Rasterelektronenmikroskopie von Mazerierte Gewebe zu visualisieren die extrazelluläre Matrix

Summary

Hier ist eine Methode zur Visualisierung der extrazellulären Matrix-Ultrastruktur in dezellularisiertem Herzgewebe dargestellt.

Abstract

Fibrose ist ein Bestandteil aller Formen von Herzerkrankungen, unabhängig von der Ätiologie, und obwohl auf dem Gebiet der kardiologischen Matrixbiologie große Fortschritte gemacht wurden, gibt es immer noch große Lücken in Bezug darauf, wie die Matrix gebildet wird, wie sich physiologische und pathologische Umgestaltung unterscheiden und vor allem, wie die Matrixdynamik manipuliert werden könnte, um die Heilung zu fördern und die Fibrose zu hemmen. Es gibt derzeit keine Behandlungsmöglichkeit, um Herzfibrose zu kontrollieren, zu verhindern oder umzukehren. Ein Teil des Grundes ist wahrscheinlich die schiere Komplexität der kardialen Narbenbildung, wie sie nach einem Myokardinfarkt auftritt, um tote oder sterbende Kardiomyozyten sofort zu ersetzen. Die extrazelluläre Matrix selbst ist am Umbau beteiligt, indem sie ansässige Zellen aktiviert und auch dabei hilft, infiltrierende Zellen zur erloschenen Läsion zu führen. Die Matrix ist auch eine Art Speicherschrank für matrizelluläre Proteine, die für den normalen Matrixumsatz sowie für die fibrotische Signalübertragung entscheidend sind. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Matrix eine elektromechanische Rolle im Herzgewebe spielt. Die meisten Techniken zur Beurteilung der Fibrose sind nicht qualitativer Natur, sondern liefern quantitative Ergebnisse, die für den Vergleich zweier Gruppen nützlich sind, aber keine Informationen über die zugrunde liegende Matrixstruktur liefern. Hervorgehoben wird hier eine Technik zur Visualisierung der Ultrastruktur der Herzmatrix. Die Rasterelektronenmikroskopie von dezellularisiertem Herzgewebe zeigt auffällige Unterschiede in der Struktur, die mit herkömmlichen quantitativen Forschungsmethoden sonst übersehen würden.

Introduction

Fibrose stört das normale myokardiale Kollagennetzwerk, das für die normalen mechanistischen Funktionen der Kardiomyozyten ^{entscheidend ist 1,2} sowie für die interzelluläre Kommunikation, die intrazelluläre Signalübertragung und das Überleben der Zellen ³. Die Entwicklung von Fibrose ist eine wichtige Determinante der Herzfunktion, und der fibrotische Umbau des kardialen Interstitiums, der sich aus einer Vielzahl von Ätiologien ergibt, führt zu einer erhöhten linksventrikulären Steifigkeit und diastolischen Dysfunktion ⁴. Myokardfibrose kann auch zu Herzrhythmusstörungen führen, und unabhängig davon, ob es sich bei dem Fortschreiten des fibrotischen Umbaus um ein allgemeines oder lokales Phänomen handelt, ist es in hohem Maße mit einer schlechten Prognose bei Patienten mit ischämischer und nicht-ischämischer Kardiomyopathie verbunden ⁵. Ebenso ist das Fehlen einer Myokardfibrose ein starker Prädiktor für die Wiederherstellung der ventrikulären Funktion und das Langzeitüberleben ⁶.

Das Kennzeichen der Fibrose ist die Ablagerung von überschüssigem Kollagen, das die Zugfestigkeit von Stahl ⁷ hat und die Kardiomyozytenfunktion auf mehreren Ebenen nachteilig beeinflussen kann. Mechanische Kräfte, die sich aus einer übermäßig kollagenen Matrix ergeben, können zu Kardiomyozytenatrophie ^8,9, passiver Gewebesteifigkeit ¹⁰, tonischer kontraktionsinduzierter Myokardsteifigkeit ^11-13 und verminderter Sauerstoffzufuhr an die verbleibende Population von Kardiomyozyten führen. Die Gap-Junction-Kopplung von Kardiomyozyten und myoFbs kann auch die elektrischen Eigenschaften des Herzens beeinträchtigen, was ein höheres Risiko für die Entwicklung von Herzrhythmusstörungen darstellt ^14-16. Die perivaskuläre Fibrose verändert die vasomotorische Reaktivität der intramuralen Koronararterien und Arteriolen ¹⁷ und trägt zur luminalen Verengung bei, die die Sauerstoffversorgung und damit das Überleben der Kardiomyozyten verringert ^17-22. Pathogener fibrotischer und elektrischer Umbau, der von einer anfänglichen ischämischen Verletzung oder einem Energieungleichgewicht ausgeht, schreitet unweigerlich bis zur Herzinsuffizienz fort.

Kardiomyozytennekrose initiiert die fibrotische Reaktion, und nachfolgende nachteilige fibrotische Remodellierung kann unabhängig von der Ätiologie auftreten. Die Suche nach einem Weg zur Kontrolle der Herzfibrose wäre klinisch vorteilhaft für die Behandlung von ischämischen und idiopathischen Kardiomyopathien, hypertensiven Herzkrankheiten, hypertrophen Kardiomyopathien, Herzklappenerkrankungen und Dystrophinopathien ^23-42. Unabhängig davon, wie der fibrotische Krankheitsprozess beginnt, können lösliche, profibrotische Faktoren den interstitiellen Raum durchqueren und die Aktivierung von interstitiellen und adventitiellen Fibroblasten an Stellen provozieren, die von der anfänglichen fibrotischen Narbe entfernt sind, wodurch ein Kaskadeneffekt entsteht, der schließlich zu Herzinsuffizienz führt. Das optimale Szenario wäre, den fibrillogenen Prozess mit einem gezielten Therapeutikum auszunutzen, das während des kompensativen hypertrophen Stadiums der Kardiomyopathie angewendet werden kann, bevor es zu einem systolischen Pumpenversagen, einer diastolischen Herzinsuffizienz oder anderen Ergebnissen im Endstadium kommt. Das ultimative Ziel wäre es, die Fibrose rückgängig zu machen, so dass tote Kardiomyozyten ersetzt und die Herzfunktion vollständig wiederhergestellt werden kann.

Die Bedeutung der Matrix ist weithin bekannt, doch Methoden zur Untersuchung der Matrix beschränken sich hauptsächlich auf quantitative Messungen der wichtigsten Strukturkomponenten, insbesondere Kollagen, und relative Konzentrationen verschiedener Matrix- und matrizellulärer Proteine. Dieses Protokoll hebt eine selten verwendete Technik hervor, die zur Beurteilung qualitativer Unterschiede in der Herzmatrix nützlich ist. Diese Technik wurde kürzlich verwendet, um grundlegende Unterschiede in Herzmatrizen aus verschiedenen Ätiologien von Herzerkrankungen (in menschlichen Explantaten) zu vergleichen und gegenüberzustellen, um Herzen von Schweinen nach einem Infarkt zu untersuchen, die mit der Isoform des glialen Wachstumsfaktors (GGF) von Neuregulin-1β behandelt wurden, im Vergleich zu unbehandelten Tieren ⁴³, und um auf Unterschiede in den Matrizen von Herzgeweben aus mdx zu untersuchen Mäuse (ein häufig verwendetes Tiermodell der Duchenne-Muskeldystrophie) in unterschiedlichem Alter und im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen. Diese Technik wurde erstmals 1979 von Dr. Caulfield und Dr. Borg ^{eingeführt 44}, aber nur wenige Studien haben seitdem diese leistungsstarke Technik ^45-47 verwendet, die hier mit nur geringfügigen Modifikationen wieder eingeführt wurde. Diese Methodik ist ein wertvolles Forschungsinstrument, da sie qualitative Informationen über die Ultrastruktur der extrazellulären Matrix liefert, die sonst bei der einfachen Messung des Gehalts an Matrixkomponenten und/oder des Grades der Fibrose übersehen werden könnten.

Protocol

Ethik - Erklärung: Die Protokolle für die Behandlung der Tiere durch die Vanderbilt Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC genehmigt wurden, Protokolle Nummer M / 10/117 (Schweine) und M / 10/219 (Mäuse) und führte nach AAALAC-International - Standards. die Verwendung von überhöhten menschlichen Herzgewebe wurde von der Vanderbilt University Medical Center IRB (Protokollnummer 100887) genehmigt.

1. Probenentnahme und Lagerung

1. Machen Sie frisch 4% Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) Lösung.
   ACHTUNG: Glutaraldehyd ist giftig, Handschuhe tragen und die Arbeit in einem Abzug.
   1. Machen Sie eine 0,2 M Stammlösung von PB, pH 7,4 , unter Verwendung von 21,8 g Na ₂ HPO ₄ und 6,4 g NaH ₂ PO _4. Quantum satis (Qs) bis 1000 ml dH ₂ O.
   2. In 400 ul 50% Glutaraldehyd zu 2,5 ml PB - Stammlösung und 2,1 ml dH ₂ O.
2. Tauchen Sie ein Stück (nicht größer als 2 cm ²⁾ von Gewebe in 4% Glutaraldehyd - Lösung. Hinweis: Kleinere Stücke können auch verwendet werden , aber von ausreichender Größe (nicht kleiner als 5 mm ²⁾ sein sollte , leicht mit dem Auge , um sichtbar gemacht zu werden , um spätere Schritte des Protokolls erleichtern.
3. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde, dann speichern Sie auf unbestimmte Zeit bei 4 ° C.

2. Dezellularisierung von Herzgewebe

1. Machen Sie frische 10% ige wässrige NaOH - Lösung unter Verwendung von 10 g NaOH - Pellets / 100 ml dH ₂ O.
   ACHTUNG: NaOH-Lösungen sind korrosiv und kann Alkali-Verbrennungen verursachen, tragen Handschuhe.
2. Spülen Sie Gewebe in dH ₂ O.
3. Inkubieren in 10% NaOH-Lösung bei Raumtemperatur für 6 bis 10 Tage (bis Gewebsveränderungen von rötlich-braun bis weißliche oder weiß).
4. Spülen Sie in dH ₂ O bis Gewebe transparent wird.
5. Tauchen Gewebe in 1% Gerbsäure 4 h bei Raumtemperatur. Verwenden Sie 1 ml 5% Stammlösung pro 4 ml dH ₂ O.
   ACHTUNG: Gerbsäurereizend ist eine starke, Handschuhe zu tragen.
6. Spülen Sie in dH ₂ O über Nacht.

3. Osmication und Dehydration von Herzgewebe (in Dampf-Haube für Sicherheit)

1. Machen Sie eine 0,2 M Stammlösung von Natriumcacodylatpuffer mit 21,4 g Natriumcacodylat, 10,0 g Calciumchlorid und 450 ml dH ₂ O. Mix, dann Salzsäure nach Bedarf hinzufügen pH auf 7,4 einzustellen. Qs auf 500 ml mit dH ₂ O.
   ACHTUNG: Natriumcacodylat und Salzsäure sind giftig, Handschuhe tragen und die Arbeit in einem Abzug.
2. Machen Sie 2% igen wässrigen Stammlösung von Osmiumtetroxid in Abzug , der für die Sicherheit durch Lösen von 1 g Osmiumtetroxid Kristall in 50 ml dH ₂ O.
   ACHTUNG: Osmiumtetroxid ist eine schwere Gefahr beim Einatmen; Dampf Fixierung von Schleimhäuten oder Augäpfel ist möglich, also nur mit Handschuhen im Abzug handhaben. Ein Spritzschutz wird empfohlen.
3. Spülen Sie Gewebe in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (Mischungslösung Lager 1: 1 mit dH _{2 O) für 5 min auf Rotator (oder leichtem Schütteln).}
4. Zweimal wiederholen vorherigen Schritt, für insgesamt drei Puffer Spülungen.
5. Tauchen Gewebe in 1% Osmiumtetroxid in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (Lager Natriumcacodylat und Lager Osmiumtetroxid 1 mischen: 1) auf Rotator für 1 Stunde.
6. Spülen Gewebe in 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer 3 mal für jeweils 5 min auf Rotator.
7. Spülen Gewebe unter Verwendung zunehmender Konzentrationen von Ethanol (30%, 50%, 75%, 85%, 95% und schließlich 100%) für 15 min auf jedem Rotator.

4. Querschnitt Oberflächenvorbereitung für SEM

1. Übertragen Gewebe in 100% Ethanol auf eine flache Petrischale auch 100% Ethanol enthält.
2. Halten Sie zwei sehr scharfe Rasierklingen, so dass die Wohnungen der Seiten in Kontakt miteinander stehen und die Schneidkanten Quer zwei Seiten eines gleichseitigen Dreiecks oberhalb der Probe zu bilden. Um dies zu erreichen, verwenden Sie die linke Hand ein Blatt auf der rechten Seite der Probe zu platzieren undSchnitt nach links. Zugleich mit der rechten Hand, um die zweite Klinge auf dem ganz links in der Probe und Scheibe nach rechts zu platzieren. Somit werden die Blätter aus entgegengesetzten Richtungen gegeneinander verschoben werden, um einen einzelnen glatten Schnitt.
3. Schieben Sie die flache Klinge Seiten gegeneinander einen sehr sauberen Schnitt der Probe mit minimaler Verzerrung zu machen oder Reißkraft, vorzugsweise eine möglichst große Oberfläche wie möglich auszusetzen, ohne die Probe zu beschädigen.
4. Wiederholen Sie für jede Probe die sauberste mögliche Querschnittsflächen für die Prüfung im SEM auszusetzen.

5. Trocknen am kritischen Punkt (CPD) von Herzgewebe

1. Verwenden eines Spatels oder einer Pinzette Gewebe an den Probenhalter des kritischen Punktes Trockners (CPD) zu übertragen, um sicherzustellen, dass Gewebe zu jeder Zeit in 100% Ethanol bleibt. Stellen Sie sicher, dass der Halter in Ethanol eingetaucht wird, und dass die Übertragung mit dem Gewebe für nicht mehr als einige Sekunden an der Luft erreicht wird.
2. Betreiben Sie CPD pro unser Anleitung zu vervollständigen 3 Purge-and-Fill-Zyklen Ethanol mit flüssigem Kohlendioxid zu ersetzen.
3. Betreiben Sie CPD pro Bedienungsanleitung Trocknen am kritischen Punkt der Proben zu erreichen und bringt sie auf Atmosphärendruck mit kontrolliertes Ablassen von CO _2.

6. Montage von Herzgewebeproben für SEM

1. Bereiten Sie eine SEM-Probe Stub für jede Probe, um eine Kohlenstofffolie auf der Oberfläche des Aluminium-Stub haften.
2. Mit Hilfe eines Stereomikroskops, sich sorgfältig um die Probe auf die Klebelasche mit der Querschnittsfläche von Interesse nach oben (weg von der Registerkarte sichtbar), und so nah wie möglich mit der Ebene der Probe Stummel Oberfläche parallel. Sie nicht die Oberfläche von Interesse Sonde oder berühren.
3. Brechen Sie einen hölzernen Applikatorstäbchen eine verjüngte Bürste, ideal für Farbauftrag zu erzielen. Bewerben Silber oder Kohlenstoff Farbe an der Basis und an den Seiten der Probe, die Einhaltung der Stummel zu verbessern.
4. Erweitern Sie eine sehr dünne Linie von Silber oder Kohlenstoff, an einer Kante der Oberfläche von Interesse bemalen, einen Ladepfad von der Oberfläche von Interesse zu Boden zu schaffen.
5. Übernehmen 2 oder 3 kleine dabs von Silber oder Kohlenstofffarbe um den Umfang der Kohlenstofflasche, einen leitenden Pfad von der Kohlenstofflaschenoberfläche an dem Metall stub zu bieten und somit zur Masse.
6. Erlauben leitfähigen Farbe für zwei Stunden trocknen.
7. Betreiben Sie Zerstäubungsbeschichter pro Bedienungsanleitung eine relativ schwere Beschichtung (Zielbereich von 30 - 40 nm) aufzubringen Gold-Palladium-Legierung oder Gold. Pumpe Probenkammer auf etwa 0,1 mbar; Zeitschaltuhr auf 40 sec. Offene Stellen Ventil in die Position 08.00 Uhr (moderate Argon Gasstrom). Drücken Sie auf Start Sputterbeschichtung bei 30 mA zu initiieren. Lila Glimmentladung sollte in der Probenkammer sichtbar sein.

7. REM-Untersuchung der Herzgewebeproben

1. Führen Rasterelektronenmikroskopie bei relativ niedriger Beschleunigungsspannung Abbildungs ​​p zu minimierenrobleme mit Verlust schlechten Ladung in der Probe zugeordnet ist (Laden). Empfohlene anfängliche Abbildungsbedingung sind: 5 kV Beschleunigungsspannung, 10 mm Arbeitsabstand.
2. Mit Hilfe eines erfahrenen Bediener, erhöht beschäftigen Abstand Arbeitstiefe von Feldbedingungen in der Bildgebung Fokus der Fasern erstrecken sich in mehreren Fokusebenen erfordern, oder Fasern für beträchtliche Länge in z-Richtung erstrecken.
   1. Für das Mikroskop hier (siehe Tabelle der Materialien), in der Benutzeroberfläche Zugriff die Registerkarte Navigation oben rechts verwendet.
   2. Besuchen Sie das Register Koordinaten von der Bühne Menü. Zur Erhöhung der Arbeitsabstand, geben Sie einen größeren Wert in Millimetern für die Z-Koordinate dann, um auf die Registerkarte Gehen Sie auf die Probenbühne auf den eingegebenen Arbeitsabstand zu bewegen.
3. Mit Hilfe eines erfahrenen Bediener, beschäftigen Probe Neigung und Drehung der Oberfläche von Interesse orthogonal zu dem Elektronenstrahl zu positionieren. Zusätzliche Neigung von 10 bis 30 degrees von dieser Position kann die Beobachtung und Dokumentation der Matrixstruktur zu verbessern.
   1. Für das Mikroskop hier (siehe Tabelle der Materialien), in der Benutzeroberfläche verwendet wird , klicken Sie mit der rechten Maustaste gedrückt halten, schieben Sie dann nach links oder rechts , um die Probe in der Nähe der Peripherie der vorbereiteten Oberfläche Ebene von Interesse zu konzentrieren, um den fokussierten Arbeitsabstand der Feststellung , .
   2. Navigieren Sie mit dem Handbuch Benutzeroberfläche Joystick in der Nähe der gegenüberliegenden Kante der Oberfläche und wiederholen Sie Fokus zu bewegen. Wenn der Abstand arbeiten in die erste Position nicht annähernd gleich ist, Neigung Probe an beiden Standorten ungefähre Vereinbarung zu erreichen, um die Register Koordinaten des Stage-Menü (siehe 7.2) und einem Neigungswert in der T-Koordinate eingeben.
   3. Drehen Probe neunzig Grad (Wert in R-Koordinatenfeld) und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Positionen bei etwa der gleichen Arbeitsabstand fokussiert sind.
      Hinweis: Variable Druck SEM verwendet werden kann Ladungsdissipation zu verbessernwenn verfügbar. Hochvakuum ist der Standard-Betriebsmodus für die Rasterelektronenmikroskopie.

Results

Der markierte Technik wurde zu Herzgewebe von einem nicht verwendeten menschlichen Herztransplantation Spender (Abbildung 1), explantiert Gewebe von Transplantatempfängern, Herzen von Wildtyp und dystrophischen Mäuse (Abbildung 3) aufgebracht wird , und in der Post-Myokardinfarkt Herzproben von einem Schwein Modell der Herzverletzung (Abbildung 2). Wie in 1 gezeigt ist , ist der menschliche Herz Matrix ein kompliziertes ...

Discussion

Querschnitt Oberflächenvorbereitung ist der kritischste Schritt während des Protokolls. Zur Erhaltung Feinstruktur, dehydriert Proben müssen zu jeder Zeit in 100% Ethanol bleiben bis zum kritischen Punkt Trocknungsprozess eingeführt. Deshalb ist die Slicing der Proben Flächen für EM Prüfung zu erreichen, müssen durchgeführt werden, während Proben in Ethanol in einer flachen Schale getaucht werden. Es ist auch wichtig, dass die freiliegende Oberfläche während der nachfolgenden Handhabung nicht berührt oder sondiert wird....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calciumchlorid-Elektronenmikroskopie	Sciences	12340	100 g
Kohlenstoff-Klebe-Elektronenmikroskopie	Sciences	12664	30 g
Kohlenstoff-Klebelaschen	Elektronenmikroskopie Sciences	77825	Reihenfolge der Montage von Stummeln
Doppelschneidige Rasierklingen Edelstahl	Ted Pella, Inc	121-6	250/Packung
Ethanol	Elektron Microscopy Sciences	15055	450 ml
Gluteraldehyd, 50% Lösung	Elektronenmikroskopie Sciences	16310	EM-Qualität, destillationsgereinigte
Salzsäure	Elektronenmikroskopie Sciences	16760 oder 16770	100 ml
Mononatriumphosphat NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9251-250G	250 g
Osmium Tetroxid	Elektronenmikroskopie	19100	1 g
Silber Leitfähiger Klebstoff	Elektronenmikroskopie	12686-15	15 g
Natriumhydroxid (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045-1KG	1 kg
Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S3264-500G	500 g
Gerbsäure, 5% Wässrig	Elektronenmikroskopie Sciences	21702-5	500 ml
Trihydrat Natrium-Cacodylat	Elektronenmikroskopie Sciences	12300	100 g
Gold-Palladium-Legierung oder Gold	Refining Systems, Inc.	variiert	spezifisch für die Marke und das Modell des Sputter-Coaters
Critical Point Dryer	Electron Microscopy Sciences	850
Plain Wooden Applicators	Fisher Scientific	23-400-102
Quanta 250 Environmental REM	FEI	Q250 REM
Sputter Coater	Cressington Scientific Instruments Ltd.	Modell 108
Aluminium-REM-Probenstiche	Elektronenmikroskopie Sciences	75220-12	spezifisch für das Mikroskop