siRNA-Transfektion und EMSA-Analysen auf frisch isolierten menschlichen Villöse Cytotrophoblasten

Adjimon Gatien Lokossou; Chirine Toufaily; Amandine Vargas; Benoit Barbeau

doi:10.3791/53995

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Methodenartikel

siRNA-Transfektion und EMSA-Analysen auf frisch isolierten menschlichen Villöse Cytotrophoblasten

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DOI:

10.3791/53995

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20. September 2016

Adjimon Gatien Lokossou¹ , Chirine Toufaily² , Amandine Vargas³ , Benoit Barbeau¹

¹Department of Biological Sciences, University of Quebec in Montreal, ²Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, ³Department of Clinical Sciences, University of Montreal

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur siRNA effizient transfizieren in frisch isolierten menschlichen villöse Zytotrophoblasten Verwendung Mikroporation und Identifizieren von DNA-Protein-Komplexe in diesen Zellen. Transfizierte Zellen können durch Western-Blot überwacht werden und EMSA-Analysen während der 4-tägigen Kulturzeit.

Zusammenfassung

Menschliche primäre Zottenzytotrophoblasten sind eine sehr nützliche Quelle für Primärzellen, um Plazentafunktionen und Regulationsmechanismen zu untersuchen und Krankheiten im Zusammenhang mit Schwangerschaft zu verstehen. In diesem Protokoll werden humane primäre Zottenzytotrophoblasten, die frisch aus der Plazenta durch ein Standard-DNase/Trypsin-Protokoll isoliert wurden, mit kleiner interferierender RNA (siRNA) mikroporiert. Dieser Ansatz führte zu einer höheren Effizienz der siRNA-Transfektion im Vergleich zu einer auf Lipofektion basierenden Methode. Transfizierte Zellen können anschließend innerhalb eines Zeitrahmens von 3-4 Tagen nach der Transfektion mittels Standard-Western-Blot analysiert werden. Darüber hinaus wurde unter Verwendung kultivierter primärer villöser Zytotrophoblasten die EMSA-Analyse (Electrophoretic Mobility Shift Assay) optimiert und an Extrakten von Tag 1 bis 4 durchgeführt. Die Verwendung dieser kultivierten Primärzellen und das beschriebene Protokoll ermöglichen eine Bewertung der Bedeutung spezifischer Gene und Transkriptionsfaktoren im Prozess der Differenzierung von villösen Zytotrophoblasten in eine Synzytiotrophoblasten-ähnliche Zellschicht. Die begrenzte Zeitspanne, die in der Kultur zulässig ist, schließt jedoch die Verwendung von Methoden aus, die mehr Zeit erfordern, wie z. B. die Erzeugung einer stabilen Zellpopulation. Daher erfordert die Untersuchung dieser Zellpopulation hochoptimierte Gentransferprotokolle.

Einleitung

Die Plazentafunktionsstörung des Menschen ist mit der Entwicklung mehrerer schwangerschaftsassoziierter Krankheiten wie Präeklampsie und intrauteriner Wachstumseinschränkung ¹ verbunden. Ein wichtiger Zellbestandteil der Plazenta sind die Trophoblasten, die entweder als extravillöse oder als zottenartige Zytotrophoblasten klassifiziert werden können. Nach der Fusion differenzieren sich die villösen Zytotrophoblasten weiter in die Synzytiotrophoblastenschicht, eine mehrkernige Zellstruktur, die eine wichtige Rolle beim feto-maternalen Austausch und der Hormonproduktion spielt ². Menschliche primäre villösen Zytotrophoblasten und ihre differenziert....