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Biology

विकास और की विशेषता Published: May 19, 2016 doi: 10.3791/54014
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Cellular and Molecular Physiology, College of Medicine, Penn State University, 2Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University
* These authors contributed equally

Abstract

Endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) विवो में रक्त वाहिनियों की दीवारों अस्तर लगातार प्रवाह करने के लिए सामने आ रहे हैं, लेकिन सुसंस्कृत ईसीएस अक्सर स्थिर शर्तों के अधीन हो गई है और एक समर्थक भड़काऊ फेनोटाइप प्रदर्शन कर रहे हैं। हालांकि microfluidic उपकरणों के विकास के दो दशकों से अधिक इंजीनियरों द्वारा अपनाया गया है, उनके जैविक अनुप्रयोगों सीमित रहते हैं। एक और अधिक physiologically प्रासंगिक इन विट्रो microvessel मॉडल जैविक अनुप्रयोगों द्वारा मान्य क्षेत्र अग्रिम और इन विवो के बीच है और इन विट्रो अध्ययन में अंतराल को पाटने के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ, हम एक लंबी अवधि के छिड़काव की क्षमता के साथ एक microfluidic डिवाइस का उपयोग सुसंस्कृत microvessel नेटवर्क के विकास के लिए विस्तृत प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं। हम यह भी confocal और पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग वास्तविक समय में चुनाव आयोग [सीए 2 +] मैं और नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) उत्पादन में एगोनिस्ट प्रेरित परिवर्तन के मात्रात्मक मापन के लिए उसके आवेदन प्रदर्शित करता है। का गठन microvessel शुद्धनिरंतर छिड़काव के साथ काम ईसीएस के बीच अच्छी तरह से विकसित जंक्शनों दिखाया। Ve-Cadherin वितरण स्थिर रुप से सुसंस्कृत चुनाव आयोग monolayers से बरकरार microvessels में मनाया कि के करीब था। चुनाव आयोग में क्षणिक बढ़ जाती है एटीपी प्रेरित [सीए 2 +] मैं और कोई उत्पादन मात्रात्मक अलग-अलग सेल स्तर है, जो सुसंस्कृत microvessels की कार्यक्षमता मान्य पर मापा गया। इस microfluidic युक्ति ईसीएस एक अच्छी तरह से नियंत्रित, physiologically प्रासंगिक प्रवाह है, जो सेल संस्कृति पर्यावरण पारंपरिक, स्थैतिक 2 डी संस्कृतियों में है कि अधिक से विवो में करने के लिए करीब बनाता है के तहत विकसित करने के लिए अनुमति देता है। microchannel नेटवर्क डिजाइन अत्यधिक बहुमुखी है, और निर्माण की प्रक्रिया सरल और repeatable है। उपकरण आसानी से confocal या पारंपरिक सूक्ष्म प्रणाली उच्च संकल्प इमेजिंग सक्षम करने के लिए एकीकृत किया जा सकता है। सबसे महत्वपूर्ण बात, क्योंकि सुसंस्कृत microvessel नेटवर्क प्राथमिक मानव ईसीएस द्वारा गठित किया जा सकता है, इस दृष्टिकोण एक उपयोगी उपकरण के रूप में कैसे जांच करने के लिए की सेवा करेंगेpathologically रोगी के नमूनों से बदल रक्त घटकों मानव ईसीएस प्रभावित करते हैं और नैदानिक ​​मुद्दों में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। यह भी दवा स्क्रीनिंग के लिए एक मंच के रूप में विकसित किया जा सकता है।

Introduction

Endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) विवो में रक्त वाहिनियों की दीवारों अस्तर लगातार प्रवाह करने के लिए सामने आ रहे हैं, लेकिन सुसंस्कृत ईसीएस अक्सर स्थिर शर्तों के अधीन हो गई है और एक समर्थक भड़काऊ phenotype 1,2 प्रदर्शन कर रहे हैं। Microfluidics प्रौद्योगिकी वांछित प्रवाह शर्तों के तहत विकसित करने के लिए एक ज्यामितीय विवश microscale (उप मिलीमीटर) चैनलों 3, जो नाड़ी ईसीएस के लिए विशेष रूप से, संवर्धित कोशिकाओं के लिए अवसर प्रदान करता है के माध्यम से एक ठीक नियंत्रित तरल पदार्थ में सक्षम बनाता है। इन सुविधाओं के सेल संस्कृति शर्तों पारंपरिक, स्थैतिक 2 डी सेल संस्कृतियों की तुलना में vivo में के करीब हैं। वे अत्यंत महत्वपूर्ण है जब microfluidic उपकरणों यांत्रिक और / या रासायनिक stimulations करने के लिए चुनाव आयोग प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए vasculatures के विभिन्न प्रकार के मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया और कर रहे हैं।

लाभ एक स्थिर सेल संस्कृति, अनुकूलन और जैव चिकित्सा च में microfluidics के आवेदन पर microchannel नेटवर्क द्वारा प्रदर्शन के बावजूदield सीमित रहते हैं। हाल ही में एक समीक्षा द्वारा प्रतिवेदित, तो इस क्षेत्र (85%) के प्रकाशन के बहुमत में इंजीनियरिंग पत्रिकाओं 4 में अब भी कर रहे हैं। microfluidic उपकरणों का प्रदर्शन काफी समझाने सबसे जीव ऐसे Transwell परख और वृहद पैमाने पर इस छोटी डिवाइस के लिए संस्कृति डिश / गिलास स्लाइड के रूप में मौजूदा तकनीक से स्विच करने के लिए नहीं किया गया है। Microfluidics एक multidisciplinary क्षेत्र है, जो अंतःविषय सहयोग इस क्षेत्र को आगे बढ़ने की आवश्यकता है। इस तकनीकी लेख का उद्देश्य, विषयों के बीच ज्ञान अंतराल को कम करने और जबकि जैविक आवेदन और microfluidic microvessels के कार्यात्मक सत्यापन उपलब्ध कराने के निर्माण प्रक्रियाओं जीव द्वारा समझ बनाने के लिए है। कल्पना की प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल दोनों microfluidic उपकरणों और उनके जैविक उपयोगिताओं, जो इंजीनियरों और जीव के बीच घनिष्ठ सहयोग का प्रतिनिधित्व करता है के निर्माण में शामिल हैं।

हम हाल ही में कुछ सूचना दीजैविक अनुप्रयोगों microfluidic युक्ति 5 के साथ इन विट्रो microvessel नेटवर्क का उपयोग कर। ताकि उचित microchannel नेटवर्क के आयामों के लिए डिजाइन और वांछित कतरनी तनाव लागू करने के लिए, एक संख्यात्मक मॉडल कम्प्यूटेशनल द्रव गतिशील सॉफ्टवेयर बारीकी प्रवाह प्रोफ़ाइल अनुमान लगाने के लिए के साथ बनाया गया था। प्राथमिक मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVECs) कि microchannels संगम तक पहुँच में वरीयता प्राप्त थे, यानी, microchannel की पूरी भीतरी सतहों को कवर निरंतर छिड़काव के साथ 3-4 दिनों में। उचित बाधा गठन VE-cadherin धुंधला द्वारा प्रदर्शन किया गया और स्थिर सेल संस्कृति शर्तों के तहत और बरकरार microvessels में गठन उन लोगों के साथ तुलना में। व्यक्तिगत रूप से भरकर रखा बरकरार microvessels 6-8 में विकसित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को लागू करके, हम मात्रात्मक चुनाव आयोग में परिवर्तन मापा [सीए 2 +] मैं और नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) में फ्लोरोसेंट साथ adenosine triphosphate (एटीपी) के जवाब में उत्पादनdicators और confocal और पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी। चुनाव आयोग में एगोनिस्ट प्रेरित बढ़ जाती है [सीए 2 +] मैं और कोई उत्पादन microvessel पारगम्यता 6-15 में भड़काऊ मध्यस्थ प्रेरित वृद्धि के लिए आवश्यक intracellular संकेतों के रूप में सूचित किया गया है। हालांकि कुछ पिछले अध्ययनों DAF-2 डीए लोड microfluidic उपकरणों 16,17 की छवियों से पता चला है, उचित समाधान और डेटा विश्लेषण अभी तक 18 से हासिल नहीं की थी। हमारे ज्ञान करने के लिए, इस अध्ययन [सीए 2 +] मैं और कोई उत्पादन का उपयोग microfluidic आधारित प्रणाली endothelial में एगोनिस्ट प्रेरित गतिशील परिवर्तन की पहली मात्रात्मक मापन को दर्शाता है।

तकनीक microfabrication लचीलापन कुछ माइक्रोन के लिए microchannels नीचे बनाना और इन विवो microvasculature की geometries नकल करने के लिए जटिल पैटर्न के विकास को सक्षम करने के लिए है। यहाँ हम शाखाओं में बंटी के तीन स्तरों के साथ एक ठेठ microchannel नेटवर्क प्रस्तुत किया। इसनेटवर्क photolithography का संयोजन है जो एक microfabrication cleanroom और नरम लिथोग्राफी में किया जाता है द्वारा निर्मित है।

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Protocol

1. Microfluidic उपकरण निर्माण

  1. एक सु-8 50 मास्टर मोल्ड के मानक Photolithography निर्माण
    1. पहले स्पिन कोटिंग सिलिकॉन वेफर साफ करें। 15 मिनट के लिए 15 मिनट के isopropyl शराब (आईपीए) के द्वारा पीछा के लिए एसीटोन के साथ एक नंगे 2 इंच सिलिकॉन वेफर कुल्ला। 1 घंटे के लिए 150 डिग्री सेल्सियस पर एक hotplate पर रखकर वेफर निर्जलीकरण। निर्जलीकरण के बाद, कमरे के तापमान पर वेफर शांत।
    2. स्पिन कोट SU-8 photoresist के साथ सिलिकॉन वेफर। वेफर पर 2 मिलीलीटर SU-8 photoresist जोड़ें। 10 सेकंड के लिए 100 rpm / सेकंड त्वरण से कम 500 आरपीएम, 30 सेकंड के लिए 300 rpm / सेकंड त्वरण में 1000 rpm के द्वारा पीछा करने के लिए वेफर रैंप। (पूरक वीडियो 1 देखें)
    3. पूर्व सेंकना एक गर्म थाली पर 30 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए, तो मुलायम सेंकना के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर वेफर।
    4. यूवी जोखिम का उपयोग स्पिन में लिपटे photoresist करने के लिए एक फिल्म नकाब से डिजाइन पैटर्न को बदलने की। एक फिल्म मुखौटा के रूप में एक पतली पारदर्शी फिल्म पर पैटर्न प्रिंट। के शीर्ष पर फिल्म नकाब रखेंस्पिन में लिपटे photoresist और 300 MJ / 2 सेमी की एक खुराक के साथ यूवी को बेनकाब। (पूरक वीडियो 2 देखें)
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, microchannel नेटवर्क पैटर्न (चार 100 माइक्रोन विस्तृत बेटी चैनलों में शाखाओं में बंटी 159 माइक्रोन विस्तृत मां चैनल) सीएडी सॉफ्टवेयर के साथ बनाया गया है। फिल्म पर पैटर्न एक स्पष्ट क्षेत्र के रूप में पता चलता है और इस फिल्म के बाकी काली स्याही से आच्छादित है। क्योंकि SU-8 एक नकारात्मक photoresist है, कि यूवी के संपर्क में है photoresist की भाग crosslinked हो सकता है और मिट्टी विकास (कदम 1.1.6) के दौरान विलायक के लिए अघुलनशील हो जाएगा। विकास के बाद, इस अघुलनशील भाग डिज़ाइन किया गया नेटवर्क पैटर्न दोहराने के लिए और एक मास्टर मोल्ड के रूप में काम करेगा।
    5. पोस्ट-सेंकना अवगत कराया 1 मिनट, 10 मिनट के लिए और फिर 95 डिग्री सेल्सियस के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर वेफर।
    6. मास्टर ढालना विकास करना। संयुक्त राष्ट्र के crosslinked photoresist दूर करने के लिए विलायक के रूप में उपयोग SU-8 डेवलपर। 3 मिनट के लिए SU-8 डेवलपर में वेफर विसर्जित कर दिया और आईपीए के साथ कुल्ला1 मिनट के लिए।
    7. इस विकास चक्र को दोहराएँ 2-3 बार जब तक कोई सफेद लकीर गठन (गैर-ठीक photoresist की छाछ) आईपीए के बाद कुल्ला है। धीरे नाइट्रोजन गैस के साथ वेफर सूखी और एक माइक्रोस्कोप के तहत पैटर्न के छोटे सुविधाओं की जांच। अतिरिक्त विकासशील चक्र दोहराएँ यदि आवश्यक है।
    8. हार्ड 15 मिनट के लिए 150 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर वेफर सेंकना।
  2. नरम लिथोग्राफी
    1. मैन्युअल रूप से एक गुम्मट पर दो भागों polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer के (आधार और इलाज एजेंट) मिश्रण। 10: 1 का अनुपात।
    2. डी-गैस 15 मिनट के लिए एक घर वैक्यूम के साथ जुड़ा desiccator साथ PDMS मिश्रण। कास्ट photoresist मास्टर मोल्ड पर PDMS समाधान। PDMS की मोटाई इनलेट / आउटलेट टयूबिंग की एक स्थिर पकड़े प्रदान करने पर 3 मिमी की जरूरत है। डी-गैस 15 मिनट के लिए फिर से PDMS, और यदि आवश्यक नाइट्रोजन गैस के साथ शेष हवाई बुलबुले को दूर। 3 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में casted PDMS इलाज।
    3. की सतह को साफएक स्कॉच टेप और एक प्लाज्मा क्लीनर (30 सेकंड प्लाज्मा उपचार) के साथ कांच coverslip। 30 सेकंड के लिए 500 rpm / सेकंड त्वरण दर पर 4000 rpm के लिए ramping द्वारा कांच coverslip पर स्पिन कोट संयुक्त राष्ट्र के ठीक PDMS (0.5 एमएल)। कम से कम 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में PDMS स्पिन लेपित coverslip इलाज।
    4. कट और मास्टर आचारण से ठीक PDMS जारी। फिर एक इनलेट और मां चैनलों के बाहर अंत में एक 1 मिमी व्यास छेद छेदने के साथ एक दुकान बनाने के लिए।
    5. PDMS स्पिन में लिपटे गिलास coverslip के लिए डिवाइस बांड। PDMS की सतहों oxidize और 1 मिनट के लिए एक प्लाज्मा क्लीनर के साथ coverslip। ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार के बाद, संबंध सतह पर विआयनीकृत पानी (डि पानी) की एक छोटी बूंद जगह है, और दो भागों को एक साथ जगह है। 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में सेंकना डिवाइस एक स्थायी संबंध प्राप्त करने के लिए।

पूरक वीडियो 1 पूरक वीडियो 1 (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

पूरक वीडियो 2
पूरक वीडियो 2 (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

2. Endothelial सेल बोने और संस्कृति

  1. डिवाइस बंध्याकरण और fibronectin कोटिंग
    1. ऑक्सीकरण से इनलेट / आउटलेट के आसपास PDMS सतह के हाइड्रोफोबिक संपत्ति को बचाना। इनलेट आसपास PDMS सतह कवर और स्कॉच टेप के छोटे धारियों ऑक्सीकरण रोकने के साथ दुकान। यह प्रक्रिया भरने कदम (2.1.3) के दौरान डिवाइस के ऊपर की सतह पर सभी फैलने से डि पानी रोका जा सकता है।
    2. ऑक्सीजन प्लाज्मा के लिए साथ PDMS डिवाइस समझोआर 5 मिनट सतह हाइड्रोफिलिक होना करने के लिए बदलने के लिए, इस प्रकार microchannel के माध्यम से द्रव का प्रवाह की सुविधा और बुलबुला भरने की प्रक्रिया (2.1.3) में फँसाने को रोकने के।
    3. एक सुई संलग्न या एक विंदुक के साथ या तो एक सिरिंज का उपयोग प्रवेश से डि पानी के साथ डिवाइस को भरने के लिए। भरने जारी रखें जब तक वहां डि पानी (30-50 μl) आउटलेट पर संचित की एक छोटी बूंद है। अगर वहाँ microchannel अंदर फंस बुलबुले हैं जाँच करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे डिवाइस का परीक्षण करें। इनलेट और एक कागज के ऊतकों के साथ दुकान पर अत्यधिक छोटी बूंद पानी निकालें।
    4. एक लामिना जैव सुरक्षा हुड में 3 घंटा की एक न्यूनतम के लिए यूवी के साथ एक पेट्री डिश में डिवाइस जीवाणुरहित। , वाष्पीकरण को रोकने PDMS की एक पतली टुकड़ा के साथ इनलेट / आउटलेट कवर करने के लिए, डिश के अंदर एक गीला कागज ऊतक डाल दिया, और Parafilm के साथ पकवान लपेटो।
    5. कोट फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ डिवाइस। इस उपकरण में एक फ्रिज में 100 माइक्रोग्राम / एमएल fibronectin के साथ रात भर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ पहले कुल्ला, तो यह कोट (4 डिग्री सेल्सियस)। प्रवेश पर समाधान की एक छोटी बूंद प्लेस, और फिर एक घर निर्वात, एक सुई या एक विंदुक के साथ एक सिरिंज के साथ दुकान पर एक नकारात्मक दबाव बनाने के लिए।
    6. सेल संस्कृति मीडिया के साथ डिवाइस भरें। सेल संस्कृति मीडिया लोड करने से पहले 3 बार के लिए मैन्युअल पीबीएस के साथ डिवाइस कुल्ला। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में डिवाइस को गर्म।
  2. ईसीएस सीडिंग और लंबी अवधि के छिड़काव
    नोट: पारंपरिक स्थिर 2 डी चुनाव आयोग संस्कृति के साथ तुलना, निरंतर छिड़काव के साथ इन विट्रो microvessel नेटवर्क मॉडल सेल संस्कृति वातावरण में विवो की स्थिति के करीब बना दिया। इन विट्रो microvessel इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन नेटवर्क के दो सप्ताह तक रखा जा सकता है। अच्छी तरह से नियंत्रित छिड़काव लगातार पोषक तत्वों की भरपाई होगी, कचरे को हटाने, और अधिक-संगम चुनाव आयोग monolayer के रोका जा सके। इसलिए, यह एक लंबी अवधि के अध्ययन के लिए बढ़ाया जा सकता है अलग अलग physiologica तहत नकल उतार सेलुलर और रक्तसंचारप्रकरण पर्यावरणएल और रोग की स्थिति।
    1. 8% dextran (मोल गुम्मट 70,000) के साथ HUVEC संस्कृति मीडिया में प्राथमिक HUVECs (MCDB 131) मिक्स। dextran लोड हो रहा है मीडिया की चिपचिपाहट बढ़ाने के लिए और एक बेहतर सेल बोने परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है। की सिफारिश की सेल घनत्व के बारे 2-4 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल है।
    2. डिवाइस में कोशिकाओं बीज। इनलेट भर में कोशिकाओं का एक 10-20 μl छोटी बूंद रखें। या तो डिवाइस झुकाव, या केशिका क्रिया आउटलेट पर एक गिलास पाश्चर विंदुक का उपयोग करके एक कोमल प्रवाह का परिचय। एक सफल सेल लोड करने के लिए कुंजी प्रवाह वेग कम से कम 1 मिमी / सेकंड की सबसे छोटी चैनलों के भीतर नियंत्रित करने के लिए है।
    3. सेल बोने की जाँच करें। प्रारंभिक बोने के बाद, खुर्दबीन के नीचे बोने स्थिति की जाँच से पहले 15-20 मिनट (humidified 5% सीओ 2 का माहौल 37 डिग्री सेल्सियस पर) के लिए डिवाइस सेते हैं। यदि आवश्यक हो, अतिरिक्त सेल लोड हो रहा है एक वांछित सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए करते हैं।
    4. धीरे सेल संस्कृति के माध्यम से डिवाइस कुल्ला (37डिग्री सेल्सियस) dextran हटा दें। संस्कृति (37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2) एक मशीन में पहले 6 घंटे के लिए प्रवाह के अभाव में डिवाइस।
    5. लंबी अवधि के छिड़काव के लिए ट्यूबिंग कनेक्शन सेट करें। आंदोलन को रोकने के लिए एक पेट्री डिश में डिवाइस टेप। इनलेट और आउटलेट ट्यूबिंग सम्मिलन के लिए पेट्री डिश के ढक्कन पर छोटे छेद बनाएं। सेल संस्कृति मीडिया छिड़काव के लिए एक सुई के साथ एक सिरिंज के लिए इनलेट ट्यूबिंग कनेक्ट करें। बर्बादी कलेक्टर को आउटलेट ट्यूबिंग कनेक्ट करें।
      नोट: जगह डिवाइस और एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में अपशिष्ट कलेक्टर, जबकि इनक्यूबेटर के बाहर एक छिड़काव पंप रखने और लंबे इनलेट ट्यूबिंग द्वारा डिवाइस के साथ कनेक्ट। छिड़काव दर प्रयोगात्मक डिजाइन द्वारा निर्धारित किया जाता है। वर्तमान डिवाइस में, 0.35 μl / मिनट की दर से छिड़काव और 1-2 डाएन / 2 सेमी के बीच एक कतरनी तनाव रेंज का उपयोग करें। इस छिड़काव शर्त के तहत, HUVECs 3-4 दिनों के बारे में संगम तक पहुँचने।

3. मैंmmunofluorescent धुंधला

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट, 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर rinsing 1x पीबीएस के द्वारा पीछा किया, और 1% बीएसए 30 मिनट के लिए रोकने के लिए 2% paraformaldehyde के छिड़काव से डिवाइस में ईसीएस को ठीक करें। एक छिड़काव दर है कि सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया है कि के रूप में ही है प्रयोग करें।
  2. 0.1% ट्राइटन X-100 के साथ एंटीबॉडी धुंधला के लिए तय ईसीएस Permeabilize। लेबल करने के लिए 5-7 मिनट के लिए ट्राइटन के साथ डिवाइस छिड़कना VE-cadherin, और लेबल एफ actin के लिए 3 मिनट।
  3. डिवाइस में एंटीबॉडी लोड। 15 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ डिवाइस छिड़कना पिछले समाधान बाहर धोने के लिए। मैन्युअल 2 माइक्रोग्राम / एमएल (कुल मात्रा 20-50 μl है) की एकाग्रता में डिवाइस में VE-cadherin (एंटी-बकरी) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी लोड। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रिज में डिवाइस रखें। 45-60 मिनट के लिए 7 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में माध्यमिक एंटीबॉडी (गधा विरोधी बकरी) एक सिरिंज पंप से छिड़कना।
  4. लेबल चुनाव आयोग एफ actin phalloidin के साथ। 1x पीबीएस के लिए के साथ डिवाइस छिड़कनामैन्युअल 7-10 मिनट के लिए phalloidin (10 माइक्रोग्राम / एमएल) लोड करने से पहले 15 मिनट के आर।
  5. लेबल चुनाव आयोग नाभिक (देखें सामग्री सूची)।
  6. 1x पीबीएस के साथ डिवाइस कुल्ला, और इमेजिंग जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर इसे बनाए रखने के।

4. Endothelial के प्रतिदीप्ति इमेजिंग [सीए 2 +] मैं

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए -Ringer के समाधान एल्बुमिन के साथ डिवाइस (10 मिलीग्राम / एमएल) छिड़कना। एक ही छिड़काव दर का प्रयोग के रूप में है कि सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया। एल्बुमिन-घंटी समाधान के सभी घटकों की सांद्रता सामग्री सूची में वर्णित हैं।
  2. चुनाव आयोग [सीए 2 +] मैं साथ Fluo 4 AM इमेजिंग के लिए confocal प्रणाली की स्थापना की। सीए 2 इमेजिंग के लिए एक confocal सूक्ष्म प्रणाली का प्रयोग करें। उत्तेजना के लिए एक आर्गन लेजर (488 एनएम) का प्रयोग करें और 510-530 एनएम के रूप में उत्सर्जन बैंड निर्धारित किया है। 512 x 512 स्कैन प्रारूप पर: छवियों (0.95, एनए पानी विसर्जन) एक 25x उद्देश्य से ले लीजिए। मैं के प्रत्येक ढेर के लिए 2 माइक्रोन की एक z कदम और एक स्कैनिंग अंतराल का उपयोग20 सेकंड के mages।
  3. के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए Fluo 4 बजे (5 माइक्रोन) के डिवाइस छिड़कना, तो बाहर धोने एल्बुमिन-घंटी समाधान के साथ लुमेन Fluo 4 पर हूँ।
  4. Fluo 4 लोड microvessels की छवियों मोल। 10 मिनट के लिए आधारभूत छवियों को ले लीजिए। एटीपी (10 माइक्रोन) के साथ डिवाइस छिड़कना और 20 मिनट के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता (इंटरनेट) की परिवर्तन रिकॉर्ड है।

5. नाइट्रिक ऑक्साइड उत्पादन के प्रतिदीप्ति इमेजिंग

  1. 15 मिनट के लिए एल्बुमिन-घंटी समाधान के साथ डिवाइस छिड़कना। एक छिड़काव दर है कि सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया है कि के रूप में ही है प्रयोग करें।
  2. एटीपी प्रेरित नाइट्रिक ऑक्साइड उत्पादन को मापने के लिए प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रणाली की स्थापना की। एक 12-बिट डिजिटल सीसीडी कैमरा और नाइट्रिक ऑक्साइड माप के लिए एक कंप्यूटर नियंत्रित शटर से लैस एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। प्रकाश स्रोत के रूप में एक 75 डब्ल्यू क्सीनन दीपक का प्रयोग करें।
    नोट: एक हस्तक्षेप फिल्टर (480/40 एनएम) और एक dichroic दर्पण से DAF-2 महंगाई भत्ते के लिए उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का चयन करेंएक बैंड पास बाधा के साथ (505 एनएम) (535/50 एनएम)। छवियों को इकट्ठा करने के लिए: एक 20x उद्देश्य लेंस (0.75 एनए) का प्रयोग करें। photobleaching कम से कम करने के लिए, हस्तक्षेप फिल्टर के सामने एक तटस्थ घनत्व फिल्टर (0.5 एन) की स्थिति और 0.12 सेकंड के लिए जोखिम समय सीमा।
  3. DAF-2 महंगाई भत्ते (5 माइक्रोन) के साथ कोशिकाओं लोड। 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 35-40 मिनट के लिए DAF-2 डीए के साथ डिवाइस छिड़कना। प्रारंभिक लदान के बाद DAF-2 प्रतिदीप्ति तीव्रता (एफआई डीएएफ) की आधारभूत रिकॉर्ड।
    नोट: DAF-2 डीए प्रयोग 7 भर perfusate में लगातार मौजूद है।
  4. DAF-2 छवियों को ले लीजिए। 5 मिनट के लिए FI DAF के आधारभूत रिकॉर्ड। एटीपी (10 माइक्रोन) के साथ डिवाइस छिड़कना और 1 मिनट के अंतराल के साथ 30 मिनट के लिए छवियों को इकट्ठा। एक ही फोकल हवाई जहाज़ पर कोशिकाओं के एक ही समूह से छवियों के सभी इकट्ठा।

6. डेटा विश्लेषण

  1. मैन्युअल व्यक्ति कोशिका के स्तर पर एकत्र छवियों से हितों (ROIs) के क्षेत्र का चयन करें। से प्रत्येकरॉय एक व्यक्ति सेल जो प्रतिदीप्ति रूपरेखा ने संकेत दिया जा सकता है की क्षेत्र शामिल हैं।
  2. पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति घटाएँ और प्रत्येक ROIs का मतलब FI की गणना।
  3. उपाय चुनाव आयोग में एटीपी प्रेरित परिवर्तन [सीए 2 +] मैं और कोई उत्पादन। चुनाव आयोग [सीए 2 +] मैं में एटीपी प्रेरित परिवर्तन यों Fluo 4 FI (fi / FI 0 * 100, जहां FI 0 एटीपी जोड़ने से पहले एल्बुमिन-घंटी छिड़काव के दौरान औसत आधारभूत फाई) में परिवर्तन की गणना के द्वारा शून्य से मापा जाता पृष्ठभूमि। समय के साथ FI DAF की पहली अंतर रूपांतरण द्वारा आयोजित सं उत्पादन दर यों।
    नोट: FI DAF के समय पाठ्यक्रम समय के साथ एक संचयी सं उत्पादन का प्रतिनिधित्व करता है। इसलिए, कोई उत्पादन दर दोनों बेसल और एटीपी प्रेरित शर्तों के तहत वित्तीय DAF की प्रोफाइल के आधार पर गणना की है। डेटा विश्लेषण और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का विवरण पिछले एक प्रकाशन 7 में वर्णित किया गया है।

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Representative Results

इस खंड में इस प्रोटोकॉल के साथ विकसित सुसंस्कृत microvessel नेटवर्क के साथ प्राप्त परिणामों के कुछ पता चलता है। Microchannel पैटर्न एक तीन स्तर शाखाओं के नेटवर्क (चित्रा 1 ए) है। इस डिजाइन में, एक 159 माइक्रोन विस्तृत मां चैनल दो 126 माइक्रोन विस्तृत चैनल, और शाखाओं में फिर से चार 100 माइक्रोन विस्तृत बेटी चैनलों में शाखाएं। एक 3 डी संख्यात्मक सिमुलेशन 0.35 μl / मिनट के प्रवाह की दर (चित्रा 1 बी), जो इस microchannel नेटवर्क के भीतर कतरनी तनाव के तीन विभिन्न स्तरों इंगित करता तहत कतरनी तनाव वितरण अनुमान लगाने के लिए किया गया था। microchannels भीतर लामिना का प्रवाह से परेशान या माध्यमिक प्रवाह की उपस्थिति के बिना hydrodynamically स्थिर होने की भविष्यवाणी की है। बाद एक SU-8 मास्टर ढालना एक मानक photolithography प्रक्रिया (चित्रा 1 सी) के साथ निर्मित किया गया था, एक PDMS डिवाइस microchannel ne को दोहराने के लिए नरम लिथोग्राफी के माध्यम से निर्मित किया गया थाएक पारदर्शी, हवा पारगम्य पाड़ (- ई चित्रा -1) में twork डिजाइन। चुनाव आयोग बोने (चित्रा 1F - जी) के बाद और सतत छिड़काव के 3-4 दिन, ईसीएस संगम पर पहुंच गया और सफलतापूर्वक microchannels की भीतरी सतहों को कवर किया।

चुनाव आयोग एफ actin और नाभिक fluorescently नेटवर्क के भीतर लेबल और confocal छवियों के साथ सचित्र थे। 1.0 डाएन / 2 सेमी की कतरनी तनाव के तहत, HUVECs के बारे में 30%, वृद्धि हुई केंद्रीय तनाव फाइबर के साथ प्रवाह दिशा के साथ लम्बी जबकि बाकी 70% बहुल परिधीय एफ actin 5 के साथ अपने पत्थर पैटर्न को बनाए रखा। कतरनी प्रेरित सेल आकार परिवर्तन है कि आमतौर पर 2 डी स्थिर सेल संस्कृतियों में मनाया से कम प्रमुख प्रकट होता है। इन विवो की शर्तों के तहत वास्तव में, ईसीएस वाहिकाओं के विभिन्न प्रकारों में अलग सेल आकार है, लेकिन आसानी से प्रवाह चा के जवाब में सेल आकार में परिवर्तन नहींnges। अधिक अध्ययन निर्धारित करने के लिए इस अंतर यह है कि इन विवो की स्थिति के करीब हैं चैनल ज्यामिति और छिड़काव के माहौल का परिणाम था कि क्या जरूरत है।

हम भी सफलतापूर्वक चुनाव आयोग में एटीपी प्रेरित परिवर्तन [सीए 2 +] मैं और कोई उत्पादन (आंकड़े 4 और 5) मापा जाता है। चुनाव आयोग में एटीपी प्रेरित क्षणिक बढ़ जाती है [सीए 2 +] मैं और कोई उत्पादन। मतलब चोटी FI Fluo 4 आधारभूत है, जो एटीपी छिड़काव की शुरुआत के बाद 35 ± 10 सेकंड पर हुई 187 ± 22% थी। सं उत्पादन दर एटीपी जोखिम के पहले पांच मिनट के भीतर प्रति मिनट 1.18 ± 0.37 एयू के लिए प्रति मिनट 0.15 ± 0.05 एयू की एक बेसल स्तर से वृद्धि हुई थी। सभी परिणाम मतलब ± मानक त्रुटि (एसई) के रूप में सूचित किया गया। वे व्यक्तिगत रूप से भरकर रखा बरकरार venules 6,9,14,19 से निकाली गई परिणामों के लिए तुलना कर रहे हैं।


चित्रा 1: Microfluidic उपकरण निर्माण और चुनाव आयोग लोड हो रहा है (ए) microchannel नेटवर्क के योजनाबद्ध देखें।। microchannels की चौड़ाई और विभाजन के कोण प्रत्येक शाखाओं में बंटी के स्तर पर संकेत कर रहे हैं। (बी) कतरनी तनाव वितरण की संख्यात्मक सिमुलेशन। प्रवाह की दर 0.35 μl / मिनट है। विकास के बाद microchannel की ऊंचाई 80 मीटर है। इन दोनों आंकड़ों अतिरिक्त विवरण 5 के साथ पिछले प्रकाशन से संशोधित किया गया है। (सी) मास्टर मोल्ड के विकास। microchannel नेटवर्क के मास्टर मोल्ड सिलिकॉन वेफर पर SU-8 photoresist के साथ निर्मित है। (डी) नरम लिथोग्राफी की प्रक्रिया। PDMS मिश्रण मास्टर मोल्ड पर casted और एक ओवन में ठीक हो जाता है। (ई) संबंध PDMS सब्सट्रेट करने के लिए चैनल। इस डिवाइस के लिए इस्तेमाल किया सब्सट्रेट एक coverslip एसपीआई हैn PDMS की एक पतली परत के साथ लेपित। इनलेट और आउटलेट एक छेद छेदने के साथ बनाया जाता है। (एफ और जी) चुनाव आयोग लोड हो रहा है। सेल के समाधान के बारे में 10 μl प्रवेश पर रखा गया है। एक सज्जन प्रवाह तो केशिका प्रवाह के माध्यम से दुकान पर एक पाश्चर विंदुक रखने से प्रेरित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: सुसंस्कृत microchannel नेटवर्क में चुनाव आयोग एफ actin के confocal छवियों (ए) के नेटवर्क के डिजाइन का एक योजनाबद्ध देखें।। में बी दिखाए चयनित क्षेत्रों - डी ग्राफ में संकेत कर रहे हैं। (बी - डी) में इन विट्रो microvessel नेटवर्क के चुनाव आयोग एफ actin (लाल) और नाभिक (नीला) के confocal छवियों बी 1। सी 1 और डी 1 microchannel छवि के ढेर के शीर्ष आधा, और बी 2, सी 2, डी और 2 से पेश छवियों छवि के ढेर के निचले आधे से छवि अनुमानों रहे हैं। डी 1, स्केल बार = 100 माइक्रोन - ई पार के अनुभागीय दृश्य बी 1 में 1-1, 2-2, 3-3 और 'के रूप में संकेत दिया। इन छवियों को पिछले प्रकाशन 5 से अनुकूलित कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: की तुलना VE-cadherin स्थिर रुप से सुसंस्कृत चुनाव आयोग monolayer और बरकरार चूहे mesenteric venule साथ सुसंस्कृत microvessel नेटवर्क में वितरण (। बी में दिखाया गया है क्षेत्रों के साथ नेटवर्क डिजाइन की योजनाबद्ध देखें - डी। (बी - डी) VE-cadherin (हरा) और सेल नाभिक (नीला) में इन विट्रो microvessel नेटवर्क डी 1 और डी का धुंधला 2 ऊपर और क्रमश: एक ही विभाजन क्षेत्र से एकत्र अनुमान छवियों के नीचे हैं।। (ई) VE-cadherin स्थिर रुप से सुसंस्कृत ईसीएस के धुंधला हो जाना। (एफ) VE-cadherin व्यक्तिगत रूप से भरकर रखा बरकरार चूहे venule का धुंधला हो जाना। यह आंकड़ा प्रकाशित किया। पहले 5 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: चुनाव आयोग [सीए 2 + में एटीपी प्रेरित बढ़ जाती है p>] मैं। प्रयोगों 4 उपकरणों और 7 से 12 ROIs (व्यक्तिगत ईसीएस) प्रति युक्ति से आयोजित किए गए डेटा के विश्लेषण के लिए चयन किया गया था। (ए) एटीपी के समय पाठ्यक्रम (10 माइक्रोन) के एक प्रतिनिधि प्रयोग से चुनाव आयोग [सीए 2 +] मैं (Fluo 4 fi / FI ± एसई 0 × 100%) में परिवर्तन प्रेरित। (बी) के प्रतिनिधि प्रयोग की छवियों (डेटा एक में दिखाया गया है)। यह एक पहले प्रकाशित आंकड़ा 5 है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: सं उत्पादन एटीपी प्रेरित प्रयोगों 3 उपकरणों में आयोजित की गई है और 11 से 12 ROIs (व्यक्तिगत ईसीएस) डिवाइस प्रति डेटा विश्लेषण के लिए चयन किया गया था।। (ए DAF ± एसई, वाई अक्ष छोड़ दिया) ईसीएस में। सं उत्पादन दर (DF / डीटी, बिंदीदार रेखा), संचित FI DAF (सही वाई अक्ष) की पहली अंतर रूपांतरण से निकाली थी। (बी) के एक प्रयोग से प्रतिनिधि छवियाँ। FI DAF आगे नहीं के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए intracellular DAF-2 की एक पर्याप्त राशि का संकेत के बाद एक सं दाता, सोडियम nitroprusside (एसएनपी), perfusate को जोड़ा गया है में वृद्धि हुई है। यह एक पहले प्रकाशित आंकड़ा 5 है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस अनुच्छेद में, हम सुसंस्कृत microvessel नेटवर्क के विकास के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल मौजूद है, चुनाव आयोग जंक्शनों की और एफ actin वितरण cytoskeleton लक्षण, और चुनाव आयोग की मात्रात्मक मापन [सीए 2 +] मैं और कोई उत्पादन एक microfluidic डिवाइस का उपयोग। Perfused microfluidic युक्ति इन विट्रो मॉडल है कि इन विवो microvascular geometries और कतरनी प्रवाह की स्थिति के एक करीबी अनुकरण की अनुमति देता है प्रदान करता है। चूंकि सुसंस्कृत microvessel नेटवर्क प्राथमिक मानव ईसीएस द्वारा गठित किया जा सकता है, इस दृष्टिकोण की जांच कैसे pathologically रोगी के नमूनों से बदल रक्त घटकों सुसंस्कृत microvessels करने के लिए रोगी के रक्त के नमूनों की प्रत्यक्ष छिड़काव से मानव ईसीएस प्रभावित करते हैं और नैदानिक ​​में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं मुद्दे। मानव विकसित microvessels ईसीएस भी मानव और पशुओं के ऊतकों के बीच दवा प्रतिक्रियाओं में संभावित विसंगतियों से बचने के लिए दवा स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

ve_content "> इस प्रोटोकॉल में दिखाया गया microfluidic उपकरणों की सब्सट्रेट एक गिलास को कवर पर्ची (150-180 माइक्रोन) स्पिन में लिपटे PDMS की एक पतली परत के साथ। PDMS की इस पतली परत उच्च संकल्प और जीवित ऊतक वास्तविक समय के लिए आवश्यक है इमेजिंग, क्योंकि बड़े संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्यों को आमतौर पर कम दूरी काम microchannel (submillimeter रेंज) के भीतर लामिना का प्रवाह है। एक बहुत कम रेनॉल्ड्स संख्या है, और दबाव अंतर रैखिक प्रवाह से संबंधित है, इस प्रकार कतरनी तनाव वितरण पूरी तरह से निर्भर है चैनल पर रेखागणित। इसलिए, यह उच्च सटीकता छिड़काव पंप 20 से अच्छी तरह से नियंत्रित किया जा सकता है। हमारे वर्तमान अध्ययन में, कतरनी तनाव HUVEC सुसंस्कृत microvessel नेटवर्क के लिए लागू 10 डाएन / 2 सेमी, जो भीतर है 1 के बीच था शिरापरक प्रणाली 21,22 में मापा कतरनी तनाव की सीमा होती है। इस तरह के समानांतर प्रवाह कक्ष के रूप में मैक्रो-fluidic सिस्टम जटिल प्रवाह पैटर्न का अभाव है। बड़े पैमाने प्रवाह कक्षों (मिमी सेमी रेंज में), ईसीएस आमतौर पर केवल नीचे की सतह (2D monolayer) में बड़े हो रहे हैं, विवो में microvessels के लिए ज्यामितीय समानता कमी। जब प्रवाह कक्ष की चौड़ाई 2 मिमी से अधिक है, सजातीय प्रवाह एक क्षेत्र आमतौर पर आउटलेट / प्रवेश से कई मिलीमीटर की दूरी पर है कि एक दो सौ ओर दीवार 23 से दूर माइक्रोन तक ही सीमित है, और। कक्ष की चौड़ाई सेंटीमीटर की सीमा तक बढ़ जाती है जब, प्रवाह विभिन्न सुव्यवस्थित में अंतर होगा और प्रवाह वेग पूरे क्षेत्र में 24 के पार बदल जाएगा। इसके अतिरिक्त, बड़े पैमाने प्रवाह कक्ष कि microchannels के रूप में ही कतरनी तनाव को प्राप्त करने के लिए कम से कम 100 गुना अधिक perfusate सेवन करती है। microchannel नेटवर्क के भीतर कतरनी तनाव वितरण एक संख्यात्मक मॉडलिंग उपकरण का उपयोग कर प्रेरित किया जा सकता है, और स्थिर असंपीड्य Navier स्टोक्स समीकरणों सबसे परिमित तत्व सॉफ्टवेयर द्वारा हल किया जा सकता है।

microfluidic युक्ति एक singl के साथ बनाया जा सकता हैई मुखौटा microfabrication प्रक्रिया। सुसंस्कृत microvessel विकास की सफलता, हालांकि, विवरण के लिए विशेष ध्यान की आवश्यकता है। microchannels में समाधान लोड करने के बाद, प्रत्येक डिवाइस चुनाव आयोग बोने से पहले खुर्दबीन के नीचे बुलबुला फँसाने के लिए जाँच की जरूरत है। एक बुलबुला होता है, यह अभी भी संभव है एक बंद दुकान के साथ प्रवेश पर एक हाइड्रोलिक दबाव को लागू करने से इस स्तर पर इसे बाहर मजबूर करने के लिए है, के रूप PDMS एक हवा पारगम्य सामग्री है। एक वांछित छिड़काव दर को बनाए रखने के लिए, एक रिसाव के बिना टाइट फिटिंग सुई / ट्यूबिंग कनेक्शन के सभी के लिए आवश्यक है। मिलान किया छेद-पंचर और ट्यूबिंग आकार एक टाइट फिटिंग प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। प्रवाह की दर का एक सटीक वितरण को आश्वस्त करने के लिए, छिड़काव पंप और डिवाइस पर सिरिंज एक ही स्तर पर रखा जाना चाहिए। perfusate को बदलने के लिए, डाला ट्यूबिंग धीरे डिवाइस से काट दिया जाना चाहिए किसी भी खींच से बचने के लिए। कतरनी तनाव, कदम बढ़ जाती है (18 घंटा में वृद्धि के रूप में इस तरह के 10 कदम) बढ़ाने के लिए सिफारिशों हैंअचानक प्रवाह परिवर्तन से बचने के लिए देद चुनाव आयोग छीलने का कारण बना।

पिछला व्यक्तिगत रूप से भरकर रखा बरकरार microvessels पर प्रदर्शन अध्ययनों से संकेत चुनाव आयोग में एगोनिस्ट प्रेरित बढ़ जाती है [सीए 2 +] मैं, और बाद में endothelial नाइट्रिक ऑक्साइड synthase (एनोस) सक्रियण और कोई उत्पादन भड़काऊ शर्तों 6.7 के तहत बढ़ microvascular पारगम्यता के लिए आवश्यक संकेत दे रहे हैं कि , 9-13,25। इस प्रोटोकॉल में, हम, प्रतिनिधि agonist के रूप में एटीपी चयन के बाद से यह आमतौर पर लाल रक्त कोशिकाओं, एकत्रित प्लेटलेट्स, और घायल ऊतकों द्वारा या vivo में भड़काऊ शर्तों के तहत जारी की है। एक प्रतिदीप्ति कैल्शियम सूचक, Fluo 4 बजे, endothelial में परिवर्तन [सीए 2 +] मैं एटीपी से संपर्क के बाद मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था। चुनाव आयोग [सीए 2 +] मैं सुसंस्कृत microvessels में प्रतिक्रियाएं बरकरार microvessels 7.9 में पाए जाने वाले के समान हैं। मापने चुनाव आयोग सं उत्पादन जीव के लिए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो गया है।तिथि करने के लिए, वहाँ कोई फ्लोरोसेंट सूचक है कि कैल्शियम संकेतकों के लिए एक समान तरीके से कोई एकाग्रता में गतिशील परिवर्तन का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता रहा है। DAF-2 डीए व्यापक रूप से सं उत्पादन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, उचित उपयोग, डेटा की व्याख्या, और डेटा विश्लेषण उपयोगकर्ताओं का ध्यान आकर्षित करने के लिए की जरूरत है। रासायनिक सं की उपस्थिति में DAF-2T को DAF-2 के परिवर्तन के बाद से अपरिवर्तनीय है (एक तरह से रूपांतरण), 26, का पता चला DAF प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफ़ाइल कोई एकाग्रता में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व नहीं करता है। इसके बजाय, यह समय के साथ जमा DAF-2T उत्पादन इंगित करता है। Cumulated DAF-2 प्रतिदीप्ति (एफआई डीएएफ) वक्र, कोई उत्पादन की दर (DF / डीटी) FI DAF 7,11 की पहली अंतर रूपांतरण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है इस के आधार पर। अर्थात्, वित्तीय वक्र के ढलान सं उत्पादन दर को इंगित करता है और पठार चरण आगे नहीं नहीं उत्पादन में वृद्धि हुई इंगित करता है। रूपांतरण के बाद, डेटा इस प्रोटोकॉल पीआर से उत्पन्नesented दोनों बेसल सं उत्पादन दर और उत्पादन में microvessel नेटवर्क के भीतर अलग-अलग चुनाव आयोग के स्तर पर अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ एटीपी के जवाब में बदल जाता है।

वर्तमान में PDMS व्यापक रूप से microfluidic अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है, क्योंकि यह एक ऑप्टिकली, पारदर्शी nontoxic, और गैस पारगम्य मुलायम इलास्टोमेर 27-30 है। हालांकि, बाद से PDMS पानी पारगम्य नहीं है, हम सीधे चुनाव आयोग monolayer के पारगम्यता उपाय नहीं कर सकता है। इस सीमा को पार करने के लिए, कुछ अनुप्रयोगों, संशोधित ऐसे चैनल 31 में एक पारगम्य झिल्ली को एकीकृत या सूक्ष्म स्तंभों या सूक्ष्म छेद 32,33 के साथ एक पारगम्य "खिड़की के उद्घाटन" बनाने के रूप में चैनल दीवार संरचनाओं, जबकि अन्य लोगों पर ध्यान केंद्रित किया गया है ऐसे हाइड्रोजेल उपकरणों या हाइड्रोजेल / PDMS संकर उपकरणों 17,34-36 का उपयोग कर के रूप में डिवाइस सामग्री के संशोधन। इस तरह के उपकरणों की कमियां निर्जलीकरण के लिए उनकी कमजोर प्रकृति और उनके अपेक्षाकृत कमजोर मीटर कर रहे हैंechanical गुण तनाव या दबाव खड़ा करने के लिए। यांत्रिक शक्ति के साथ पारगम्य सामग्री के भविष्य के विकास के लिए आगे डिवाइस और व्यापक जैविक अनुप्रयोगों के लिए अपनी क्षमता में सुधार होगा।

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Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा हितों या परस्पर विरोधी हितों का खुलासा किया है।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान द्वारा समर्थित किया गया HL56237, मधुमेह और पाचन के राष्ट्रीय संस्थान और गुर्दा रोग संस्थान DK97391-03, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF-1227359 और 1003907 ईपीएस) अनुदान।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ATP Sigma-Aldrich A2383
Acetone Fisher Scientific A929
Biopsy punch Miltex 33-31 AA
Bovine Albumin MP Biomedicals 810014
Bovine Brain Extract (BBE) Lonza CC-4098
Cover-slip Fisher Scientific 12-542C
DAF-2 DA Calbiochem 251505
Dextran Sigma-Aldrich 31390
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody Life technologies A-11055
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190-250
DRAQ5 (nuclei staining)  Cell Signaling Technology 4084
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) Sigma-Aldrich E2759-15MG
Fetal Bovine Serum Gibco 16000-044
Fibronectin Gibco PHE0023
Fluo-4 AM Life technologies F-14201
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890-100G
Gentamicin (50 mg/ml) Gibco 15750-078
Glass coverslip Fisher Scientific 12-548B
Glass Pasteur pippette VWR 14672
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-Aldrich H3393-10KU
HEPES Buffered Saline Solution Lonza CC-5024
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) Lonza CC-2517
Isopropyl alcohol (IPA) VWR 89125
L-Glutamine (200 mM) Gibco 25030-081
Mammalian Ringer Solution Ingredient
NaCl (132 mM) Fisher Scientific S671-3
KCl (4.6 mM) Fisher Scientific P217-500
CaCl2 · 2H2O (2.0 mM) Fisher Scientific C79-500
MgSO4 ·7H2O (1.2 mM) Fisher Scientific M63-500
Glucose (5.5 mM) Fisher Scientific BP350-1
NaHCO3 (5.0 mM) Fisher Scientific S233-500
Hepes Salt (9.1 mM) Research Organics 6007H
Hepes Acid (10.9 mM) Research Organics 6003H
MCDB 131 Culture Medium Life technologies 10372-019
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Phalloidin (F-actin staining) Sigma-Aldrich P1951
Phosphate Buffered Saline  Life technologies 14040-133
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Corporation Sylgard 184
Scalpel Exel Int 29552
Scotch tape 3M 34-8711-3070-3
Silicon wafer VWR 14672
SU-8 photoresist MicroChem SU-8 2050 Y111072
SU-8 developer MicroChem Y020100
tissue culture flasks Sigma-Aldrich Z707503-100EA
Triton X-100 Chemical Book T6878
Trypsin Neutralizer solution Gibco R-002-100
Trypsin/EDTA Solution (TE) Gibco R-001-100
Tubing Cole-Parmer PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD
VE-cadherin Santa Cruz Biotechnology SC-6458
Name of Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Biosafety Laminar hood NuAire NU-425 Class II, Type A2
CCD camera Hamamatsu ORCA
Confocal microscope Leica TCS SL
Desiccator Bel-Art F42022
Hotplate Wenesco HP-1212
Incubator Forma Scientific 3110
Isotemp oven Barnstead 3608-5
Lithography bench Karl Suss MA6 Contact Lithography
Optical microscope Nikon L200 ND & Diaphod 300
Shutter for the CCD camera Sutter Instrument Lambda 10-2
Plasma cleaner PVA TePla/Harrick plasma M4L/PDC-32G
Spin coater Brewer Science Cee 200X
Syringe pump system Harvard Apparatus 703005
Name of Software Company Catalog Number Comments/Description
CAD software Autodesk AutoCAD 2015
CFD simulation software COMSOL COMSOL Multiphysics 4.0.0.982
Images acquire and analyse for NO production  Universal Imaging Metafluor

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 111 microvessel endothelial सेल intracellular कैल्शियम नाइट्रिक ऑक्साइड VE-cadherin एफ actin microfluidics
विकास और की विशेषता<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Microvessel नेटवर्क और endothelial की मात्रात्मक मापन [सीए<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; मैं</sub&gt; और नाइट्रिक ऑक्साइड उत्पादन
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Xu, S., Li, X., Liu, Y., He, P.… More

Xu, S., Li, X., Liu, Y., He, P. Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production. J. Vis. Exp. (111), e54014, doi:10.3791/54014 (2016).

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