Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Ett-trinns Negativ kromatografiske rensing i Published: June 18, 2016 doi: 10.3791/54043
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Institute of Molecular and Cellular Biology, National Tsing Hua University, 2Department of Life Science, National Tsing Hua University

Summary

Et høyt utbytte Fremgangsmåte for ett-trinns negativ rensing av rekombinant Helicobacter pylori nøytrofil-aktiverende protein (HP-NAP) overuttrykt i Escherichia coli ved hjelp av dietylaminoetyl harpikser i batch-modus, er beskrevet. HP-NAP renset ved denne fremgangsmåte er fordelaktig for utvikling av vaksiner, medikamenter, eller diagnostikk for H. pylori -associated sykdommer.

Abstract

Helicobacter pylori nøytrofil-aktiverende protein (HP-NAP) er en viktig faktor virulens av Helicobacter pylori (H. pylori). Det spiller en avgjørende rolle i H. pylori-indusert gastrisk inflammasjon ved å aktivisere flere medfødte leukocytter, inkludert neutrofiler, monocytter og mastceller. De immunogene og immunmodulerende egenskaper av HP-NAP gjør det til en potensiell diagnostisk og vaksinekandidat for H. pylori og et nytt legemiddel kandidat for kreftbehandling. For å oppnå vesentlige mengder av renset HP-NAP som brukes for dens kliniske anvendelser, til en effektiv metode for å rense dette protein med høyt utbytte og renhet må etableres.

I denne protokoll har vi beskrevet en fremgangsmåte for ett-trinns negativ kromatografisk rensing av rekombinant HP-NAP overuttrykt i Escherichia coli (E. coli) ved hjelp av dietylaminoetyl (DEAE) ionebytterharpikser (f.eks., Sephadex) in batch-modus. Rekombinant HP-NAP utgjør nesten 70% av det totale protein i E. coli og er nesten fullstendig gjenvunnet i den oppløselige fraksjonen ved cellelyse ved pH 9,0. Under optimale forhold ved pH 8,0, blir de fleste av HP-NAP gjenvunnet i den ubundne fraksjon, mens de endogene proteiner fra E. coli er effektivt fjernet av harpiksen.

Denne rensemetode med negativt modus batch kromatografi med DEAE ionebytterharpikser gir funksjonell HP-NAP fra E. coli i sin opprinnelige form med høyt utbytte og renhet. Den rensede HP-NAP kan videre benyttes for forebyggelse, behandling, og prognose av H. pylori -associated sykdommer samt kreftbehandling.

Introduction

Helicobacter pylori (H. pylori) er en viktig årsak til gastritt og magesår. Denne bakterien har også blitt klassifisert som kreftfremkallende hos mennesker ved International Agency for Research on Cancer, en del av Verdens helseorganisasjon, i 1994. Det har blitt anslått at forekomsten av H. pylori-infeksjon er 70% i utviklingsland og 30-40% i de industrialiserte landene 1. Selv om infeksjon rate av H. pylori er synkende i de industrialiserte landene, infeksjon rate på H. pylori i utviklingslandene er fortsatt høy 2. Standarden behandling for å utrydde H. pylori-infeksjon består av administrasjon av en protonpumpehemmer, PPI, og to antibiotika, klaritromycin pluss amoxicillin eller metronidazol tre. Men fremveksten av antibiotikaresistens hos H. pylori-relaterte sår terapi oppfordrer til utvikling av nye strategier for å forebygge or kurere infeksjonen. Utvikling av forebyggende og / eller terapeutisk vaksinasjon mot H. pylori kan tilveiebringe en alternativ tilnærming for å styre H. pylori-infeksjon.

Helicobacter pylori nøytrofil-aktiverende protein (HP-NAP), en større virulens faktor av H pylori, ble først identifisert i vann ekstrakter av H. pylori med evne til å aktivere neutrofiler til å over til endotelceller og produsere reaktive oksygenarter (ROS) 4. Neutrofil infiltrasjon av mageslimhinnen som finnes i H. pylori- infiserte pasienter med aktiv gastritt kan føre til betennelse og vevskade av magen. Dermed kan HP-NAP spille en patologisk rolle ved å aktivere nøytrofile å indusere mage betennelse, noe som ytterligere forårsaker magesår eller H. pylori -associated mage sykdommer. Likevel er HP-NAP en potensiell kandidat for kliniske applikasjoner 5,6. På grunn av det immunogene og immunmodulerende proeiendommer av HP-NAP, kan dette proteinet brukes til å utvikle vaksiner, terapeutiske midler og diagnostiske verktøy. En klinisk studie er utført for ved hjelp av rekombinant HP-NAP som en av komponentene i et protein vaksine mot H. pylori. Denne vaksinen består av rekombinant HP-NAP, cytotoxin-assosiert gen A (CagA), og vacuolating cytotoxin A (Vaca) proteiner formulert med aluminiumhydroksid og har videre vist seg å være trygg og immunogen hos mennesker 7. Også HP-NAP fungerer som en potent immunomodulator å utløse T helper type 1 (Th1) -polarized immunresponser for kreftbehandling 8 og å nedregulere Th2-medierte immunresponser fremkalt av allergiske reaksjoner og parasittinfeksjoner 9,10. Som for diagnostikk, har rekombinant HP-NAP-baserte ELISA blitt brukt til å påvise antistoffer mot HP-NAP i H. pylori -infected pasienter 11. En studie viste at nivået av HP-NAP-spesifikke antistoffer i sera fra H. pylori -infected pasienter med magekreft var signifikant høyere enn den fra pasienter med kronisk gastritt 12. En annen studie viste også at serum antistoffer mot HP-NAP er forbundet med tilstedeværelse av ikke-cardia gastrisk adenokarsinom 13. Således kan rekombinant HP-NAP-baserte ELISA anvendes for å påvise antistoffer mot HP-NAP for prognose av magekreft i H. pylori -infected pasienter. Tatt sammen, kan det rensede HP-NAP videre benyttes for forebyggelse, behandling, og prognose av H. pylori -associated sykdommer samt kreftbehandling.

Blant de mange metoder som benyttes for rensing av rekombinant HP-NAP uttrykt i Escherichia coli (E. coli) i sin native form rapportert hittil, et andre rensetrinn som omfatter gelfiltrering kromatografi er nødvendig for å oppnå høyrent HP-NAP 14-16 . Her, en metode under anvendelse av negativ modus satsvis kromatografi meddietylaminoetyl (DEAE) ionebytter-harpikser er beskrevet for rensing av HP-NAP overuttrykkes i E. coli med høy ytelse og høy renhet. Denne renseteknikken er basert på binding av vertscelleproteiner og / eller andre enn HP-NAP til harpiksen urenheter. Ved pH 8,0, er det nesten ingen andre proteiner unntatt HP-NAP utvinnes fra den ubundne fraksjonen. Denne rense tilnærming ved hjelp av DEAE ionebytterkromatografi i negativ modus er enkel og tidsbesparende ved å tillate rensing av rekombinant HP-NAP via ett-trinns kromatografi gjennom innsamling av den ikke-bundne fraksjon. I tillegg til HP-NAP, flere andre biomolekyler, for eksempel virus 17, immunoglobulin G (IgG) 18, hemoglobin 19, proteinfosfatase 20, og virulens faktor flagellin 21, har også blitt rapportert å bli renset ved ione-byttekromatografi på negativ modus. Den negative modus er foretrukket for ione-byttekromatografi hvis forurensninger er mindrekomponenter som er tilstede i prøven underkastet som skal renses 22. Anvendelsen av negative kromatografi i rensing av naturlige eller rekombinante biomolekyler har nylig blitt anmeldt 23.

Denne rapporten gir en trinnvis protokoll for uttrykk av rekombinant HP-NAP i E. coli, lysis av cellene, og rensing av HP-NAP ved hjelp av negativ modus batch-kromatografi med DEAE-ionebytter-harpikser. Hvis et ønsket protein for rensning er egnet for ione-byttekromatografi i negativ modus, kan den beskrevne protokoll også være innrettet som et utgangspunkt for utviklingen av en renseprosess.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Menneskelig blod ble samlet fra friske frivillige med skriftlig informert samtykke og godkjenning fra Institutional Review Board of National Tsing Hua University, Hsinchu, Taiwan.

1. Uttrykk av rekombinant HP-NAP i E. coli

  1. Forbered plasmid pET42a-NAP inneholder DNA-sekvensen av HP-NAP fra H. pylori 26695 belastning som tidligere beskrevet 16. Fremstille plasmider som inneholder DNA-sekvensen av HP-NAP med de ønskede punktmutasjoner som er beskrevet (se protokoll, trinn 8).
  2. Transform 10 ng av de ovenfor nevnte DNA-plasmider i E. coli BL21 (DE3) kompetente celler ved hjelp av varmesjokk i 45 sekunder ved 42 ° C, strek cellene på lysogeni buljong (LB) agarplater inneholdende 50 ug / ml kanamycin, og inkuber platene ved 37 ° C i 16 timer.
  3. Inokuler enkle kolonier i de enkelte rør inneholdende 5 ml LB-næringsløsning med 50 ug / ml kanamycin og dyrke dem som forkulturer ved tre7 ° C i 16 timer med risting ved 170 rpm.
  4. Inokulere 2 ml av de ovennevnte pre-kultur celler i 200 ml LB-næringsløsning inneholdende 50 ug / ml kanamycin i en 1-liters kolbe. Inkuber inokulert kulturflaske ved 37 ° C i 2 timer med rysting ved 170 rpm inntil absorbansen ved 600 nm når omtrent 0,4-0,5 detektert ved en UV / VIS spektrofotometer.
  5. Legg 80 ul av 1 M isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) i den ovenfor angitte kulturen til en sluttkonsentrasjon på 0,4 mM for å indusere ekspresjon av HP-NAP. Inkuber kultur i 3 timer inntil absorbansen ved 600 nm når ca. 1,6-1,7.
  6. Sentrifuger cellene ved 6000 xg ved 4 ° C i 15 min for å fjerne supernatanten. Oppbevar cellepelleten ved -70 ° C frem til rensing.

2. Utarbeidelse av løselig protein fraksjon som inneholder HP-NAP

Merk: Alle de følgende trinn utføres ved 4 ° C.

  1. Resuspender 50 ml av celle pellet fremstilt i protokoll trinn 1.6 i 20 ml 20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 50 mM NaCl inneholdende 0,13 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 0,03 mM N-a-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK), og 0,03 mM N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) ved 4 ° C som tidligere beskrevet 16.
  2. Forstyrre bakteriecellene ved å føre den bakterielle suspensjonen gjennom en høytrykks homogenisator som drives ved en rekkevidde på 15 000 til 20 000 psi for 7 ganger ved 4 ° C.
  3. Sentrifuger cellelysatet ved 30.000 x g ved 4 ° C i 1 time for å skille de løselige og uløselige proteinfraksjoner ved anvendelse av en ultrasentrifuge. Overfør supernatanten som den løselige proteinfraksjon til et begerglass.
  4. Måle proteinkonsentrasjonen av den løselige proteinfraksjon ved hjelp av Bradford-metoden ved å bruke et kommersielt kit med bovint serumalbumin (BSA) som standard i henhold til produsentens instruksjoner.
  5. Legg 177,6 mL av en N HCl i 20 ml the løselige proteinfraksjon erholdt fra protokoll trinn 2.3 for å justere pH-verdien fra pH 9,0 til pH 8,0.
  6. Tilsett 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl til den ovennevnte proteinløsningen for å gjøre den endelige proteinkonsentrasjonen til 0,5 mg / ml.

3. Rensing av rekombinant HP-NAP Fra E. coli ved Negativ modus Batch Kromatografi med DEAE ionebytterharpikser

  1. Forbered 15 ml DEAE harpiks.
    1. Vei opp 0,6 g tørt pulver av DEAE-harpikser og suspendere den i 30 ml av 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl ved værelsestemperatur i minst en dag.
    2. Sentrifuger ved 10000 x harpiksen g ved 4 ° C i 1 min.
    3. Fjern og kast supernatanten.
    4. Tilsett 15 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl.
    5. Gjenta Protocol trinn 3.1.2 til 3.1.4 fire ganger til.
    6. Oppbevar 15 ml avgjort harpiks (50% suspensjon i 30 ml Tris-buffer) ved 4 ° C for etterfølgende bruk.
      Merk: Alle de følgende trinns er utført ved 4 ° C.
  2. Legg 45 ml av de oppløselige proteiner fremstilt i protokoll trinn 2,6 til 15 ml av harpiksen og rør protein / harpiks slurry med en magnetisk rører ved 4 ° C i 1 time.
  3. Hell protein / resin slurryen inn i en plast- eller glasskolonne forsynt med en stoppekran. La harpiksen til å slå seg ned ved hjelp av gravitasjonen.
  4. Åpne stengeventilen for å tillate at proteinløsningen for å kjøre gjennom kolonnen ved tyngdekraftstrømning inntil væskenivået i kolonnen er like over harpiksen. Samle gjennomstrømnings som den ubundne fraksjon, som inneholder det rensede HP-NAP.
  5. Tilsett 15 ml iskald 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl inn i kolonnen.
  6. Åpne stengeventilen for å tillate vaskebufferen for å kjøre gjennom kolonnen ved tyngdekraftstrømning inntil væskenivået i kolonnen er like over harpiksen. Samle gjennomstrømnings som vaskefraksjonen.
  7. Gjenta Protocol trinn 3,5 til 3,6 fire flere ganger for å samle ekstra vask fraksjoner.
  8. Tilsett 15 ml iskald 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl i en kolonne.
  9. Åpne stengeventilen for å tillate elueringsbufferen for å kjøre gjennom kolonnen ved tyngdekraftstrømning inntil væskenivået i kolonnen er like over harpiksen. Samle gjennomstrømnings som elueringsmiddel fraksjon.
  10. Gjenta Protocol trinn 3,8 til 3,9 fire flere ganger for å samle ytterligere elusjonstester fraksjoner.

4. Buffer Exchange og endotoksin Fjerning av HP-NAP Renset ved Negativ modus Batch Kromatografi med DEAE Harpiks

Merk: Det rensede HP-NAP uttrykt i E. coli må underkastes buffer utveksling og endotoksin fjernes før stimulere nøytrofiler.

  1. Utføre dialyse for å endre buffer av den rensede HP-NAP i Dulbeccos fosfatbufret saltoppløsning (D-PBS), pH 7,2, ved 4 ° C ved bruk av dialyserør med molekylvektsperre på 14 kDa som tidligere beskrevet 24.
  2. Filtrer dialysert HP-NAP gjennom en Syringe filter med en positivt ladet, hydrofil membran festet til en 20 ml engangssprøyte ved strømningshastigheter fra 2,5 til 4 ml / minutt ved 4 ° C for å fjerne endotoksin.

5. Karakterisering av de molekylære egenskaper av renset rekombinant HP-NAP etter Sodium Dodecyl Sulfate-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE), Western Blotting, Native-PAGE, Gelfiltreringskromatografi, og sirkulærdikroisme spektroskopi

  1. Analyser renset rekombinant HP-NAP ved SDS-PAGE og western-blotting med hybridomkultursupernatantene inneholdende muse-monoklonalt antistoff MAb 16F4 25 som tidligere beskrevet 24.
  2. Analyser renset HP-NAP av innfødt-PAGE og gelfiltreringskromatografi å undersøke dens oligomere status som tidligere beskrevet 26.
  3. Analyser renset rekombinant HP-NAP ved sirkulærdikroismeanalyse spektroskopi for å undersøke dens sekundærstruktur som tidligere beskrevet 26.

6. Evaluering av renhet av HP-NAP ved Silver Farging av en SDS-PAGE gel

  1. Klargjør fikseringsløsning, sensibiliserende løsning, sølv løsning, utviklende oppløsning, stoppe-løsning, og vaskeoppløsning i henhold til produsentens instruksjoner fra en sølvfarging kit.
  2. Utfør sølvfarging av en SDS-PAGE gel i henhold til produsentens instruksjoner fra en sølvfarging kit.
  3. Erverve et bilde av gelen med et avbildningssystem.

7. Måling av ROS produksjon fra Neutrophils indusert av HP-NAP

  1. Isolere humane nøytrofile celler fra humant heparinisert blod ved dekstransedimentering, fulgt av tetthetsgradient-sentrifugering som tidligere beskrevet 24.
  2. Måling av ROS produksjon fra neutrofiler stimulert med HP-NAP ved hjelp av en luminalen avhengig chemiluminescence analysen.
    1. Slå på en plateleser og temperatur på 37 ° C. Plasser enMåltflatbunnet 96-brønns hvit plate på innsiden av plateavleskammeret, slik at det oppvarmes til 37 ° C.
    2. Klargjør stimulus blandingene i D-PBS, pH 7,2, inneholdende 0,9 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2 og 13,3 uM 5-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalazindion (luminol) med tilstedeværelse og fravær på 0,67 mikrometer endotoksin-fjernet HP-NAP forberedt fra Protocol trinn 4.2.
    3. Juster konsentrasjonen av humane neutrofiler fremstilt av protokoll trinn 7,1 til 2 x 10 6 celler / ml i D-PBS, pH 7,2, som inneholder 5 mM glukose.
    4. Tilsett 50 mL av nøytrofil suspensjon inn i hver brønn av 96-brønns plate mens.
    5. Tilsett 150 ul av stimulerings blandingene fremstilt fra protokoll trinn 7.2.2 inn i brønnen som inneholdt nøytrofiler ved et tidsintervall på 5 sekunder per brønn.
    6. Mål utslipp av kjemiluminiscensen i 5 sekunder per brønn i løpet av et tidsrom på tre timer ved anvendelse av en plateleser.

8.Bygging av DNA plasmider huse HP-NAP Mutanter av Polymerase Chain Reaction (PCR) -baserte Site-direkte Mutagenese

Merk: PCR-basert nettsted Direkt mutagenese ble generert i utgangspunktet som tidligere beskrevet 27, bortsett fra at de "tause" restriksjons ble introdusert for mutagenese primere ved seterettet mutagenese (SDM) -assist programvare 28.

  1. Utfør PCR reaksjon.
    1. Tilsett 10 ng av plasmid pET42a-NAP, 1 uM av mutagenese-primerpar som er oppført i tabell 1, 200 uM av deoksynukleotidtrifosfater (dNTP), og 3 enheter av hi-fi-PCR-enzymblandingen inn i et PCR-rør som inneholdt avionisert vann, hvilket ga en endelig volum på 25 pl.
    2. Initiere PCR-sykluser på 95 ° C i 10 minutter for å denaturere DNA-templat, og følge med 12 amplifiseringscykluser ved 95 ° C i 1 minutt, T m no -5 ° C i 1 minutt, og 72 ° C i 6 min.
    3. Avslutt PCR-sykluser medet glødetrinn ved T m pp -5 ° C i 1 minutt og et forlengelsestrinn ved 72 ° C i 30 minutter.
  2. Behandle 15 pl av PCR-produktet med 0,4 ul av DPn-restriksjonsenzym ved 37 ° C i 2 timer og deretter analysere 2 ul av DPN I-behandlede PCR-produkt ved agarosegelelektroforese.
  3. Skjerm mutanter.
    1. Transform 2 pl av PCR-produktet inn i E. coli DH5a kompetente celler ved varmesjokk i 45 sekunder ved 42 ° C.
    2. Spre de transformerte celler på en LB-plate inneholdende 50 pg / ml kanamycin og inkuber platen ved 37 ° C i 16 timer.
    3. Isolere plasmid-DNA fra de bakterielle koloniene ved hjelp av en kommersiell alkalisk lyseringssett i henhold til produsentens protokoll.
    4. Behandle den plasmid-DNA isolert i protokoll trinn 8.3.3 med Xhol restriksjonsenzym for å bekrefte tilstedeværelsen av de ønskede stille mutasjoner i henhold til produsentens protokoll.
    5. sekvensenplasmid DNA verifisert av protokoll trinn 8.3.4 med T7 promoter primer for å bekrefte korrigering av de kodende sekvenser av HP-NAP mutanter i henhold til produsentens protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det skjematiske diagram av den eksperimentelle fremgangsmåten i negativ rensing av rekombinant HP-NAP uttrykt i E. coli ved hjelp av DEAE-ionebytter-harpikser i batch-modus, er vist i figur 1. Denne renseteknikken er basert på binding av vertscelleproteiner og / eller andre enn HP-NAP til harpiksen urenheter. Ved pH 8,0, er det nesten ingen andre proteiner unntatt HP-NAP i sin opprinnelige form utvinnes fra den ubundne fraksjonen (Figur 2A og B). Det rensede HP-NAP i den ubundne fraksjonen ble immunpåvist av antistoff mot HP-NAP (figur 2C), og dets renhet var høyere enn 97% slik det bekreftes ved hjelp av sølvfarging (figur 2D). I tillegg er det rensede rekombinante HP-NAP beholdt sin oligomere form som analysert ved nativ PAGE (figur 2B) og gelfiltreringskromatografi (figur 3A). Sirkulærdikroismeanalyse spectroscopic-analyse viste at det rensede protein ble i hovedsak består av a-helikser (figur 3B). Også det rensede HP-NAP var i stand til å stimulere humane neutrofiler til å produsere ROS (figur 3C). Således, det rekombinante HP-NAP renset ved denne metode er i sin opprinnelige form med biologisk aktivitet. Videre kan denne negative virkemåte satsvis kromatografi bli anvendt for å rense rekombinant HP-NAP med punktmutasjoner i ett trinn. Som vist i figur 4, er de to rekombinante HP-NAP Y101H og HP-NAP E97GY101H mutanter, som etterligner HP-NAP av H. pylori NCTC 11639 og NCTC 11,637 stammer, respektivt, ble renset ved hjelp av denne negative virkemåte batch-kromatografi med renhet høyere enn 95%.

For å utføre negativ modus satsvis under anvendelse av DEAE-harpikser for å rense HP-NAP, bør pH-verdien i bufferen som brukes for rensing justeres til 8,0for å sikre at mesteparten av HP-NAP er til stede i den ubundne fraksjonen. Mindre mengde av HP-NAP var til stede i de ubundne fraksjonene når pH-verdien til bufferen var høyere eller lavere enn 8,0 (figur 5). Selv om renheten av HP-NAP til stede i de ikke-bundne fraksjoner ble øket bare litt som pH økes 7,0 til 9,0, mengden av HP-NAP til stede i de ubundne fraksjonene var høyest når pH-verdien til bufferen var pH-verdien 8.0 (figur 5). Mengden av de oppløselige proteiner fra cellelysater lastet på harpiksen er en annen viktig faktor for denne rensning. Her er forholdet 1,5 mg proteiner pr milliliter harpiks for å oppnå maksimal kapasitet for harpiksen til å absorbere de forurensninger fra E. coli (figur 6). I tillegg kan renheten og utbyttet av HP-NAP oppnådd ved denne negative virkemåte satsvis kromatografi økes betydelig ved å øke mengden av HP-NAP tilstede i den oppløselige fraksjon avE. coli-lysatene. Rekombinant HP-NAP ble nesten fullstendig gjenvunnet i den oppløselige fraksjonen ved cellelyse ved pH 9,0 (figur 7). Selv om løseligheten av rekombinant HP-NAP i E. coli-lysater ble markert øket når cellene ble lysert i buffer med pH høyere enn 7,5 (figur 7), mindre enn 90% av HP-NAP var til stede som det løselige proteinet når cellene ble lysert i buffer med pH-verdi lavere enn 9,0.

Figur 1
Figur 1:. Skjematisk skisse av Negative Rensing av HP-NAP ved DEAE Harpiks i batch-modus Rense starter med en batch-bindende prosedyre. Den oppløselige proteinfraksjon inneholdende HP-NAP oppnådd fra bakterielle lysater blir tilsatt til DEAE harpiks pre-ekvilibrert med Tris-buffer ved pH 8,0. Proteinene / harpiks-oppslemminger blir deretter inkubert ved 4 ° C i 1 time med forsiktig Mixing. I løpet av inkubasjonen, vertscelle-proteiner bindes til harpiksen. HP-NAP til stede i den ubundne fraksjonen oppnås ved enten å samle supernatanten etter sentrifugering eller gjennomstrømning fraksjon fra en kolonne som drives av tyngdekraften flyt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Fig. 2: Eksempler resultat av rensing av HP-NAP ved negativ modus satsvis kromatografi med DEAE ionebytterharpikser Hele Cellelysatet (W) og oppløselige proteinfraksjon (S) av E. coli BL21 (DE3) som uttrykker HP-NAP og den ikke-bundne fraksjon (U) inneholdende HP-NAP fra DEAE ionebytterkromatografi ble analysert ved SDS-PAGE (A), innfødt-PAGE (B), og western blotting (C). Den ubundne fracdelse med den angitte mengde av proteiner som strekker seg fra 1 ug til 10 ug ble analysert på en sølvfarget SDS-PAGE gel (D). Molekylmasser (M) i kDa er angitt på venstre side av de fargede geler og blot. (Hentet fra referanse 24) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: strukturell og funksjonell karakterisering av rekombinant HP-NAP renset fra E. coli ved negativ modus satsvis kromatografi. (A) UV-absorbans-profil ble registrert for HP-NAP eluert fra en gelfiltreringskolonne. De molekylære masser av proteinmarkørene ble angitt på kromatogrammet. (B) Den langt UV sirkulærdikroismeanalyse SPECTrum av HP-NAP ble spilt inn i bølgelengdeområdet 195 til 260 nm. (C) humant nøytrofile celler (1 x 10 5 celler) ble behandlet med 0,5 uM HP-NAP og D-PBS, pH 7,2, som en negativ kontroll ved 37 ° C. Innholdet av ROS generert fra nøytrofiler ble målt kontinuerlig ved hjelp av en luminol-avhengig kjemiluminescens assay. Data ble representert som gjennomsnittet ± standardavvik fra et forsøk in triplo. (Hentet fra referanse 24) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Rensing av rekombinante HP-NAP Mutanter uttrykt i E. coli ved Negativ modus Batch kromatografi. løselig protein fraksjoner av E. coli BL21 (DE3) som uttrykker to rekombinante HP-NAP Y101H og HP-NAP E97GY101H mutanter og villtype HP-NAP ble renset ved hjelp av den negative måte kromatografi med DEAE-harpikser. De ubundne fraksjonene ble analysert ved SDS-PAGE. Molekylære masser (M) i kDa er angitt til venstre på de fargede geler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Effekt av buffer pH på Rensing av rekombinant HP-NAP uttrykt i E. coli ved Negativ modus Batch kromatografi. Den løselige fraksjon av E. coli BL21 (DE3) som uttrykker HP-NAP lysert ved pH 9,0 ble justert til den angitte pH-verdi i området 7,0 til 9,0 og en proteinkonsentrasjon på 0,3 mg / ml. disse justeresfraksjoner, indikert som belastning, ble deretter påsatt på DEAE-harpikser for å rense rekombinant HP-NAP ved negativ modus satsvis kromatografi ved 4 ° C. De ubundne, vask og eluering fraksjoner ble analysert ved SDS-PAGE. Molekylmasser (M) i kDa er angitt på venstre side av de fargede geler. (Hentet fra referanse 24) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: Effekt av mengden av proteiner lastet på DEAE Harpiks for Purifying rekombinant HP-NAP Uttrykt i E. coli. løselig protein fraksjoner av E. coli BL21 (DE3) uttrykker HP-NAP ble lastet på DEAE harpiks i henhold til den angitte forholdet mellom proteiner mg per milliliter av harpikser for å rense recombinant HP-NAP ved den negative måte batch-kromatografi ved pH 8,0. De oppløselige proteiner, angitt som lasten (L), den ikke-bundne fraksjon (A), vaskefraksjonen (B), og eluering fraksjon (C) ble analysert ved SDS-PAGE. Molekylmasser (M) i kDa er angitt på venstre side av de fargede geler. (Fra referanse 24) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7: Effekt av pH på oppløseligheten av HP-NAP i E. coli Lysater. (A) E. coli BL21 (DE3) som uttrykker HP-NAP ble suspendert i iskald Tris-HCl-buffer ved den angitte pH-verdi i området 7,0 til 9,5. Celler ble lysert, og deretter helcellelysater (W) ble sentrifugert to separere løselige fraksjoner (S) og uoppløselige pellets (I). Proteinene ble analysert ved SDS-PAGE. Molekylmasser (M) i kDa er angitt på venstre side av de fargede geler. (B) Den prosentandelen av oppløseligheten av rekombinant HP-NAP i hele cellelysatet ved hver pH-verdi ble beregnet fra intensiteten av HP-NAP bånd på SDS-geler for den løselige fraksjon (S) dividert med den for hele cellelysatet (W ). Data ble representert som gjennomsnittet ± standardavvik for minst to eksperimenter. (Fra referanse 24) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1
Tabell 1: Primere brukt for mutagenese. Vennligst click her for å se en større versjon av denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den negative modus batch-kromatografi med DEAE anionbytteharpikser som presenteres her er egnet for rensing av rekombinant HP-NAP overuttrykkes i E. coli. PH-verdiene av bufferne som ble anvendt i trinnene med cellelysering og rensing er svært kritisk for å sikre løseligheten av HP-NAP i E. coli-lysater og effektiv separering av rekombinant HP-NAP fra vertscelleurenheter, henholdsvis. Bakterieceller skal lyseres ved pH 9,0, og den negative rensingen bør utføres ved pH 8,0 for å oppnå HP-NAP i høyt utbytte og høy renhet. Typisk utvinning av HP-NAP er 90%, og typisk renhet er 95% 24. Siden HP-NAP er til stede i den ubundne fraksjon, bør en minimal, men tilstrekkelig mengde av den harpiks anvendes for å oppnå sin maksimale kapasitet for å absorbere forurensninger. I vårt tilfelle er maksimal lastekapasitet 1,5 mg av de oppløselige proteiner fra E. coli lysatene per milliliter harpiks.

den provided protokollen er utformet for rensing av rekombinant HP-NAP fra en 50 ml E. coli kultur. Utbyttet av HP-NAP er rundt 15 mg. Renseprosessen kan enten nedskalert eller skalert opp tilsvarende. For eksempel ble to rekombinante HP-NAP Y101H og HP-NAP E97GY101H mutanter renset fra en 1 ml E. coli-kulturen ved hjelp av denne negative virkemåte satsvis kromatografi. Både HP-NAP mutanter med renhet høyere enn 95% ble oppnådd ved å samle den ikke-bundne fraksjon (figur 4). Denne negative modusen batch kromatografi har også blitt brukt til å rense rekombinant HP-NAP fra en 860 ml E. coli-kultur. Gjenvinningen av trinn ved anvendelse av DEAE negativ modus satsvis kromatografi har nådd 97% med en renhet høyere enn 90%.

HP-NAP uttrykt i Bacillus subtilis (B. subtilis) er også blitt renset ved hjelp av DEAE denne negative virkemåte satsvis kromatografii ett trinn 26. I vår B. subtilis ekspresjonssystem, er ekspresjonsnivået av HP-NAP lav. HP-NAP utgjør bare rundt 5% av de totale løselige proteiner fra bakterielysatene. Selv om HP-NAP rettet for rensning er til stede i en liten mengde, HP-NAP med renhet høyere enn 90% kan oppnås ved å redusere forholdet mellom mengden av proteiner fra cellelysater lastet på harpiksen for å effektivt fjerne nesten all den endogene proteiner fra B. subtilis 26. Således kan denne fremgangsmåte også anvendes for å rense rekombinant HP-NAP uttrykt i andre bakterielle verter.

Flere metoder har blitt rapportert for rensing av rekombinant HP-NAP i sin opprinnelige form 14-16. Imidlertid er en ytterligere gelfiltrering kromatografiske trinnet som er nødvendig for å oppnå HP-NAP i høy renhet. Denne negative kromatografiske rensing kan effektivt gi funksjonell rekombinant HP-NAP med høy renhet i ett trinn. i additipå, er avsalting trinnet ikke nødvendig på grunn av den lave saltkonsentrasjonen i den ubundne fraksjonen. Den satsmodus-rensing kan også eliminere behovet for en kolonne. Således, denne negative modus batch ved anvendelse av DEAE-harpiks gir en enkel og effektiv metode for å rense HP-HAP i sin native form med høyt utbytte og renhet. HP-NAP renset ved hjelp av denne fremgangsmåte kan videre anvendes for utvikling av vaksiner, nye legemidler, og diagnostikk for H. pylori-relaterte sykdommer eller for andre nye terapeutiske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
pET42a-NAP  N/A N/A prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317
E. coli BL21 (DE3) Thermo Fisher Scientific Inc C6000-03 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003
Kanamycin Amresco 25389-94-0 http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) MD Biomedical Inc 101-367-93-1 http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name
=IPTG%20
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich 10837091001 protease inhibitor
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&region=TW
N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) Sigma-Aldrich T7254 protease inhibitor
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&region=TW
N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) Sigma-Aldrich T4376 protease inhibitor
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&region=TW
Protein standard (bovine serum albumin) Sigma-Aldrich P5619  a standard protein for Bio-Rad Protein Assay
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&region=TW
DEAE–Sephadex  A-25 chloride form Sigma-Aldrich A25120 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&region=TW
Spectrum/Por dialysis tubing Spectrum Laboratories 132720 with molecular weight cutoff of 14 kDa
http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;
Acrodisc® units with Mustang® E membrane Pall MSTG25E3 for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min
http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992
mouse monoclonal antibody MAb 16F4 N/A N/A raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23;  A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare Life Sciences 28989335 for gel filtration chromatography
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335
PlusOne silver staining kit, protein GE Healthcare Life Sciences 17-1150-01 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare Life Sciences 17-1440-02 for density gradient centrifugation to purify human neutrophils
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure
_16963/17144002
Flat bottom 96-well white plate Thermo Fisher Scientific Inc 236108 http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html
Luminol Sigma-Aldrich A8511 protected from light
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&region=TW
Expand  long template PCR system Sigma-Aldrich 11681834001 source of High Fidelity PCR enzyme mix
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&region=TW
Dpn I New England Biolabs R0176S https://www.neb.com/products/r0176-dpni
Xho I New England Biolabs R0146S https://www.neb.com/products/r0146-xhoi
E. coli DH5α Thermo Fisher Scientific Inc 18265-017 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017
Name Company Product Number Comments
Equipment
 
U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer Hitachi  N/A out of market and upgraded to a new model
http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers
EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer Avestin Inc C315320 http://www.avestin.com/English/c3page.html
Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge Hitachi Koki Co 90106401 for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates
http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html
ÄKTA FPLC GE Healthcare Life Sciences 18-1900-26 for gel filtration chromatography
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026
Aviv model 62ADS CD spectrophotometer Aviv Biomedical N/A out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php
LAS-3000 imaging system Fujifilm N/A discontinued and replaced
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810
Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter Perkin-Elmer 1420-018 for chemiluminescence detection
http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. Brunette, G. W., et al. , Oxford University Press. (2015).
  2. Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157 (2011).
  3. Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
  4. Evans, D. J. Jr., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
  5. Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
  6. de Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe? Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
  7. Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
  8. Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
  9. Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
  10. Del Prete,, G,, et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
  11. Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
  12. Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
  13. Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
  14. Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection--novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
  15. Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
  16. Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
  17. Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
  18. Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
  19. Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
  20. Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
  21. Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
  22. Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
  23. Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
  24. Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
  25. Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
  26. Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).
  27. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
  28. Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).

Tags

Immunologi HP-NAP, DEAE Negativ kromatografi ubundne fraksjonen Batch kromatografi,
Ett-trinns Negativ kromatografiske rensing i<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofilaktiverende Protein overuttrykkes i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; I batch-modus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuo, T. Y., Hong, Z. W., Tsai, C.… More

Kuo, T. Y., Hong, Z. W., Tsai, C. C., Yang, Y. C., Fu, H. W. One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode. J. Vis. Exp. (112), e54043, doi:10.3791/54043 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter