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Methodenartikel

siRNA-Transfektion und EMSA-Analysen auf frisch isolierten menschlichen Villöse Cytotrophoblasten

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DOI:

10.3791/53995

⸱

20. September 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Quebec in Montreal, 2Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, 3Department of Clinical Sciences, University of Montreal

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur siRNA effizient transfizieren in frisch isolierten menschlichen villöse Zytotrophoblasten Verwendung Mikroporation und Identifizieren von DNA-Protein-Komplexe in diesen Zellen. Transfizierte Zellen können durch Western-Blot überwacht werden und EMSA-Analysen während der 4-tägigen Kulturzeit.

Zusammenfassung

Menschliche primäre Zottenzytotrophoblasten sind eine sehr nützliche Quelle für Primärzellen, um Plazentafunktionen und Regulationsmechanismen zu untersuchen und Krankheiten im Zusammenhang mit Schwangerschaft zu verstehen. In diesem Protokoll werden humane primäre Zottenzytotrophoblasten, die frisch aus der Plazenta durch ein Standard-DNase/Trypsin-Protokoll isoliert wurden, mit kleiner interferierender RNA (siRNA) mikroporiert. Dieser Ansatz führte zu einer höheren Effizienz der siRNA-Transfektion im Vergleich zu einer auf Lipofektion basierenden Methode. Transfizierte Zellen können anschließend innerhalb eines Zeitrahmens von 3-4 Tagen nach der Transfektion mittels Standard-Western-Blot analysiert werden. Darüber hinaus wurde unter Verwendung kultivierter primärer villöser Zytotrophoblasten die EMSA-Analyse (Electrophoretic Mobility Shift Assay) optimiert und an Extrakten von Tag 1 bis 4 durchgeführt. Die Verwendung dieser kultivierten Primärzellen und das beschriebene Protokoll ermöglichen eine Bewertung der Bedeutung spezifischer Gene und Transkriptionsfaktoren im Prozess der Differenzierung von villösen Zytotrophoblasten in eine Synzytiotrophoblasten-ähnliche Zellschicht. Die begrenzte Zeitspanne, die in der Kultur zulässig ist, schließt jedoch die Verwendung von Methoden aus, die mehr Zeit erfordern, wie z. B. die Erzeugung einer stabilen Zellpopulation. Daher erfordert die Untersuchung dieser Zellpopulation hochoptimierte Gentransferprotokolle.

Einleitung

Die Plazentafunktionsstörung des Menschen ist mit der Entwicklung mehrerer schwangerschaftsassoziierter Krankheiten wie Präeklampsie und intrauteriner Wachstumseinschränkung 1 verbunden. Ein wichtiger Zellbestandteil der Plazenta sind die Trophoblasten, die entweder als extravillöse oder als zottenartige Zytotrophoblasten klassifiziert werden können. Nach der Fusion differenzieren sich die villösen Zytotrophoblasten weiter in die Synzytiotrophoblastenschicht, eine mehrkernige Zellstruktur, die eine wichtige Rolle beim feto-maternalen Austausch und der Hormonproduktion spielt 2. Menschliche primäre villösen Zytotrophoblasten und ihre differenzierten Gegenstücke stellen wichtige biologische Proben dar und ermöglichen es den Forschern, eine Reihe von plazentabezogenen Prozessen, wie z. B. die Zellfusion, in Kultur zu untersuchen. Darüber hinaus werden erhebliche Anstrengungen unternommen, um Marker zu identifizieren, die ein angemessenes Management erleichtern und präventive Therapien speziell für schwangerschaftsbedingte Krankheiten verbessern. Laboratorien isolieren routinemäßig primäre humane Zottenzytotrophoblasten aus frischen Plazenten unter Verwendung eines Standardisolationsverfahrens, das auf dem Trypsinverdau von Plazentazotten basiert 3. Da kultivierte Zytotrophoblasten in Kultur 4 ihre Fähigkeit zur Proliferation und schnellen Differenzierung in einer Synzytiotrophoblasten-ähnlichen Schicht verlieren, sind sehr effiziente Transfektionsmethoden und optimierte Analyseansätze erforderlich. Frühere Studien haben optimale Bedingungen für die Transfektion dieser primären Zytotrophoblasten bestimmt 5. Hierin wird eine andere Methode der siRNA-Transfektion vorgestellt, die zuvor in diesem Zelltyp 6 getestet wurde. Im Vergleich zu einem auf Lipofektion basierenden Ansatz verbessert diese Mikroporationsmethode die Transfektion, was anhand des Ausmaßes der Stilllegung bestimmter Gene beurteilt wird.

Promotor- und Genexpressionsstudien liefern auch ein besseres Verständnis der Plazentafunktion. Obwohl es aufgrund des kurzen Zeitrahmens, in dem primäre villoue Zytotrophoblasten kultiviert werden können, schwieriger anzuwenden ist, können Promotoranalysen mit Standardprotokollen dennoch durchgeführt werden, wie bereits veröffentlicht 7. Der Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) ist eine dieser häufig verwendeten In-vitro-Methoden, die eine schnelle und einfache Überwachung von DNA-Protein-Wechselwirkungen ermöglicht. Kernextrakte aus diesen primären Trophoblasten wurden verwendet, um eine Region des Syncytin-2-Promotors auf spezifische Wechselwirkungen zu testen. Die Ergebnisse zeigten, dass gebundene Faktoren zu verschiedenen Zeitpunkten der Kultur und auf spezifische und reproduzierbare Weise nachgewiesen werden konnten.

Die in diesem Protokoll präsentierten Daten bestätigen, dass unser Transfektionsansatz und das EMSA-Protokoll für isolierte primäre vilöse Zytotrophoblasten verwendet werden können und von großem Nutzen sein werden, um die vielfältigen Funktionen von villösen Zytotrophoblasten unter normalen oder pathologischen Zuständen zu untersuchen.

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Protokoll

Die UQAM Ethikkommission hat diese Protokolle genehmigt, die in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Ethikkommission von St-Luc-Krankenhaus des Centre Hospitalier Universitaire de Montréal (Montréal, Kanada) sind. Die Teilnehmer unterzeichneten eine Einwilligungserklärung.

1. Medium Herstellung und Isolierung von primären Villöse Cytotrophoblasten

  1. Bereiten Kulturmedium für menschliche primäre villous Zytotrophoblasten von Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 25 mM HEPES ergänzt, 10% Fetal Bovine Serum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin. Filtern Sie das fertige Medium durch sterile 0,22-um-Filter und Speicher in einem -20 ° C Gefrierschrank in Aliquots von 50 ml.
  2. Isolieren primäre villous Cytotrophoblasten aus frischen Plazenten nach Standardprotokollen 3.
    1. Mit einer Zange, entfernen Sie die fötalen Membran aus dem Gewebe durch leichtes Kratzen aus, während man aufpassen, nicht Zottengewebe zu entfernen. Schneide dasRest Plazentazotten in Würfel von ca. 3 x 3 cm unter Verwendung von Skalpell und Schere. Gründlich mit Wasser waschen, die 0,9% NaCl mütterlichen Blut zu entfernen.
      1. jeden Würfel mit einer Zange festhalten und vorsichtig die Zottengewebe aus verbleibenden Schiffe und Fasergewebe mit einer Schere entfernen.
      2. 15 bis 30 mg Zottengewebe, verdauen viermal in Hanks balancierter Salzlösung (HBSS) , enthaltend Trypsin (von 9,6 x 10 5 bis 1,8 x 10 & sup6 ; U; Endkonzentration 1,2 mg / ml) und Desoxyribonuclease I (DNase I) ( Endkonzentration 200 ug / ml) für 30 min bei 37 ° C in einem Wasserbad unter kontinuierlichem Schütteln inkubiert.
        Hinweis: Verwenden Sie 150 ml Gesamtvolumen für die erste Verdauung, 100 ml für die zweite Verdauung und 75 ml für die beiden verbleibenden Aufschlüsse.
    2. Die überstehende Flüssigkeit enthält, dispergiert Zellen und Zentrifuge bei 1250 × g für 15 min ohne Bremse. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in 1 ml vorgewärmtem DMEM, enthaltend1% Penicillin / Streptomycin.
    3. Schicht die dispergierten Zellen auf einem diskontinuierlichen 5% - 70% Polyvinylpyrrolidon beschichtetes Siliciumdioxid - Gradienten (siehe Tabelle 1 für Gradienten Vorbereitung) und Zentrifuge für 23 min bei 507 xg ohne Bremse. Entfernen Sie die Dichte Schicht zwischen 1,017-1,033 durch Absaugen und sammeln die Schichten zwischen 40% und 50% in der Steigung mit einer neuen Pipette. Waschen Zellen extensiv mit 10 ml vorgewärmtem DMEM, enthaltend 1% Penicillin / Streptomycin.
      Hinweis: Die gesammelte Fraktion entspricht Dichten zwischen 1,048 und 1,062, die Trophoblasten birgt.
    4. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Kurz gesagt, Zellen mischen und 10 & mgr; l in einem neuen Reaktionsgefäß hinzu. In 10 ul Trypanblau und mischen wieder sanft. Zeichnen Sie die Zellsuspension und füllen die Hemocytometer Kammern. Zählen Sie die Zellen unter 10X-Objektiv.
    5. Platzieren 1 x 10 6 und 4,5 x 10 6 Zellen in separate Röhren für die Verwendung in den Abschnitten 1.3 und 2, jeweilsly. Samen der verbleibenden Zellen in einer Dichte von 1,5 x 10 6 Zellen / Vertiefung in ergänztem DMEM - Medium und die Kultur bei 37 ° C und 5% CO 2 für maximal 4 Tage für andere Experimente.
  3. Bewertung der Reinheit der isolierten primären villous Cytotrophoblasten
    1. Spin 1 x 10 6 der frisch isolierten Zytotrophoblasten in Mikrozentrifugenröhrchen bei 300 x g. Überstand verwerfen und 1 ml vorgewärmtem phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Centrifuge Zellen bei 300 g und entfernen PBS durch Absaugen.
    2. 1 ml kaltem Methanol zu den Zellen und inkubiere bei -20 ° C für 20 min. Zentrifugen Zellen bei 300 xg für 5 min und Methanol durch Absaugen entfernen.
      Achtung: Verwenden Sie Kanister Maske, Schutzbrille und Gummihandschuhe, während Umgang mit Methanol.
    3. 1 ml PBS bei Raumtemperatur Zellen, Zentrifuge bei 300 g rehydrieren und entfernen PBS durch Absaugen.
    4. Inkubiere Zellen in PBS, enthaltend FBS (01.50 [v / v] Verdünnung) und einen FcRBlockierungsreagenz (1:10) für 45 min bei Raumtemperatur nicht-spezifische Bindung zu eliminieren.
    5. Zweimal waschen mit 500 ul Raumtemperatur PBS, Zentrifuge Zellen bei 300 g für 5 min und entfernen PBS durch Absaugen. Die Zellen in 100 & mgr; l Raumtemperatur PBS.
    6. Inkubiere Zellen mit einem monoklonalen Maus-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) -konjugiertem anti-human Cytokeratin-7-Antikörper-Klon LP5K (1: 200) oder ein Steuer Isotyp-nicht-spezifischen Antikörper in PBS 0,2% BSA für 45 min bei Raumtemperatur enthält, in die Dunkelheit. Waschen Zellen in PBS.
    7. Analyse der Zellen mittels Durchflusszytometrie 3. Verwenden Zellpräparationen, die mindestens 96% CK-7-positive Zellen mittels Durchflusszytometrie für weitere Experimente demonstrieren.

2. siRNA-Transfektion von primären humanen Villöse Cytotrophoblasten

  1. Die Transfektion von primären humanen villous Cytotrophoblasten eine Mikroporationseinrichtung mit
    1. Bereiten 6-well-Platten, enthaltend2 ml des ergänzten DMEM-Medium für die Inkubation von Zellen microporated.
    2. Nach der Isolierung von primären Cytotrophoblasten, nehmen Sie eine aliquote Menge von Zellen in Suspension (siehe Abschnitt 1.2) und die Zellzahl unter Verwendung einer Zählkammer bestimmen.
    3. Übertragen 1,5 x 10 6 Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei Raumtemperatur. Waschen der Zellen mit 1 ml Dulbeccos PBS (DPBS) (Mg 2+, Ca 2+ -frei) , und die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei Raumtemperatur pelletieren.
    4. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen vorsichtig in 100 ul Resuspensionspuffers.
      Hinweis: Vermeiden Zellsuspension länger als 15-30 Minuten bei Raumtemperatur gehalten wird, die Lebensfähigkeit der Zellen und die Transfektionseffizienz zu maximieren.
    5. In 300 ng Syncytin-2 siRNA (oder Kontrollschlüsselten siRNA) in die 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und absaugen Zell-siRNA Mischung 100 ul Transfektion Pipette. Einfügendie Pipette in die Station (siehe Materialliste) und die Zellen zu einem 1300 V einzigen Impuls von 30 ms unterziehen.
    6. Sofort übertragen die Zellen zu Platten mit 6 Vertiefungen (hergestellt in Schritt 2.1.1), die 37 ° C vorgewärmten ergänztem Medium Zellschäden zu vermeiden.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.5 und 2.1.6 für die restlichen Proben.
    8. Schütteln Sie die Platte für 30 Sekunden eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Inkubieren der Platte bei 37 ° C in einem befeuchteten CO 2 -Inkubator für 24 bis 48 Stunden. Aktualisieren Kulturmedium 24 Stunden nach der Transfektion.
    9. Transfektionseffizienz durch Western-Blot-Analyse auswerten (siehe Schritte 3 bis 6).
  2. Lipofektion von siRNA in menschliche primäre Cytotrophoblasten
    1. Nach der Isolierung von Zotten - Zytotrophoblasten, die Zellen bei einer Dichte von 1,5 x 10 6 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen in 2 ml Kulturmedium Saatgut und 18 Stunden inkubieren.
    2. Verdünnen 300 ng Syncytin-2-spezifische siRNA (oder SteuerschlüsseltensiRNA) und 5 ul Lipidbasis Transfektionsreagenz in getrennten 1,5 ml-Röhrchen in einem Gesamtvolumen von 10 ul antibiotika und serumfreien Medium. Inkubieren für 5 min.
    3. Mischen der verdünnten Reagenzien und Inkubation für weitere 20 min bei Raumtemperatur der Transfektionskomplex zu bilden. Hinzufügen 90 ul antibiotika und serumfreies Medium zur Mischung bis zu einem Endvolumen von 100 ul.
    4. Entfernen Kulturmedium von den Platten mit 6 Vertiefungen (Schritt 2.2.1). 2 ml frischem Medium und 100 & mgr; l Transfektionsgemisch zu jeder Vertiefung. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator für 24 bis 48 Stunden. Aktualisieren Kulturmedium 24 Stunden nach der Transfektion.
    5. Transfektionseffizienz durch Western-Blot-Analyse auswerten (siehe Schritte 3 bis 6).

3. Herstellung von Lysaten aus Vollzellkultur

  1. Entfernen Sie die Medien und spülen jede Vertiefung (aus den Schritten 2.1.8 und 2.2.4) unter Verwendung von vorgewärmten DPBS (Mg 2+, Ca 2+ frei). Saugen Sie das DPBS und fügen 500 ul 0,25% Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Inkubieren für 1-3 min bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator. Stop Trypsin-Behandlung durch Zugabe von 500 & mgr; l serumhaltigen Nährmedien.
    Hinweis: Verwenden Sie geeignete Datenträger nach der Art von Kolben / Schale: 1 ml pro 10 7 Zellen / 100 mm Schale / 150 cm 2 Kolben; 0,5 ml pro 5 x 10 6 Zellen / 60 mm - Schale / 75 cm 2 -Kolben.
  2. Transfer-Zellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugen-Röhrchen, Pellets Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen mit DPBS (Mg 2+, Ca 2+ -frei) und Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei Raumtemperatur.
  3. Entfernen Sie vorsichtig Überstand, ohne das Pellet zu stören. Das Röhrchen auf Eis. Das Pellet in 50-200 ul eiskalter Radio Immunopräzipitation - Assay (RIPA) Puffer (Tabelle 2 für die Pufferzusammensetzung sehen) mit frisch hinzufügened-Protease und Phosphatase-Inhibitoren bei einer 1x Endkonzentration. Kurz gesagt, verwirbeln das Rohr und für 30 min auf Eis belassen.
  4. Spin bei 16.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Legen Sie das Röhrchen auf Eis. Mit einer Pipette den Überstand in ein frisches vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis gehalten. Entsorgen Sie das Pellet.

4. Herstellung von Kernextrakten aus kultivierten Zellen

  1. Für jede Vertiefung (Schritt 1.2.5), waschen kultiviert Cytotrophoblasten zweimal mit 1 ml vorgewärmtes DPBS (Mg 2+, Ca 2+ frei). Absaugen DPBS und fügen 500 ul 0,25% Trypsin / EDTA. Inkubieren für 1-3 min bei 37 ° C in einem CO 2 Inkubator und Trypsin - Behandlung zu stoppen durch Zugabe von 500 & mgr; l Serum , das Wachstumsmedium.
  2. Transfer-Zellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugen-Röhrchen, Pellets Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen mit DPBS (Mg 2+, Ca 2+ -frei) und Pellet Zellen durch Zentrifugationbei 300 × g für 2 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig alle Überstand, ohne das Pellet zu stören und das Röhrchen auf Eis legen.
  3. Extrahieren Kernprotein nach den Anweisungen des Herstellers. Bestimmen der Proteinkonzentration jeder Probe unter Verwendung von Proteinquantifizierung Assay (Bradford oder Bicinchoninsäure (BCA)).

5. Probenvorbereitung und Elektrophorese

  1. Bestimmung der Proteinkonzentration für jeden Zellextrakt unter Verwendung eines Protein - Quantifizierungsassay (zB Bradford 8 oder 9 BCA).
  2. Gemäß den Anweisungen des Herstellers (wenn Antikörper in Reduktion und Denaturierung Bedingungen verwendet werden könnte), ein gleiches Volumen von 2 × Laemmli Probenpuffer (Tabelle 2) auf 20-30 & mgr; g Gesamtprotein.
  3. Boil Zelllysaten bei 100 ° C für 5 min. Aliquotieren 50-100 ul Lysat wiederholt Frost / Tau-Zyklen zu vermeiden, und speichern Sie die restlichen Röhrchen bei -20 ° C für die zukünftige Verwendung.
  4. Während die Proben erhitzt, bereiten 1 l 1x Laufpuffer (Tabelle 2).
  5. Drehen Sie die Proben bei 16.000 × g für ein paar Sekunden und legen Sie sie auf Eis.
  6. Last gleich Menge an Protein in jeder Vertiefung einer 12% SDS-PAGE - Gel (siehe Tabelle 2 für Gelzusammensetzung), zusammen mit einem Molekulargewichtsmarker. Führen des Gels über 1 bis 2 Stunden bei 100 V.

6. Übertragung des Proteins aus dem Gel auf die Membran

  1. Aktivieren Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran mit Methanol für 1 min und Spülen mit 1x Transferpuffer / 10% Methanol-Lösung. Nach den Anweisungen des Herstellers, Transfer für 30 min bis 1 Stunde in Abhängigkeit von der Proteingröße.
    Hinweis: Die Übertragungswirksamkeit beurteilt werden kann, mit Ponceau-Rot-Färbung vor dem Blockierungsschritt.

7. Antikörper-Färbung

  1. Blockieren die Membran für 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C mit 5% Blockierungslösung.
  2. Inkubieren der Membran mit anti-Syncytin-2 - Antikörper (4 ug / ml; 1: 5.000) 6 oder mit anti-Glyceraldehyd-3-phosphat - Dehydrogenase (GAPDH; 0,4 & mgr; g / ml; 1: 500) in 5% Blockierungslösung über Nacht bei 4 ° C (anti-Syncytin-2) oder für 45 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Membran dreimal in Tris-gepufferter Saline Tween (TBST; siehe Tabelle 2 für die Pufferzusammensetzung) für 5 min.
  3. Inkubieren der Membran mit geeigneten Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugiertem anti-Kaninchen- oder anti-Maus-Antikörper (1: 10.000) in 5% für 1 Stunde in TBST-Puffer bei Raumtemperatur blockiert. Waschen Sie die Membran dreimal in TBST für 5 min und dann in TBS spülen. Ermitteln Sie Signale, die die Chemilumineszenz-basierte Blotting Substrat verwendet wird.

8. Die radioaktive Markierung von Einzel Oligonukleotids

  1. Phosphorylierungsreaktion
    1. In einem Reaktionsgefäß werden 50 ng eines Forward-Oligonukleotid zusammen mit 1x T4 Polynukleotidkinase Puffer, 1 UT4 - Polynucleotidkinase und 20 & mgr; Ci (γ- 32 P) ATP und bilden das Reaktionsvolumen auf 20 ul mit Nuklease-freies Wasser.
    2. für 30 min bei 37 ° C inkubieren. Die Reaktion durch Zugabe von 5 ul 0,5 M EDTA. Machen Sie das Volumen auf 50 ul mit Nuklease-freies Wasser.
  2. Die Entfernung von nicht eingebauten Nukleotiden von Oligonukleotiden
    1. Bereiten einer G-25 - Säule , äquilibriert mit TE - Puffer (Tabelle 2) nach den Anweisungen des Herstellers. Die Säule in einem frischen DNase-freies 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    2. Langsam 50 ul Sonde (aus Schritt 8.1.2) über das Harz, wobei darauf geachtet, nicht das Harzbett zu stören. Spin 2 min bei 350 xg das gereinigte Probe in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu sammeln. Waschen Sie die G-25-Säule mit 36 ​​ul Nuklease-freies Wasser und Spin 2 min bei 350 xg es im Reaktionsgefäß zu sammeln.
  3. Die Hybridisierung mit dem komplementären Strang oligonucleotide
    1. Übertragung der radiomarkierten Sonde (86 ul) in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und mit 200 ng des Reverse - Oligonukleotids und 1x Annealing - Puffer (Tabelle 2). Hitze 5 min bei 95 ° C und lässt über Nacht bei Raumtemperatur für die Kühlung.
    2. Vorbereitung nicht-radioaktive doppelsträngigen Oligonucleotide durch Zugabe von 50 ng unmarkierter Vorwärts- und Rückwärts Oligonukleotiden und 1x von Anelierungspuffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Machen Sie das Volumen auf 100 ul mit Nuklease-freies Wasser. Wärme und halten bei Raumtemperatur, wie in Schritt 8.3.1 beschrieben.

9. Herstellung eines nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel für EMSA

  1. Bereiten Sie eine 4% nativen Gel (10 x 12 cm) mit einem 1,5 mm platz Kamm (Tabelle 2 für Gelzusammensetzung sehen). Reinigen Sie alle Glasplatten mit destilliertem Wasser.
    Hinweis: Es ist wichtig, daß die Platten aus ionischen Detergens vollständig frei sein, wie SDS.
  2. unmittelbar punsere die Acrylamidlösung in zwischen den Platten und erlauben Polymerisation (ca. 30 min), um fortzufahren.
  3. Montieren Sie die Elektrophorese-Vorrichtung und füllen den Tank mit 0,5x TBE. das Gel für 30 Minuten bis 1 Stunde bei 150 V Vor dem Probenvorlauf.

10. DNA-Bindungsreaktion

  1. In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, mit 10 ug Kernextrakt (Schritt 4.3) 1x Gel Shift Bindungspuffer (Tabelle 2) und das Endvolumen auf 10 ul mit Nuklease-freiem Wasser bilden. Als Kontrolle wurde ein Rohr ohne Kernextrakt herzustellen. Für die kompetitive Reaktion nach Zugabe von 1 & mgr; l kaltem unspezifischen oder spezifischen doppelsträngigen Oligonukleotids (Schritt 8.3.2).
  2. In 1 ul radioaktive Sonde aus Schritt 8.3.1 zu jeder Reaktion. Inkubieren der Reaktion bei Raumtemperatur für 20 min. In 1 ul 10x Gelladepuffer pro Reaktion und laden jede Probe auf dem in Abschnitt vorbereitet Gel 9.
  3. Führen Sie das Gel für 1 1/2 bis 2 Stunden bei 150 V. Nach der Migration, wickeln Sie das Gel und das Glas in einer Plastikfolie und Position in einer Belichtungskassette unter einen Phosphorschirm. Verlassen Kassette bei 4 ° C für 24 Std.
  4. Entfernen Sie den Bildschirm von der Belichtungskassette und legen Sie in der Phosphor-Bildgerät zum Scannen.

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Ergebnisse

Frische Plazenten von Begriff Schwangerschaften wurden verwendet, um menschliche primäre villous Cytotrophoblasten zu isolieren, die Reihe von Experimenten im Protokoll Abschnitt vorgestellt zu leiten. Nach ihrer Trennung analysierten wir zunächst die Reinheit des Cytotrophoblasten durch die Verwendung des Cytokeratin-7 - Marker (Abbildung 1). Zellpräparate wurden so gefärbt einen monoklonalen anti-Cytokeratin-7 - Antikörper verwendet wird . Abbildung 1 ...

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Diskussion

Studien über die menschliche Plazentafunktion und Entwicklung wurden durch Protokolle stark verbessert bei der Optimierung Isolierung verschiedener Plazenta-Zellpopulationen gerichtet. Eines der besten erforschten Plazenta Zellpopulation bleibt die Villi Cytotrophoblasten, die Studie davon aus optimierte Protokolle ermöglicht eine effiziente und zuverlässige Isolation stark profitiert hat. Dies hat ferner eine Anzahl von Experimenten, wie Transfektion und Promotorstudien erlaubt. Unter Verwendung eines zuvor beschrieben...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der National Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (# 298527) (BB) unterstützt. CT wurde von einem institutionellen FARE Stipendium unterstützt. AV wurde durch einen NSERC Graham Bell Ph.D. unterstützt Stipendium. BB hielt einen Canada Research Chair in Menschen Retrovirology (Tier 2). Dank Beatrix Beisner um Hilfe bei der Überarbeitung des Textes.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
HBSS ohne  Ca2+, Mg2+ Sigma#H2387
HBSS (10x)Sigma#14060-057
DMEM High Glucose ohne HepesGibco#12100-061
Hepes (1 M)Gibco#15630-080
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x)Gibco#15640-055
Amphotericin B Sigma#A2411
CaCl2Sigma#C4901
MgSO4.7H2O Sigma#M
Fötales RinderserumGibco#16170-078 
Percoll Sigma#P-1644Für den Dichtegradienten
Syncytin-2 siRNAAmbion Life Technologien#AM16708
Scrambled siRNAQiagen# SI03650318
DNase ISigma-Aldrich#D5025
Trypsin, Typ I Sigma#T8003
DharmaFECT Lipotransfektion  Reagenzien GEhealthcare# T-2001-01
Trypsin/EDTALife Technologies#25300-062
Protease-Inhibitor-CocktailRoche Diagnostic#11873580001
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific#23225
BSASigma#A7906
TWEEN 20Sigma#P9416 
Anti-Kaninchen-IgG, HRP-gebundener Antikörper Zellsignalisierung#7074
BM Chemilumineszenz Western Blotting Substrat (POD)Roche Diagnostik#11500708001
DPBS Life technologies#14287-080
T4 PolynukleotidkinaseNEB#M0201S
ATP, [γ-32P]Perkin Elmer#BLU002A100UC
AcrylmidSigma 
TEMEDLife Technologies#17919
AmmoniumpersulfatSigma 
Anti-humaner Cytokeratin-7-Antikörperklon LP5K, FITC-konjugiertesMilliporeCBL194FVerdünnung 1:200
FcR-Blockierungsreagenz Miltenyi Biotec130- 059-901Verdünnung 1:10
Durchflusszytometer BD Acuri SystemBecton Dickinson
Mikroporator MP-100 Gerät Digital Bio
Resuspension Buffer R (Neon-Transfektionssystem 100  &Mikro; l Kit)LebenstechnologienMPK10096 PVDF-Membran
 MilliporeIPVH00010 Mit Methanol aktivieren
Anti-Human-GAPDH-AntikörperSanta Cruz Biotechnologysc-1371791:500
Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper oder Anti-Maus-AntikörperCell Signalling#70741:10.000
Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-AntikörperCell Signalling#7076 1:10.000
NE-PER Reagenz für die nukleare und zytoplasmatische ExtraktionThermo Scientific#78833
G-25 Säule GE Healthcare#27-5325-01
Chemilumineszenz- und Fluoreszenz-BildgebungsgerätMontré al BiotechFusion FX5
4% natives GelHausgemacht
PBSHausgemacht1x
Personal Molecular Imager (PMI) SystemBioRad
#A9099#A3678

Referenzen

  1. Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 51, 970-975 (2008).
  2. Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta. 31, Suppl . S75-S81 (2010).
  3. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
  4. Morrish, D. W., et al. In vitro cultured human term cytotrophoblast: a model for normal primary epithelial cells demonstrating a spontaneous differentiation programme that requires EGF for extensive development of syncytium. Placenta. 18, 577-585 (1997).
  5. Forbes, K., Desforges, M., Garside, R., Aplin, J. D., Westwood, M. Methods for siRNA-mediated reduction of mRNA and protein expression in human placental explants, isolated primary cells and cell lines. Placenta. 30, 124-129 (2009).
  6. Vargas, A., et al. Syncytin-2 plays an important role in the fusion of human trophoblast cells. J. Mol. Biol. 392, 301-318 (2009).
  7. Toufaily, C., Lokossou, A. G., Vargas, A., Rassart, E., Barbeau, B. A CRE/AP-1-Like Motif Is Essential for Induced Syncytin-2 Expression and Fusion in Human Trophoblast-Like Model. PLoS One. 10, e0121468(2015).
  8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  9. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  10. Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
  11. Desforges, M., et al. The SNAT4 isoform of the system A amino acid transporter is functional in human placental microvillous plasma membrane. J. Physiol. 587, 61-72 (2009).
  12. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 7413-7417 (1987).
  13. Guilbert, L. J., et al. Preparation and functional characterization of villous cytotrophoblasts free of syncytial fragments. Placenta. 23, 175-183 (2002).
  14. Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
  15. Ma, B., Zhang, S., Jiang, H., Zhao, B., Lv, H. Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery. J. Control. Release. 123, 184-194 (2007).
  16. Freeley, M., Long, A. Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection. Biochem. J. 455, 133-147 (2013).

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