de la mano derecha, y luego tirar de la sutura suave y lentamente, por debajo de los vasos. Nota: Ahora los dos vasos arteriales y venosos comunes son levantados por la sutura (ver Figura 2).
4. La inyección y post-inyección de Cuidado
- Preparar las células para la inyección en una jeringa de insulina 31G. Utilice 100 l de suspensión celular en PBS por inyección. Asegúrese de que la pipeta hacia arriba y abajo varias veces para separar las células y evitar la agregación de modo que las células inyectadas no va a obstruir y bloquear el flujo de sangre.
- Con las pinzas en ángulo en la mano izquierda, coloque la pinza por debajo de los vasos a lo largo de la dirección de la sutura, y luego abrir las dos ramas de la pinza, que tiene los vasos mantenidas con cuidado de las pinzas.
Nota: El intervalo entre los dos brazos de la pinza será el iEl sitio njection. - Mantenga la aguja de 31 G con 100 l de suspensiones celulares en la mano derecha, con el bisel de la aguja hacia arriba, listo para la inyección.
- Insertar la aguja en la luz de la arteria (sangre entrará en la punta de la aguja). A continuación, empuje suspensión celular lentamente en inyectar las células. La suspensión celular se alejar la sangre roja en el recipiente. Trate de no romper los vasos o escape, la suspensión de células a cabo.
- Una vez finalizada la inyección, tire suavemente la aguja y mantener la celebración de los vasos sobre la pinza de la mano izquierda para detener el sangrado. Luego de alejarse de la sutura.
- Apartarse del fórceps de la mano izquierda, y utilizar rápidamente un hisopo de algodón para presionar el área de la incisión de la arteria para detener el sangrado.
Nota: Por lo general, de 5 - 10 min presión continua es suficiente para detener el sangrado. - Cuando el sangrado se detiene, el uso de pegamento de piel para cerrar los bordes de la piel de la zona de la cirugía. Hacer una marca auricular, y comprobar si hay señalización para examinar la distribución de las células inyectadas bioluminiscencia. <br /> Nota: Una inyección con éxito dará lugar a una imagen similar a la Figura 3.
- Compruebe señalización bioluminiscencia mediante la inyección de 100 l 15 mg / luciferina ml en PBS a 75 mg / kg de concentración del ratón a través del seno intra-orbital.
- Para la inyección intra-orbital, coloque los dedos en ambos lados de los ojos del ratón, use presión para hacer que la bola del ojo poco se salga del marco ojo, insertar 28 g agujas de jeringas de insulina entre la bola del ojo y la nariz, y luego empujar lentamente la jeringa para inyectar luciferina .
Nota: en la posición correcta, la aguja debe ser capaz de alcanzar una profundidad de 2 - 3 mm antes de golpear los tejidos duros (hueso). - Coloque el ratón en el sistema de formación de imágenes para formación de imágenes in vivo todo animal para el 10 - 60 seg dentro de 5 min (véase la figura 3).
Nota: Un procedimiento opcional es la implantación de pellets de estradiol en la parte posterior de animales para proporcionar estradiol adicional. Esto acelerará el crecimiento de células ER + cáncer (por ejemplo, MCF-7células) 15.
- Para la inyección intra-orbital, coloque los dedos en ambos lados de los ojos del ratón, use presión para hacer que la bola del ojo poco se salga del marco ojo, insertar 28 g agujas de jeringas de insulina entre la bola del ojo y la nariz, y luego empujar lentamente la jeringa para inyectar luciferina .
- Compruebe señalización bioluminiscencia mediante la inyección de 100 l 15 mg / luciferina ml en PBS a 75 mg / kg de concentración del ratón a través del seno intra-orbital.
- Deje el ratón sobre una almohadilla térmica caliente hasta que despierte. Supervisar el sangrado, hinchazón, signos de dehiscencia y el dolor durante el período post-quirúrgico. Ponga los ratones de nuevo a la jaula con cobertura analgésica (suplemento dietético carprofin sugirió) dada para el manejo del dolor hasta que no haya signos de dolor. Prestar mucha atención y cuidado de los animales durante 7 días después de la cirugía.
5. Control de Crecimiento metastásico
- histomorfometrıa:
- Cosecha del tumor que lleva tejidos óseos, fijar los huesos en paraformaldehído al 4% durante 24 horas, luego se descalcifica en pH de la solución de EDTA 7,0 14% durante 3 - 5 días, y someterlas a parafina incrustación como se ha descrito previamente 14.
- Sección de los tejidos óseos en parafina incrustar en el espesor de 3 micras y realizar método histológico estándar de tinción con hematoxilina / eosina como se ha descrito previamente 14.
- Immunohistochemistratar:
- Asunto hueso portador de un tumor embebidos en parafina se desliza a inmunohistoquímica tinción para diversos fines, como se describe anteriormente 14. Brevemente, las células de cáncer immunostain MCF7 por los anticuerpos anti-GFP, y las células osteogénicas inmunotinción (pre-osteoblastos y osteoblastos) por anticuerpos anti-osterix y anticuerpos anti-fosfatasa alcalina (ALP), respectivamente.
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Representative Results
La Figura 1 ilustra la localización anatómica y la relación de la arteria ilíaca común (rojo) y la vena (azul).
La figura 2 muestra la posición relativa de los vasos ilíacos y nervios en el microscopio de disección. Como se representa en la figura 2A, los vasos y los nervios están justo debajo de la pared peritoneal y pueden ser reveladas después de la incisión de la piel se hace y el peritoneo se apartó. La vena ilíaca común está a la izquierda, y es más grande y más oscuro en comparación con la arteria. La arteria está en el medio, y se ve de color rosa. Es más delgada que la vena pero tiene pared muscular gruesa. La vena y la arteria son paralelos y estrechamente unidas entre sí. Más hacia la derecha es el nervio lumbosacro blanco. La figura 2B muestra los vasos ilíacos comunes separados de los alrededores del tejido conectivo, músculos y nervios, y levantado por un grupo 4-0 sutura de seda. El ilíaca común vena, arteria y el nervio lumbosacro también se indican.
La Figura 3 muestra representativa in vivo y ex vivo de imágenes de bioluminiscencia de los animales después de la inyección de la arteria intra-ilíaca. Cinco x 10 5 células MCF7 GFP-luciferina marcado en 100 l se administraron a la extremidad posterior derecha del ratón mediante inyección intra-arterial ilíaca. Entonces D-luciferina se administró mediante inyección intra-sinusal órbita, seguido de toda la formación de imágenes de animales bioluminiscencia in vivo. Las células MCF7 inyectados fueron enriquecidos en la extremidad posterior derecha del ratón, como se indica por las señales de bioluminiscencia (Figura 3A). Las señales de bioluminiscencia in vivo de todo el animal fueron rastreados cada 3 días o cada semana, y luego se recogieron los tejidos ósea de ratón en el día 14 después de la inyección cuando toda la señal de animales bioluminiscencia alcanza un umbral determinado (Flujo de fotones> 10 4). Después de la administración de D-luciferina, los tejidos óseos de la arteria ilíaca intra-ratón inyectado se recogieron rápidamente y se sumergieron en PBS para formación de imágenes ex vivo. La fuerte señal de bioluminiscencia de la arteria ilíaca intra-ósea inyecta trasera derecha, pero no de la médula de control izquierda mostró la localización específica de las células inyectadas (Figura 3B).
La Figura 4 muestra imágenes representativas de tinción histológica y de inmunofluorescencia. Cuando se han recolectado los huesos que soportan el tumor, que fueron sometidos a la fijación de paraformaldehído, descalcificación con EDTA, y luego de inclusión en parafina. Tres micras diapositivas de hueso se prepararon y se realizaron estándar de tinción con H & E. Las células de adoquines-como compactos con núcleos más grandes eran lesiones metastásicas MCF7 microscópicos en el tejido óseo 14 días después de la inyección de la arteria intra-ilíaca, como se indica por las flechas rojas. La médula ósea (BM) Y los huesos grandes trabeculares planas de color rosa (TB) con núcleos dispersos así etiquetadas (Figura 4A). La figura 4B muestra GFP-etiquetados células MCF7 (verdes), los osteoblastos marcados con fosfatasa alcalina (color rojo en la imagen izquierda), y osterix marcado con pre-osteoblastos (rojo en la imagen de la derecha) después de la tinción de inmunofluorescencia. Azul DAPI tinción indica el núcleo.
Figura 1:. Anatomía de la arteria ilíaca común (rojo) y la vena (azul) en el ratón aorta abdominal, la arteria ilíaca común, la arteria ilíaca externa, y la arteria femoral se muestra como se indica. La inyección se realiza en la arteria ilíaca común desde la aorta hacia la dirección arteria femoral. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Vasos ilíacos y los nervios bajo el microscopio de disección estándar con 4 aumentos (a) Imagen de los vasos y nervios intactos. (B) La imagen de los vasos levantadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Representación en vivo e imágenes de bioluminiscencia ex vivo de ratón después de la inyección de la arteria intra-ilíaca. (A) La señal de bioluminiscencia in vivo de todo el derecho de los animales después de la inyección. (B) El ex vivo señal de bioluminiscenciade hueso de control izquierda y el hueso inyectado derecho de los animales inyectados que fueron cosechados 14 días más tarde. Todas las señales de bioluminiscencia se midieron siguiendo el procedimiento y la configuración recomendada por el fabricante. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes representativas de la tinción histológica y de inmunofluorescencia. (A) Imagen de tinción representativa con H & E del tumor MCF7 teniendo tejido óseo después de la inyección de la arteria intra-ilíaca. Barra de escala = 25 micras. Nota: tinción HE no es la manera eficaz para detectar tumores. En menor aumento, SE tinción no es lo suficientemente sensible para distinguir tumores. En un aumento mayor, no es eficiente para escanear todos los areas. (B) Imágenes de la tinción de inmunofluorescencia de tejido óseo portador de un tumor MCF7. Verde: células MCF7 GFP-etiquetados, rojo en la imagen de la izquierda: los osteoblastos marcados con ALP, rojo en la imagen de la derecha: osterix-etiquetados pre-osteoblastos. Azul DAPI tinción indica el núcleo. Barra de escala = 25 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aunque sólo la arteria ilíaca es el objetivo de la inyección de las células cancerosas, se recomienda la separación de ambos vena iliaca y la arteria de los tejidos circundantes, y para levantarlos juntos como un paquete. Esto se debe a la vena y la arteria ampliamente contacto entre sí, y la pared del vaso venoso es delgada y es fácil de romper. Por lo tanto, para que una inyección de éxito, que ahorra tiempo y esfuerzo para sostener los dos vasos juntos, aunque se inyectan células cancerosas sólo a la arteria. Una sutura de seda 4-0 se utiliza para ayudar en este proceso, como se muestra en la Figura 2. La sutura también puede ayudar a detener el sangrado en caso de producirse.
La mayoría de las medidas de inyección de AII deben realizarse bajo el microscopio de disección. Los vasos de ratón son suaves y pequeña, lo que hace que los procedimientos desafiante. Sin embargo, después de la práctica suficiente, la tasa de éxito puede llegar al 90 - 100% de nuestra experiencia.
Con esta técnica, los investigadores pueden ser unable para establecer modelos de colonización ósea de sus modelos celulares de cáncer de favoritos, incluidos los que tradicionalmente se pensaba "no metastásico". MCF-7 células representan un ejemplo de ello. En efecto, al llegar en el microambiente de la médula, las células MCF-7 células se someten a una breve latencia antes de despegar para colonizar. Muy pocas metástasis óseas espontáneas se han detectado en animales portadores de ortotópico xenoinjertos MCF-7. Sin embargo, el fallo puede muy bien ser el resultado de la cantidad residual de células tumorales diseminadas, el lento inicio de la colonización y el crecimiento más agresivo de los tumores ortotópico (que mata a los animales antes de las lesiones óseas pueden establecer). Por lo tanto, la falta de detección no puede ser tomada como evidencia en contra de la capacidad de las células MCF-7 células para producir metástasis. De hecho, las micrometástasis óseas indolentes o incluso latentes pueden ser más frecuentes en los pacientes con cáncer de mama humano, como se sugiere por la inactividad años a décadas que se ve a menudo en la clínica.
inyección IIA se puede aplicar no sólo a luminal o células de cáncer de mama basales, sino también a otros tipos de cáncer como el cáncer de próstata. Cuando se combina con diferentes opciones de la enfermedad ósea de vigilancia técnicas, la inyección de la arteria ilíaca intra-puede hacer una contribución significativa para muchos fines de investigación. Utilizamos comúnmente señalización de bioluminiscencia para rastrear la progresión de la metástasis ósea después de la inyección de la arteria ilíaca intra, y luego los huesos que tienen tumores de cosecha para la tinción inmunohistoquímica fluorescente para definir las interacciones entre las células cancerosas y que rodean nichos microambiente de la médula. Bone histomorfometría 16-17 y 18-20 μCT se puede utilizar para evaluar alteraciones estructura ósea y otros detalles anatómicos de hueso que son causados por la inoculación de las células cancerosas. consideraciones características y combinaciones deben ser determinados por cada grupo para su propósito específico de investigación.
Al igual que en intra-tibial 8-10 y la inoculación intra-cardiaca 11-13, una advertencia de intra-ilinyección arteria IAC es que no recapitula los primeros pasos en el proceso metastásico antes de la embolia y la entrada de las células tumorales en la circulación. Idealmente, sería necesario un proceso de metástasis espontánea a partir de tumores ortotópico de recapitular completamente la cascada de la metástasis. Sin embargo, este proceso es muy ineficiente en la mayoría de los modelos, con sólo unas pocas excepciones, como algunos de hueso-4T1 trópico sub-clones 5-6 y MSP sobreexpresa PYMT modelo de ratón transgénico 7. Esperamos que la inyección de AII proporcionará nuevos conocimientos sobre el proceso de colonización del hueso, lo que puede a su vez facilitar el diseño y desarrollo de modelos de metástasis ósea espontáneas verdaderamente eficientes para los estudios pre-clínicos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Pen/Strep Amphatericin B | Lonza Biowhittaker | 17-745E | |
| PBS | Lonza Biowhittaker | 17-516F | |
| Trypsin/EDTA solution | HyClone | SH30042.01 | |
| 45 μM cell strainer | VWR International Laboratory | 195-2545 | |
| MediGel CPF with carprofen | Controlled item from veterinary care in BCM | For pain management | |
| Buprenorphine | Controlled item from veterinary care in BCM | For pain management | |
| Estradiol pellet | Innovative Research of America | SE-121 | |
| Ketamine and xylazine | Controlled item from veterinary care in BCM | ||
| Vet ointment | Controlled item from veterinary care in BCM | Avoid eye dryness | |
| Shaver | Oster | 78005-050 | For furred mice |
| Isopropyl ethanol | ACROS | 67-63-0 | |
| Betadine surgical scrub | Controlled item from veterinary care in BCM | ||
| #10 scalpel blades | Ted Pella, Inc | 549-3CS-10 | Multiple |
| No. 3 handle | Ted Pella, Inc | 541-31 | Need to be autoclaved |
| Sterile surgical drape | Sai Infusion Technology | PSS-SD1 | |
| Straight forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5132 | Need to be autoclaved |
| Straight fine forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | Need to be autoclaved |
| Edged fine forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | Need to be autoclaved |
| 4-0 Vicryl silk suture | Johnson & Johnson Health Care | J214H | |
| 31 G insuline syringes | BD | 328418 | Multiple |
| Q-tips cotton swabs (Sterile) | VWR International Laboratory | 89031-272 | |
| Skin glue | Henry Schein Animal Health | 31477 | For surgery site skin closure |
| Ear Tag Applicator | Fine Science Tools | 24220-00 | |
| Ear tags | Fine Science Tools | 24220-50 | |
| D-luciferin | Gold Biotechnology | LUCK | Avoid light and put on ice |
| 28 G insulin syringes | BD | 329410 | For intra-orbital injection |
| Paraformadehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation |
| EDTA | OmniPur | 4050 | For bone tissue decalficication |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E stereo | |
| IVIS Lumina II imaging system | Advanced Molecular Vision | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-GFP antibodies (JL-8) | Clontech | 632381 | |
| Anti-ALP antibodies | Abcam | ab108337 | |
| Anti-Osterix antibodies | Abcam | ab22552 |
References
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