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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

एक कदम की नकारात्मक Chromatographic शोधन Published: June 18, 2016 doi: 10.3791/54043
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Institute of Molecular and Cellular Biology, National Tsing Hua University, 2Department of Life Science, National Tsing Hua University

Summary

पुनः संयोजक हेलिकोबैक्टर से एक कदम नकारात्मक शुद्धि के लिए एक उच्च उपज विधि बैच मोड में diethylaminoethyl रेजिन का उपयोग वर्णित है के द्वारा न्यूट्रोफिल सक्रिय प्रोटीन (एचपी-एनएपी) कोलाई में overexpressed पाइलोरी। हिमाचल प्रदेश झपकी इस विधि द्वारा शुद्ध टीके, दवाओं, या एच के लिए निदान के विकास के लिए फायदेमंद है पाइलोरी रोगों -associated।

Abstract

हेलिकोबेक्टर न्यूट्रोफिल सक्रिय प्रोटीन (एचपी-एनएपी) हेलिकोबेक्टर (एच पाइलोरी) के एक प्रमुख विषैलापन कारक है। यह एच में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है पाइलोरी न्यूट्रोफिल, monocytes, और मस्तूल कोशिकाओं सहित कई जन्मजात ल्यूकोसाइट्स को सक्रिय करने से आमाशय सूजन प्रेरित। हिमाचल प्रदेश झपकी के immunogenic और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुण यह एच के लिए एक संभावित निदान और टीका उम्मीदवार बनाना पाइलोरी और कैंसर के उपचार के लिए एक नई दवा उम्मीदवार। आदेश शुद्ध हिमाचल प्रदेश झपकी अपनी नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए, एक कारगर तरीका शुद्ध करने के लिए उच्च उपज और पवित्रता के साथ इस प्रोटीन की स्थापना की जानी चाहिए।

इस प्रोटोकॉल में, हम diethylaminoethyl (DEAE) आयन एक्सचेंज रेजिन का उपयोग करके पुनः संयोजक एचपी झपकी कोलाई (ई कोलाई) में overexpressed से एक कदम नकारात्मक chromatographic शुद्धि के लिए एक विधि का वर्णन किया है (जैसे।, Sephadex) मैंn बैच मोड। संयोजक एचपी झपकी ई में कुल प्रोटीन का लगभग 70% का गठन किया कोलाई और लगभग पूरी तरह से पीएच 9.0 पर सेल पर घुलनशील अंश में बरामद किया है। पीएच 8.0 पर इष्टतम स्थिति के अंतर्गत, हिमाचल प्रदेश झपकी के बहुमत अनबाउंड अंश में बरामद किया है, जबकि ई से अंतर्जात प्रोटीन कोलाई कुशलता राल से हटा रहे हैं।

DEAE आयन एक्सचेंज रेजिन के साथ नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी का उपयोग इस शोधन विधि पैदावार ई से कार्यात्मक हिमाचल प्रदेश झपकी उच्च उपज और पवित्रता के साथ अपने मूल रूप में कोलाई। शुद्ध हिमाचल प्रदेश झपकी आगे की रोकथाम, इलाज के लिए उपयोग किया जा सकता है, और एच के रोग का निदान पाइलोरी रोगों के साथ ही कैंसर के उपचार -associated।

Introduction

हेलिकोबेक्टर (एच पाइलोरी) gastritis और पेप्टिक अल्सर का एक प्रमुख कारण है। यह जीवाणु भी कर्क, विश्व स्वास्थ्य संगठन की ओर से अनुसंधान के लिए अंतरराष्ट्रीय एजेंसी से मानव में एक कैसरजन के रूप में वर्गीकृत किया गया है, 1994 में यह अनुमान लगाया गया है कि एच के प्रसार पाइलोरी संक्रमण विकासशील देशों में 70% और औद्योगिक देशों 1 में 30-40% है। हालांकि एच के संक्रमण की दर पाइलोरी औद्योगिक देशों में कम हो रही है, एच के संक्रमण की दर विकासशील देशों में पाइलोरी अभी भी उच्च 2 है। मानक उपचार एच उन्मूलन के लिए पाइलोरी संक्रमण एक प्रोटॉन पंप अवरोध, पल्स पोलियो टीकाकरण, और दो ​​एंटीबायोटिक दवाओं, clarithromycin प्लस amoxicillin या metronidazole 3 के प्रशासन के होते हैं। हालांकि, एच में एंटीबायोटिक प्रतिरोध का उदय पाइलोरी संबंधित अल्सर चिकित्सा नई रणनीति ओ को रोकने के लिए के विकास का आग्रहआर संक्रमण का इलाज। एच के खिलाफ निवारक और / या चिकित्सीय टीकाकरण का विकास पाइलोरी एक वैकल्पिक दृष्टिकोण एच नियंत्रित करने के लिए प्रदान कर सकता है पाइलोरी संक्रमण।

हेलिकोबेक्टर न्यूट्रोफिल सक्रिय प्रोटीन (एचपी-एनएपी), एच पायलोरी का एक प्रमुख कारक डाह, पहले एच के पानी के अर्क में पहचान की गई थी कोशिकाओं endothelial और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) 4 का उत्पादन करने के लिए पालन करने के लिए न्यूट्रोफिल को सक्रिय करने की क्षमता के साथ पाइलोरी। आमाशय mucosa की न्युट्रोफिल घुसपैठ एच में पाया pylori- सक्रिय gastritis के साथ संक्रमित रोगियों पेट की सूजन और ऊतकों को नुकसान हो सकता है। इस प्रकार, हिमाचल प्रदेश झपकी गैस्ट्रिक सूजन है, जो आगे अल्सर या एच कारण बनता प्रेरित करने के लिए न्यूट्रोफिल सक्रिय द्वारा एक रोग भूमिका निभा सकते हैं पाइलोरी गैस्ट्रिक रोगों -associated। फिर भी, हिमाचल प्रदेश झपकी नैदानिक ​​अनुप्रयोगों 5,6 के लिए एक संभावित उम्मीदवार हैं। immunogenic और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी समर्थक के कारणहिमाचल प्रदेश झपकी के perties, इस प्रोटीन टीकों, चिकित्सकीय एजेंटों, और नैदानिक ​​उपकरण विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक चिकित्सीय परीक्षण एच के खिलाफ एक प्रोटीन वैक्सीन के घटकों में से एक के रूप में पुनः संयोजक एचपी झपकी प्रयोग करने के लिए आयोजित किया गया है पाइलोरी। यह टीका पुनः संयोजक एचपी-झपकी, cytotoxin जुड़े जीन एक (CagA), और vacuolating cytotoxin एक (Vaca) प्रोटीन एल्यूमीनियम हीड्राकसीड के साथ तैयार होते हैं और आगे सुरक्षित और मनुष्यों 7 में immunogenic होने का प्रदर्शन किया गया है। इसके अलावा, हिमाचल प्रदेश झपकी (Th1) टी सहायक टाइप 1 को गति प्रदान करने के लिए एक शक्तिशाली immunomodulator रूप में कार्य करता कैंसर के उपचार के लिए 8 प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया -polarized और नीचे Th2 की मध्यस्थता प्रतिरक्षा एलर्जी और परजीवी के संक्रमण 9,10 द्वारा हासिल प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने के लिए। निदान के लिए के रूप में, पुनः संयोजक एचपी झपकी आधारित एलिसा एच में हिमाचल प्रदेश झपकी के खिलाफ सीरम एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए लागू किया गया है पाइलोरी रोगियों 11 -infected। एक अध्ययन में पता चला है कि एच से सीरा में हिमाचल प्रदेश झपकी विशिष्ट एंटीबॉडी का स्तर PYलोरी -infected गैस्ट्रिक कैंसर के रोगियों क्रोनिक gastritis के साथ 12 रोगियों से तुलना में काफी अधिक था। एक अन्य अध्ययन में यह भी पता चला है कि हिमाचल प्रदेश झपकी के खिलाफ सीरम एंटीबॉडी गैर हृदय गैस्ट्रिक ग्रंथिकर्कटता 13 की उपस्थिति के साथ जुड़े रहे हैं। इस प्रकार, पुनः संयोजक एचपी झपकी आधारित एलिसा एच में गैस्ट्रिक कैंसर के रोग का निदान के लिए हिमाचल प्रदेश झपकी के खिलाफ सीरम एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है पाइलोरी रोगियों -infected। साथ में ले ली, शुद्ध हिमाचल प्रदेश झपकी आगे की रोकथाम, इलाज के लिए उपयोग किया जा सकता है, और एच के रोग का निदान पाइलोरी रोगों के साथ ही कैंसर के उपचार -associated।

कई पुनः संयोजक एचपी झपकी की शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया तरीकों के अलावा अपने मूल रूप में कोलाई (ई कोलाई) में व्यक्त अब तक की सूचना दी, एक दूसरे शुद्धि कदम से जुड़े जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी अत्यधिक शुद्ध हिमाचल प्रदेश झपकी 14-16 प्राप्त करने के लिए की जरूरत है । इधर, एक विधि के साथ नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी का उपयोगdiethylaminoethyl (DEAE) आयन एक्सचेंज रेजिन हिमाचल प्रदेश झपकी की शुद्धि ई में overexpressed के लिए वर्णित है उच्च उपज और उच्च शुद्धता के साथ कोलाई। यह शोधन तकनीक मेजबान कोशिका प्रोटीन और / या राल के लिए हिमाचल प्रदेश झपकी के अलावा अन्य अशुद्धियों के बंधन पर आधारित था। पीएच 8.0 से कम, हिमाचल प्रदेश झपकी को छोड़कर लगभग कोई अन्य प्रोटीन अपार अंश से बरामद कर रहे हैं। इस शुद्धि नकारात्मक मोड में DEAE आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी का उपयोग दृष्टिकोण सरल और समय अनबाउंड अंश का संग्रह के माध्यम से एक कदम क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से पुनः संयोजक एचपी झपकी की शुद्धि की अनुमति देकर की बचत है। HP-झपकी, कई अन्य biomolecules, इस तरह के 17, immunoglobulin जी (आईजीजी) 18, हीमोग्लोबिन 19, प्रोटीन फॉस्फेट 20, और डाह कारक flagellin 21 वायरस के रूप में, यह भी नकारात्मक आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया जा करने के लिए सूचित किया गया है के अलावा मोड। नकारात्मक मोड आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी के लिए पसंद किया जाता है, तो दोष छोटे हैंनमूना अधीन में मौजूद घटक 22 शुद्ध किया जा सके। प्राकृतिक या पुनः संयोजक biomolecules की शुद्धि में नकारात्मक क्रोमैटोग्राफी के आवेदन हाल ही में 23 की समीक्षा की गई है।

वर्तमान रिपोर्ट ई में पुनः संयोजक एचपी झपकी की अभिव्यक्ति के लिए कदम प्रोटोकॉल के द्वारा एक कदम प्रदान करता है कोलाई, हिमाचल प्रदेश झपकी DEAE आयन एक्सचेंज रेजिन के साथ नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करने की कोशिकाओं की सेल, और शुद्धि। एक प्रोटीन शुद्धि के लिए वांछित नकारात्मक मोड में आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी के लिए उपयुक्त है, तो वर्णित प्रोटोकॉल भी एक शुद्धिकरण की प्रक्रिया के विकास के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में रूपांतरित किया जा सकता है।

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Protocol

मानव रक्त पूर्व लिखित सूचित सहमति और राष्ट्रीय Tsing हुआ विश्वविद्यालय की संस्थागत समीक्षा बोर्ड, सिंचु, ताइवान से अनुमोदन के साथ स्वस्थ स्वयंसेवकों से एकत्र किया गया था।

1. ई में संयोजक एचपी झपकी की अभिव्यक्ति कोलाई

  1. प्लाज्मिड pET42a झपकी एच से हिमाचल प्रदेश झपकी के डीएनए अनुक्रम युक्त तैयार पाइलोरी 26,695 तनाव के रूप में पहले 16 में वर्णित है। वांछित बिंदु उत्परिवर्तन के रूप में वर्णित के साथ हिमाचल प्रदेश झपकी के डीएनए अनुक्रम युक्त plasmids तैयार (प्रोटोकॉल, चरण 8 देखें)।
  2. ई में ऊपर डीएनए plasmids के 10 एनजी रूपांतरण कोलाई BL21 (DE3) 42 डिग्री सेल्सियस पर 45 सेकंड के लिए गर्मी के झटके से सक्षम कोशिकाओं, लकीर Lysogeny शोरबा पर कोशिकाओं (पौंड) से युक्त 50 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन, और 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते प्लेटों अगर।
  3. के साथ 50 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन व्यक्ति लेग शोरबा के 5 मिलीलीटर युक्त ट्यूबों में एकल कालोनियों टीका लगाना और 3 पर precultures के रूप में उन्हें विकसित170 rpm पर झटकों के साथ 16 घंटे के लिए 7 डिग्री सेल्सियस।
  4. एक 1 एल कुप्पी में 50 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन युक्त लेग शोरबा के 200 मिलीलीटर में ऊपर प्री-संस्कृति कोशिकाओं के 2 मिलीलीटर टीका लगाना। 600 एनएम पर absorbance लगभग पहुंचता है 0.4-0.5 एक यूवी / विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा पता चला जब तक 170 rpm पर झटकों के साथ 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर टीका संस्कृति फ्लास्क सेते हैं।
  5. हिमाचल प्रदेश झपकी की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए 0.4 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ऊपर संस्कृति में 1 एम isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) के 80 μl जोड़ें। 600 एनएम पर absorbance लगभग 1.6-1.7 तक पहुँच जाता है जब तक 3 घंटे के लिए संस्कृति सेते हैं।
  6. अपकेंद्रित्र 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 6000 XG पर कोशिकाओं की सतह पर तैरनेवाला हटा दें। -70 डिग्री सेल्सियस तक शुद्धि पर सेल गोली स्टोर।

2. घुलनशील प्रोटीन अंश युक्त हिमाचल प्रदेश झपकी की तैयारी

नोट: निम्न चरणों के सभी 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है।

  1. सेल पी के Resuspend 50 मिलीलीटरप्रोटोकॉल में 1.6 चरण में तैयार Ellet 20 20 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 9.0, 50 मिमी NaCl युक्त 0.13 मिमी phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF), 0.03 मिमी एन-अल्फा-Tosyl एल lysinyl-chloromethylketone (TLCK), और 0.03 मिलीलीटर मिमी एन Tosyl एल phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) 4 डिग्री सेल्सियस पर पहले से ही 16 में वर्णित है।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक उच्च दबाव homogenizer 7 बार के लिए 15,000 से 20,000 साई की एक सीमा में संचालित के माध्यम से जीवाणु निलंबन से गुजर रहा बैक्टीरिया कोशिकाओं को बाधित।
  3. अपकेंद्रित्र सेल 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पर 30,000 × छ lysate ultracentrifuge एक का उपयोग करके घुलनशील और अघुलनशील प्रोटीन भिन्न अलग करने के लिए। एक बीकर में घुलनशील प्रोटीन अंश के रूप में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के साथ एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर मानक के रूप में ब्रैडफोर्ड विधि द्वारा घुलनशील प्रोटीन अंश के प्रोटीन एकाग्रता उपाय।
  5. वें में से 20 मिलीलीटर में 1 एन एचसीएल के 177.6 μl जोड़ेई घुलनशील प्रोटीन अंश पीएच 8.0 पीएच 9.0 से अपनी पीएच मान को समायोजित करने के लिए प्रोटोकॉल 2.3 कदम से प्राप्त की।
  6. 20 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8.0, 50 मिमी NaCl ऊपर प्रोटीन समाधान में जोड़े अंतिम प्रोटीन एकाग्रता 0.5 मिलीग्राम / एमएल होना करने के लिए बनाने के लिए।

3. ई से पुनः संयोजक एचपी झपकी की शुद्धि DEAE आयन एक्सचेंज रेजिन के साथ नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी द्वारा कोलाई

  1. DEAE रेजिन की 15 मिलीलीटर की तैयारी।
    1. DEAE रेजिन के बाहर 0.6 ग्राम सूखे पाउडर के वजन और कम से कम 1 दिन के लिए कमरे के तापमान पर 20 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8.0, 50 मिमी NaCl के 30 मिलीलीटर में यह रोक देते हैं।
    2. पर 10,000 एक्स राल अपकेंद्रित्र 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जी।
    3. निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    4. 20 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8.0, 50 मिमी NaCl के 15 मिलीलीटर जोड़ें।
    5. दोहराएँ प्रोटोकॉल कदम 3.1.2 3.1.4 से चार गुना अधिक है।
    6. स्टोर 15 मिलीलीटर बाद के उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर राल (30 मिलीलीटर Tris बफर में 50% घोल) बसे।
      नोट: निम्न कदम की सभीएस 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है।
  2. राल के 15 मिलीलीटर के लिए प्रोटोकॉल 2.6 चरण में तैयार घुलनशील प्रोटीन की 45 मिलीलीटर जोड़ें और 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक चुंबकीय उत्तेजक के साथ प्रोटीन / राल घोल हलचल।
  3. एक प्लास्टिक या कांच के स्तंभ को एक पानी निकलने की टोंटी के साथ फिट में प्रोटीन / राल घोल डालो। राल गुरुत्वाकर्षण के तहत व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें।
  4. पानी निकलने की टोंटी प्रोटीन समाधान गुरुत्वाकर्षण प्रवाह से कॉलम के माध्यम से चलाने के लिए जब तक कॉलम में तरल स्तर सिर्फ राल से ऊपर है की अनुमति देने के लिए खुला। प्रवाह के माध्यम से अपार अंश है, जो शुद्ध हिमाचल प्रदेश झपकी होता है के रूप में ले लीजिए।
  5. स्तंभ में ठंडा 20 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8.0, 50 मिमी NaCl के 15 मिलीलीटर जोड़ें।
  6. पानी निकलने की टोंटी खोलें धो बफर गुरुत्वाकर्षण प्रवाह से कॉलम के माध्यम से चलाने के लिए जब तक कॉलम में तरल स्तर सिर्फ राल से ऊपर है की अनुमति है। प्रवाह के माध्यम से धोने के अंश के रूप में ले लीजिए।
  7. दोहराएँ प्रोटोकॉल कदम 3.5 3.6 से चार गुना अधिक अतिरिक्त धोने अंशों इकट्ठा करने के लिए।
  8. एक स्तंभ में ठंडा 20 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8.0, 1 एम NaCl के 15 मिलीलीटर जोड़ें।
  9. पानी निकलने की टोंटी खोलें क्षालन बफर गुरुत्वाकर्षण प्रवाह से कॉलम के माध्यम से चलाने के लिए जब तक कॉलम में तरल स्तर सिर्फ राल से ऊपर है की अनुमति है। प्रवाह के माध्यम से क्षालन अंश के रूप में ले लीजिए।
  10. दोहराएँ प्रोटोकॉल कदम 3.8 3.9 से चार गुना अधिक अतिरिक्त क्षालन भिन्न इकट्ठा करने के लिए।

4. बफर एक्सचेंज और हिमाचल प्रदेश झपकी के endotoxin हटाने DEAE रेजिन के साथ नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध

नोट: शुद्ध हिमाचल प्रदेश झपकी ई में व्यक्त किया कोलाई मुद्रा और endotoxin हटाने न्यूट्रोफिल को प्रोत्साहित करने से पहले बफर के अधीन किया जाना चाहिए।

  1. पहले 24 में वर्णित के रूप में 14 केडीए की आणविक वजन कटऑफ के साथ डायलिसिस ट्यूबिंग का उपयोग करके, Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (डी पीबीएस), पीएच 7.2 करने के लिए शुद्ध हिमाचल प्रदेश झपकी के बफर बदलने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर डायलिसिस प्रदर्शन करना।
  2. एक syring के माध्यम से dialyzed हिमाचल प्रदेश झपकी फ़िल्टरएक सकारात्मक आरोप लगाया, हाइड्रोफिलिक प्रवाह endotoxin दूर करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2.5 से 4 मिलीग्राम / मिनट से लेकर दरों पर एक 20 मिलीलीटर डिस्पोजेबल सिरिंज से जुड़ी झिल्ली के साथ ई फिल्टर।

5. सोडियम dodecyl सल्फेट-जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ), पश्चिमी सोख्ता, मूल निवासी पृष्ठ, जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी, और परिपत्र Dichroism स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा शुद्ध संयोजक एचपी झपकी की आणविक गुणों की विशेषता

  1. विश्लेषण एसडीएस पृष्ठ और युक्त माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी MAb 16F4 25 हाइब्रिडोमा संस्कृति supernatants के साथ पश्चिमी सोख्ता द्वारा शुद्ध पुनः संयोजक एचपी झपकी के रूप में पहले 24 में वर्णित है।
  2. देशी-पृष्ठ और जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध हिमाचल प्रदेश झपकी विश्लेषण के रूप में पहले 26 में वर्णित इसकी oligomeric स्थिति की जांच करने के लिए।
  3. के रूप में पहले 26 में वर्णित इसकी माध्यमिक संरचना की जांच के लिए परिपत्र द्विवर्णता स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा शुद्ध पुनः संयोजक एचपी झपकी का विश्लेषण।

6. एक एसडीएस पृष्ठ जेल की चांदी धुंधला द्वारा हिमाचल प्रदेश झपकी की पवित्रता का मूल्यांकन

  1. फिक्सिंग समाधान के लिए एक चांदी धुंधला किट के निर्माता के निर्देशों के अनुसार, समाधान, चांदी समाधान, समाधान के विकास को संवेदनशील, तैयार समाधान बंद करो, और धोने के समाधान।
  2. एक चांदी धुंधला किट के निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक एसडीएस पृष्ठ जेल की चांदी धुंधला प्रदर्शन करना।
  3. एक इमेजिंग प्रणाली के साथ जेल की छवि मोल।

आरओएस उत्पादन का मापन 7. न्यूट्रोफिल से हिमाचल प्रदेश झपकी से प्रेरित

  1. Dextran घनत्व ढाल centrifugation द्वारा पीछा अवसादन द्वारा मानव heparinized रक्त से मानव न्यूट्रोफिल पृथक रूप में पहले 24 में वर्णित है।
  2. न्यूट्रोफिल से आरओएस उत्पादन का मापन एक luminol निर्भर chemiluminescence परख का उपयोग करके हिमाचल प्रदेश झपकी के साथ प्रेरित।
    1. एक प्लेट रीडर पर मुड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर निर्धारित किया है। एक जगहप्लेट पाठक कक्ष के अंदर खाली फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह से सफेद प्लेट, यह 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने के लिए अनुमति देता है।
    2. , डी-पीबीएस, पीएच 7.2 में प्रोत्साहन मिश्रण तैयार करें उपस्थिति और अनुपस्थिति के साथ 0.9 मिमी 2 CaCl, 0.5 मिमी 2 MgCl, और 13.3 माइक्रोन के 5 अमीनो-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione (luminol) युक्त 0.67 सुक्ष्ममापी endotoxin-हटा हिमाचल प्रदेश झपकी प्रोटोकॉल 4.2 कदम से तैयार की।
    3. 7.1 से 2 x 10 6 कोशिकाओं / डी-पीबीएस, पीएच 7.2 मिलीलीटर में, 5 मिमी ग्लूकोज युक्त प्रोटोकॉल कदम से तैयार मानव न्यूट्रोफिल की एकाग्रता को समायोजित करें।
    4. 96 अच्छी तरह से करते हुए प्लेट के प्रत्येक कुएं में न्युट्रोफिल निलंबन के 50 μl जोड़ें।
    5. अच्छी तरह से प्रति 5 सेकंड के समय के अंतराल पर अच्छी तरह से युक्त न्यूट्रोफिल में प्रोटोकॉल कदम 7.2.2 से तैयार प्रोत्साहन के मिश्रण के 150 μl जोड़ें।
    6. एक प्लेट रीडर का उपयोग करके तीन घंटे की अवधि में अच्छी तरह से प्रति 5 सेकंड के लिए chemiluminescence के उत्सर्जन को मापने।

8।पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) से डीएनए plasmids शरण हिमाचल प्रदेश झपकी म्यूटेंट का निर्माण आधारित साइट-सीधा mutagenesis

नोट: पीसीआर आधारित साइट-सीधा म्युटाजेनेसिस मूल रूप के रूप में, सिवाय इसके कि "चुप" प्रतिबंध साइटों साइट निर्देशित mutagenesis (एसडीएम) -assist सॉफ्टवेयर 28 से mutagenesis प्राइमरों करने के लिए शुरू किए गए थे कि पहले 27 में वर्णित उत्पन्न किया गया था।

  1. पीसीआर प्रतिक्रिया प्रदर्शन करना।
    1. प्लाज्मिड pET42a झपकी के 10 एनजी, 1 टेबल में सूचीबद्ध म्युटाजेनेसिस प्राइमर जोड़े के 1 माइक्रोन, deoxynucleoside triphosphates (dNTPs), और एक पीसीआर ट्यूब में उच्च निष्ठा पीसीआर एंजाइम मिश्रण की 3 इकाइयों विआयनीकृत पानी युक्त के 200 माइक्रोन के जोड़े, एक अंतिम दे रही है 25 μl की मात्रा।
    2. 95 पर पीसीआर चक्र आरंभ डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए टेम्पलेट डीएनए denature, और 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 12 प्रवर्धन चक्र के साथ पालन करने के लिए, टी 1 मिनट के लिए कोई एम -5 डिग्री सेल्सियस, और 6 मिनट के लिए 72 ओ सी।
    3. साथ पीसीआर चक्र समाप्त1 मिनट के लिए टी एम पी पी -5 ओ सी में एक annealing कदम और 30 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक विस्तार कदम है।
  2. 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर DPN मैं प्रतिबंध एंजाइम के 0.4 μl के साथ पीसीआर उत्पाद के 15 μl समझो और फिर agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा DPN मैं इलाज पीसीआर उत्पाद के 2 μl विश्लेषण।
  3. स्क्रीन म्यूटेंट।
    1. ई में पीसीआर उत्पाद के 2 μl रूपांतरण कोलाई DH5α सक्षम 42 डिग्री सेल्सियस पर 45 सेकंड के लिए गर्मी के झटके से कोशिकाओं।
    2. 50 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन युक्त एक लेग थाली पर बदल कोशिकाओं बिखरा हुआ है और 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
    3. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक क्षारीय सेल किट का उपयोग बैक्टीरियल कालोनियों से प्लास्मिड डीएनए अलग।
    4. XhoI प्रतिबंध एंजाइम के साथ प्रोटोकॉल कदम 8.3.3 में अलग-थलग निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार वांछित चुप म्यूटेशन की उपस्थिति सत्यापित करने के लिए प्लास्मिड डीएनए समझो।
    5. अनुक्रमप्लास्मिड डीएनए T7 प्रमोटर प्राइमर के साथ प्रोटोकॉल कदम 8.3.4 द्वारा सत्यापित निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार हिमाचल प्रदेश झपकी म्यूटेंट की कोडिंग दृश्यों के सुधार पुष्टि करने के लिए।

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Representative Results

पुनः संयोजक एचपी झपकी के नकारात्मक शुद्धि की प्रयोगात्मक प्रक्रिया के योजनाबद्ध आरेख ई में व्यक्त किया कोलाई बैच मोड में DEAE आयन एक्सचेंज रेजिन का उपयोग करके चित्र 1 में दिखाया गया है। यह शोधन तकनीक मेजबान कोशिका प्रोटीन और / या राल के लिए हिमाचल प्रदेश झपकी के अलावा अन्य अशुद्धियों के बंधन पर आधारित है। पीएच 8.0 से कम, अपने मूल रूप में हिमाचल प्रदेश झपकी को छोड़कर लगभग कोई अन्य प्रोटीन अपार अंश (चित्रा 2A और बी) से बरामद कर रहे हैं। अनबाउंड अंश में शुद्ध हिमाचल प्रदेश झपकी हिमाचल प्रदेश झपकी (चित्रा 2 सी) के खिलाफ एंटीबॉडी द्वारा immunodetected गया था, और के रूप में चांदी धुंधला (चित्रा 2 डी) द्वारा की पुष्टि की शुद्धता अधिक से अधिक 97% थी। इसके अलावा, शुद्ध पुनः संयोजक एचपी झपकी के रूप में देशी-पृष्ठ (चित्रा 2 बी) और जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी (चित्रा 3) के द्वारा विश्लेषण इसकी oligomeric प्रपत्र रखा। परिपत्र द्विवर्णता spectroscopआईसी विश्लेषण से पता चला है कि मुख्य रूप से शुद्ध प्रोटीन α-सर्पिलों (3B चित्रा) से बना था। इसके अलावा, शुद्ध हिमाचल प्रदेश झपकी मानव न्यूट्रोफिल उत्तेजक आरओएस (चित्रा 3 सी) का उत्पादन करने में सक्षम था। इस प्रकार, पुनः संयोजक एचपी झपकी इस दृष्टिकोण से शुद्ध जैविक गतिविधि के साथ अपने मूल रूप में है। इसके अलावा, इस नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी, एक कदम में बिंदु उत्परिवर्तन के साथ पुनः संयोजक एचपी झपकी शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। के रूप में 4 चित्र में दिखाया दो पुनः संयोजक एचपी झपकी Y101H और हिमाचल प्रदेश झपकी E97GY101H म्यूटेंट, नकल जो एच के हिमाचल प्रदेश झपकी पाइलोरी एनसीटीसी 11639 और 11637 एनसीटीसी में तनाव, क्रमशः, पवित्रता 95% से अधिक के साथ इस नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया गया।

नकारात्मक मोड बैच DEAE रेजिन का उपयोग कर शुद्ध करने के लिए हिमाचल प्रदेश झपकी क्रोमैटोग्राफी प्रदर्शन के लिए, शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया बफर का पीएच मान 8.0 के लिए समायोजित किया जाना चाहिएयह सुनिश्चित करने के लिए है कि हिमाचल प्रदेश झपकी के बहुमत अनबाउंड अंश में मौजूद है। हिमाचल प्रदेश झपकी की कम राशि अपार भागों में मौजूद था जब बफर का पीएच मान अधिक या 8.0 (चित्रा 5) की तुलना में कम थी। हालांकि अपार भागों में हिमाचल प्रदेश झपकी वर्तमान की पवित्रता को सिर्फ एक छोटा सा बढ़ गया था के रूप में पीएच: 9.0 करने के लिए 7.0 से वृद्धि हुई है, अपार भागों में हिमाचल प्रदेश झपकी वर्तमान की राशि सबसे ज्यादा था जब बफर का पीएच मान पीएच था 8.0 (चित्रा 5)। राल पर लोड सेल lysates से घुलनशील प्रोटीन की राशि इस शुद्धि के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक है। इधर, अनुपात ई से अशुद्धियों को अवशोषित करने में राल की अधिकतम क्षमता प्राप्त करने के लिए मिली लीटर प्रति राल प्रोटीन के 1.5 मिलीग्राम है कोली (चित्रा 6)। इसके अलावा, पवित्रता और हिमाचल प्रदेश झपकी इस नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी द्वारा प्राप्त की उपज में काफी के घुलनशील अंश में हिमाचल प्रदेश झपकी वर्तमान की राशि में वृद्धि से बढ़ाया जा सकता हैई कोलाई lysates। संयोजक एचपी झपकी लगभग पूरी तरह से पीएच 9.0 (चित्रा 7) पर सेल पर घुलनशील अंश में बरामद किया गया था। हालांकि ई में पुनः संयोजक एचपी झपकी की घुलनशीलता जब कोशिकाओं पीएच 9.0 से कम के साथ बफर में lysed थे कोलाई lysates उल्लेखनीय वृद्धि हुई किया गया था जब कोशिकाओं पीएच 7.5 (चित्रा 7) की तुलना में अधिक के साथ बफर में lysed थे, हिमाचल प्रदेश झपकी के कम से कम 90% घुलनशील प्रोटीन के रूप में उपस्थित थे।

आकृति 1
चित्रा 1:। नकारात्मक बैच मोड में DEAE रेजिन द्वारा हिमाचल प्रदेश झपकी की शुद्धि के योजनाबद्ध रूपरेखा शुद्धि एक बैच बाध्यकारी प्रक्रिया के साथ शुरू होता है। घुलनशील प्रोटीन हिमाचल प्रदेश झपकी बैक्टीरियल lysates से प्राप्त युक्त अंश DEAE राल पीएच 8.0 पर Tris बफर के साथ पूर्व equilibrated में जोड़ा जाता है। प्रोटीन / राल slurries तो कोमल मिक्सी के साथ 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर incubated हैंएनजी। ऊष्मायन के दौरान, मेजबान कोशिका प्रोटीन राल के लिए बाध्य। अनबाउंड अंश में हिमाचल प्रदेश झपकी वर्तमान या तो centrifugation या एक स्तंभ गुरुत्वाकर्षण प्रवाह से चलाने से प्रवाह के माध्यम से अंश के बाद सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करके प्राप्त की है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। हिमाचल प्रदेश झपकी DEAE आयन एक्सचेंज रेजिन के साथ नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी द्वारा की शुद्धि की अनुकरणीय परिणाम पूरे सेल lysate (डब्ल्यू) और ई के घुलनशील प्रोटीन अंश (एस) कोलाई BL21 (DE3) HP-झपकी और अपार अंश (यू) DEAE आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी से हिमाचल प्रदेश झपकी युक्त व्यक्त एसडीएस पृष्ठ (ए), देशी-पृष्ठ (बी), और पश्चिमी सोख्ता (सी) द्वारा विश्लेषण किया गया। अपार इन्हीं1 माइक्रोग्राम से 10 माइक्रोग्राम से लेकर प्रोटीन का संकेत दिया राशि के साथ tion एक रजत से सना हुआ एसडीएस पृष्ठ जेल (डी) पर विश्लेषण किया गया था। आण्विक जनता (एम) केडीए में दाग जैल और धब्बा की बाईं तरफ संकेत कर रहे हैं। (संदर्भ 24 से अनुकूलित) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: स्ट्रक्चरल और संयोजक एचपी झपकी के कार्यात्मक विशेषताओं ई से शुद्ध कोलाई नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी द्वारा। (ए) यूवी absorbance प्रोफ़ाइल हिमाचल प्रदेश झपकी एक जेल निस्पंदन स्तंभ से eluted के लिए दर्ज किया गया था। प्रोटीन मार्कर की आणविक जनता वर्णलेख पर संकेत दिया गया था। (बी) दूर यूवी परिपत्र द्विवर्णता spectहिमाचल प्रदेश झपकी की रम 195 से 260 एनएम के तरंग दैर्ध्य सीमा पर दर्ज किया गया था। (सी) मानव न्यूट्रोफिल (1 x 10 5 कोशिकाओं), 0.5 माइक्रोन के हिमाचल प्रदेश झपकी और डी पीबीएस, पीएच 7.2 के साथ इलाज किया गया 37 डिग्री सेल्सियस पर एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में। न्यूट्रोफिल से उत्पन्न आरओएस की सामग्री को एक luminol निर्भर chemiluminescence परख का उपयोग करके लगातार मापा गया था। डेटा तीन प्रतियों में एक प्रयोग के मानक विचलन ± मतलब के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे थे। (संदर्भ 24 से अनुकूलित) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: हिमाचल प्रदेश संयोजक झपकी ई में व्यक्त म्यूटेंट की शुद्धि नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी द्वारा कोलाई ई। के घुलनशील प्रोटीन भिन्न कोलाई BL21 (डे3) दो पुनः संयोजक एचपी झपकी Y101H और हिमाचल प्रदेश झपकी E97GY101H म्यूटेंट व्यक्त करने और जंगली प्रकार हिमाचल प्रदेश झपकी DEAE रेजिन के साथ नकारात्मक मोड क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया गया। अपार अंशों एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया गया। आण्विक जनता (एम) केडीए में दाग जैल के बाईं तरफ संकेत कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: हिमाचल प्रदेश संयोजक झपकी की शुद्धि ई में व्यक्त बफर पीएच का प्रभाव नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी द्वारा कोलाई ई। के घुलनशील अंश कोलाई BL21 (DE3) हिमाचल प्रदेश झपकी पीएच 9.0 पर lysed व्यक्त संकेत दिया पीएच 7.0 से 9.0 से लेकर 0.3 और मिलीग्राम / एमएल के एक प्रोटीन एकाग्रता के लिए समायोजित किया गया। ये समायोजितभिन्न, लोड के रूप में संकेत दिया है, तो DEAE रेजिन पर लादा गया था 4 डिग्री सेल्सियस पर नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी द्वारा पुनः संयोजक एचपी झपकी शुद्ध करने के लिए। अपार धो लें और क्षालन भिन्न एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया गया। आण्विक जनता (एम) केडीए में दाग जैल के बाईं तरफ संकेत कर रहे हैं। (संदर्भ 24 से अनुकूलित) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: प्रोटीन की मात्रा सफ़ाई संयोजक एचपी झपकी ई में व्यक्त DEAE रेजिन पर लोड का प्रभाव कोलाई ई। के घुलनशील प्रोटीन भिन्न कोलाई BL21 (DE3) व्यक्त हिमाचल प्रदेश झपकी के अनुसार DEAE रेजिन पर लोड कर रहे थे रेजिन recombi को शुद्ध करने की मिली लीटर प्रति मिलीग्राम प्रोटीन का संकेत दिया अनुपातNant हिमाचल प्रदेश झपकी पीएच 8.0 पर नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी द्वारा। घुलनशील प्रोटीन, लोड (एल), अबाध अंश (ए), धोने अंश (बी), और क्षालन अंश (सी) एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया गया के रूप में संकेत दिया। आण्विक जनता (एम) केडीए में दाग जैल के बाईं तरफ संकेत कर रहे हैं। (संदर्भ 24 से) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7: ई में हिमाचल प्रदेश झपकी की घुलनशीलता पर पीएच का प्रभाव कोलाई lysates। (ए) ई कोलाई BL21 (DE3) व्यक्त हिमाचल प्रदेश झपकी संकेत दिया 7.0 से 9.5 से लेकर पीएच पर ठंडा Tris एचसीएल बफर में निलंबित कर दिया गया था। कोशिकाओं lysed रहे थे और फिर पूरे सेल lysates (डब्ल्यू) टी centrifuged थेओ घुलनशील भिन्न (एस) और अघुलनशील छर्रों (आई) अलग। प्रोटीन एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया गया। आण्विक जनता (एम) केडीए में दाग जैल के बाईं तरफ संकेत कर रहे हैं। (ख) प्रत्येक पीएच पर पूरे सेल lysate में पुनः संयोजक एचपी झपकी की घुलनशीलता का प्रतिशत घुलनशील अंश (एस) पूरे सेल lysate के लिए है कि विभाजित के लिए एसडीएस जैल पर हिमाचल प्रदेश झपकी बैंड की तीव्रता से गणना की गई (डब्ल्यू )। डेटा कम से कम दो प्रयोगों के मानक विचलन ± मतलब के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे थे। (संदर्भ 24 से) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1: प्राइमर mutagenesis के लिए इस्तेमाल किया। कृपया सीएलइस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ Ick।

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत DEAE आयनों विनिमय रेजिन के साथ नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी पुनः संयोजक एचपी झपकी ई कोलाई में overexpressed की शुद्धि के लिए उपयुक्त है। सेल और शुद्धि के चरणों में इस्तेमाल किया बफ़र्स का पीएच मान बहुत ई में हिमाचल प्रदेश झपकी की घुलनशीलता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं कोलाई lysates और मेजबान सेल दोष से पुनः संयोजक एचपी झपकी के कुशल जुदाई, क्रमशः। बैक्टीरियल कोशिकाओं पीएच 9.0 पर lysed किया जाना चाहिए, और नकारात्मक शुद्धि उच्च उपज और उच्च शुद्धता में हिमाचल प्रदेश झपकी प्राप्त करने के लिए पीएच 8.0 से किया जाना चाहिए। हिमाचल प्रदेश झपकी की विशिष्ट वसूली 90% है, और ठेठ पवित्रता 95% 24 है। चूंकि हिमाचल प्रदेश झपकी अनबाउंड अंश में मौजूद है, राल का एक न्यूनतम लेकिन पर्याप्त मात्रा में अशुद्धियों को अवशोषित करने की क्षमता अधिक से अधिक प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। हमारे मामले में, अधिकतम लोड क्षमता ई से घुलनशील प्रोटीन के 1.5 मिलीग्राम है मिली लीटर प्रति राल कोलाई lysates।

प्रावधानोंदेद प्रोटोकॉल एक 50 मिलीलीटर ई से पुनः संयोजक एचपी झपकी की शुद्धि के लिए डिज़ाइन किया गया है कोलाई संस्कृति। हिमाचल प्रदेश झपकी की उपज लगभग 15 मिलीग्राम है। शुद्धिकरण की प्रक्रिया या तो स्केल नीचे जा सकता है या बढ़ाया अप तदनुसार। उदाहरण के लिए, दो पुनः संयोजक एचपी झपकी Y101H और हिमाचल प्रदेश झपकी E97GY101H म्यूटेंट 1 मिलीलीटर ई से शुद्ध कर रहे थे इस नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके कोलाई संस्कृति। पवित्रता 95% से अधिक के साथ दोनों HP झपकी म्यूटेंट अपार अंश (चित्रा 4) को इकट्ठा करके प्राप्त किया गया। यह नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी भी एक 860 मिलीलीटर ई से पुनः संयोजक एचपी झपकी शुद्ध करने के लिए लागू किया गया है कोलाई संस्कृति। DEAE नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कदम की वसूली पवित्रता 90% से अधिक के साथ 97% तक पहुँच गया है।

हिमाचल प्रदेश झपकी बेसिलस subtilis में व्यक्त (बी subtilis) भी सफलतापूर्वक इस DEAE नकारात्मक मोड बैच क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया गया हैएक कदम और 26 में। हमारे बी में subtilis अभिव्यक्ति प्रणाली, हिमाचल प्रदेश झपकी की अभिव्यक्ति का स्तर कम है। हिमाचल प्रदेश झपकी केवल बैक्टीरियल lysates से कुल घुलनशील प्रोटीन का लगभग 5% के लिए खातों। हालांकि हिमाचल प्रदेश झपकी शुद्धि के लिए लक्षित कुशलता से लगभग सभी अंतर्जात दूर करने के लिए एक छोटी राशि है, पवित्रता अधिक से अधिक 90% राल पर लोड सेल lysates से प्रोटीन की मात्रा के अनुपात को कम करने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है के साथ हिमाचल प्रदेश झपकी में मौजूद है बी से प्रोटीन subtilis 26। इस प्रकार, इस विधि को भी पुनः संयोजक एचपी झपकी अन्य बैक्टीरियल मेजबान टीम में व्यक्त शुद्ध करने के लिए लागू किया जा सकता है।

कई तरीकों अपने मूल रूप में 14-16 पुनः संयोजक एचपी झपकी की शुद्धि के लिए सूचित किया गया है। हालांकि, एक अतिरिक्त जेल निस्पंदन chromatographic कदम उच्च शुद्धता में हिमाचल प्रदेश झपकी प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। यह नकारात्मक chromatographic शुद्धि कुशलता से एक कदम में उच्च शुद्धता के साथ कार्यात्मक पुनः संयोजक एचपी झपकी उपज कर सकते हैं। additi मेंपर, विलवणीकरण कदम अनबाउंड अंश में कम नमक एकाग्रता की वजह से जरूरत नहीं है। बैच मोड शुद्धि भी एक स्तंभ के लिए जरूरत नहीं रहेगी सकता है। इस प्रकार, इस नकारात्मक मोड बैच DEAE राल का उपयोग कर क्रोमैटोग्राफी उच्च उपज और पवित्रता के साथ अपने मूल रूप में हिमाचल प्रदेश पड़ना शुद्ध करने के लिए एक सरल और कारगर तरीका प्रदान करता है। हिमाचल प्रदेश झपकी इस विधि द्वारा शुद्ध आगे एच के लिए टीके, नई दवाओं, और निदान के विकास के लिए उपयोग किया जा सकता पाइलोरी रोगों या अन्य नए चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए संबंधित।

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http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&region=TW
Protein standard (bovine serum albumin) Sigma-Aldrich P5619  a standard protein for Bio-Rad Protein Assay
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DEAE–Sephadex  A-25 chloride form Sigma-Aldrich A25120 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&region=TW
Spectrum/Por dialysis tubing Spectrum Laboratories 132720 with molecular weight cutoff of 14 kDa
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Acrodisc® units with Mustang® E membrane Pall MSTG25E3 for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min
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mouse monoclonal antibody MAb 16F4 N/A N/A raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23;  A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA
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Flat bottom 96-well white plate Thermo Fisher Scientific Inc 236108 http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html
Luminol Sigma-Aldrich A8511 protected from light
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Expand  long template PCR system Sigma-Aldrich 11681834001 source of High Fidelity PCR enzyme mix
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Dpn I New England Biolabs R0176S https://www.neb.com/products/r0176-dpni
Xho I New England Biolabs R0146S https://www.neb.com/products/r0146-xhoi
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Name Company Product Number Comments
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Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge Hitachi Koki Co 90106401 for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates
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ÄKTA FPLC GE Healthcare Life Sciences 18-1900-26 for gel filtration chromatography
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026
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LAS-3000 imaging system Fujifilm N/A discontinued and replaced
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810
Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter Perkin-Elmer 1420-018 for chemiluminescence detection
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इम्यूनोलॉजी अंक 112 हिमाचल प्रदेश झपकी, DEAE नकारात्मक क्रोमैटोग्राफी अनबाउंड अंश बैच क्रोमैटोग्राफी,
एक कदम की नकारात्मक Chromatographic शोधन<em&gt; हेलिकोबेक्टर</em&gt; न्युट्रोफिल सक्रिय प्रोटीन में overexpressed<em&gt; कोलाई</em&gt; बैच मोड में
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Kuo, T. Y., Hong, Z. W., Tsai, C.… More

Kuo, T. Y., Hong, Z. W., Tsai, C. C., Yang, Y. C., Fu, H. W. One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode. J. Vis. Exp. (112), e54043, doi:10.3791/54043 (2016).

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