Methodenartikel

Kutane Surgical Denervation: eine Methode zur Prüfung der Voraussetzung für die Nerven in Maus-Modellen der Haut-Krankheit

DOI:

10.3791/54050

⸱

26. Juni 2016

 ,  , 
1Dermatology, Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 2Dermatology Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieser Artikel enthält detaillierte Protokolle für die genetische Markierung von Maushaut, chirurgische Denervierung, Hautbiopsie und Visualisierung markierter Epithelien durch Ganzbett-β-Galactosidase-Färbung. Mit diesen Methoden kann der Bedarf an Nerven in Mausmodellen normaler und pathologischer Haut getestet werden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

kutane somatosensorische Nerven haben die Funktion, verschiedene Reize zu erkennen, die auf die Haut einwirken. Zusätzlich zu ihrer etablierten sensorischen Rolle deuten neuere Studien darauf hin, dass Nerven auch Hauterkrankungen wie atopische Dermatitis, Psoriasis und Krebs modulieren können. Hier beschreiben wir Protokolle zum Testen der Anforderung an Nerven bei der Aufrechterhaltung eines kutanen mechanosensorischen Organs, der Tastkuppel (TD). Insbesondere diskutieren wir Methoden zur genetischen Markierung, Ernte und Visualisierung von TDs durch Whole-Mount-Färbung und zur Durchführung einer einseitigen chirurgischen Denervierung an der dorsalen Rückenhaut von Mäusen. Zusammen können diese Ansätze verwendet werden, um die TD-Morphologie und die Genexpression in denervierter sowie scheinoperierter Haut desselben Tieres direkt zu vergleichen. Diese Methoden können auch leicht angepasst werden, um den Bedarf an Nerven in Mausmodellen der Hautpathologie zu untersuchen. Schließlich bietet die Möglichkeit, wiederholt Hautproben zu nehmen, die Möglichkeit, das Fortschreiten der Krankheit in verschiedenen Stadien und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Einleitung zu überwachen.

Einleitung

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In den letzten Jahren hat sich die Wertschätzung für den Einfluss von Nerven auf Krankheiten, die typischerweise nicht als klassische Neuropathien1-4 angesehen werden, erweitert. In der Haut deuten neuere experimentelle Beweise darauf hin, dass sensorische Nerven verschiedene Pathologien modulieren können, die von Psoriasis bis Krebs reichen5-9. Dies wurde mit Techniken wie der chirurgischen Denervierung und der pharmakologischen Hemmung der neuronalen Funktion bei Nagetieren nachgewiesen. Im Fall von Psoriasis haben diese Studien einen mechanistischen Rahmen für das Verständnis geliefert, warum sich menschliche Psoriasis-Plaques nach Verlust der neuronalen Funktion zurückbilden7,10-12.

Hautnerven können auch die Genexpression beeinflussen13,14 und sind entscheidend für die Mechanosensorik in normaler Haut15. Insbesondere bestehen Touch Dome (TD)-Epithelien aus einem Fleck von säulenförmigen Epidermiszellen in Gegenüberstellung mit neuroendokrinen Merkelzellen, die durch langsam angepasste Nervenfasern vom Typ 1 (SA1)16-18 innerviert werden. TDs vermitteln die Empfindung von leichten Berührungen und zeigen nachweislich die Aktivität des Hedgehog-Signalwegs5,19. Die Aufrechterhaltung der TD hängt von der Innervationab 20,21, da Nerven Hedgehog-Liganden sezernieren, um normale TDs und die mit ihnen assoziierten Merkelzellen aufrechtzuerhalten19. Darüber hinaus fördert die Innervation die Hedgehog-abhängige Tumorbildung aus TD-Epithelien5. Zusammengenommen bekräftigen diese Studien die Vorstellung, dass komplizierte molekulare Wechselwirkungen, die zwischen Nerven und den umgebenden Zellen in ihrer Nische stattfinden, sowohl für die normale TD-Physiologie als auch für die Krankheit entscheidend sind.

Um die Natur dieser Wechselwirkungen zu untersuchen, beschreiben wir hier eine Reihe von in vivo Techniken zur Manipulation der Genexpression in der TD, sowie zur Entnahme von Hautbiopsien für die TD-Visualisierung nach der Abstammungsverfolgung. Schließlich beschreiben wir Verfahren zur Durchführung einer unilateralen chirurgischen Denervierung, bei der Nerven von einer Seite der Rückenhaut der Maus entfernt werden, während die kontralaterale Seite als vorgetäuschte interne Kontrolle intakt bleibt. Einige Wochen nach der Operation werden denervierte und scheinkontrollierte Haut verglichen, um Veränderungen zu beurteilen, die auftreten, wenn Nerven abgetragen werden. Obwohl diese Techniken im Zusammenhang mit normalen TDs beschrieben werden, wurde das Denervierungsverfahren verwendet, um den Bedarf an Nerven in Mausmodellen der Psoriasis6, der Wundheilung13 und der Tumorgenese5 zu untersuchen. Da die Haut für wiederholte Biopsien empfänglich ist, bietet dies die Möglichkeit, das langfristige Schicksal der markierten Zellen zu überwachen oder das Fortschreiten der Krankheit über mehrere Zeitpunkte hinweg zu beurteilen.

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Protokoll

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Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften von der University of Michigan Einheit für Labortiermedizin etabliert durchgeführt.

1. Induce genetische Rekombination bei Mäusen

Hinweis: Die Gli1 tm3 (cre / ERT2) Alj / J - Maus - Stamm (Gli1-CreERT2) 13 ermöglicht Targeting von Tamoxifen-induzierte genetische Rekombination Epithelien TD. Überqueren Sie diesen Stamm mit B6.129S4-Gt (ROSA) 26Sor tm1Sor / J Reporter - Mäuse (LacZ) 22 Gli1 zu erzeugen; LacZ Tiere TD Zellen sichtbar zu machen , indem ganze Montage unten Färbung.

  1. Bereiten tamoxifen Lösung auf eine Konzentration von 12,5 mg / ml in Maisöl.
    1. In einem 1,5-ml-Röhrchen, in den 20 mg kristallines Tamoxifen, und dann 1 ml Maisöl. Fest mit Klebeband um das Rohr zu einem Wirbelmischer und Wirbel kontinuierlich bei der höchsten Einstellung bei RT, bis die Tamoxifen vollständig (2-4 h) gelöst hat, alsbestätigt durch das Rohr unter einem Binokular auf die Abwesenheit von Tamoxifen-Partikel zu untersuchen.
    2. Die Lösung wird in einem 15 ml-Röhrchen und verdünne die Tamoxifen auf eine Endkonzentration von 12,5 mg / ml mit zusätzlichem Maisöl. Mischen durch Vortexen die viskose Lösung für weitere 30 sec. Bewahren Sie diese Lösung für bis zu 1 Woche bei 4 ° C im Dunkeln.
  2. Injizieren der Tamoxifen - Lösung intraperitoneal in Gli1; ​​LacZ Mäusen in einem Volumen von 200 & mgr; l pro 20 g Mauskörpergewicht, für eine wirksame tamoxifen Dosis von 2,5 mg pro 20 g Mausgewicht.

2. Ernte Hautproben

Hinweis: Je nach Experiment Ernte Hautbiopsien mehrere Tage bis Wochen nach einer Tamoxifen-Induktion. Für alle Operationen, folgen Standardprotokolle zur Bekämpfung von Nagetieren Chirurgie, einschließlich sterile Handschuhe verwenden, eine chirurgische Maske oder Haarnetz tragen, und bedeckt das Tier mit einem sterilen Operationstuch während des Verfahrens.

  1. Bereiten Sie 10fach Betäubungslösung durch Mischen von 90 mg / ml Ketamin und 6,5 mg / ml Xylazin in Wasser. Verdünnen dieser Stammlösung 01.10 in sterile PBS unmittelbar vor der Verwendung und Speicherung bei RT im Dunkeln für bis zu 8 Monaten.
    1. Alternativ anästhesieren Mäusen durch Isofluran-Inhalations, mit einer Gaskonzentration von 4% mit Sauerstoff beginnen vollständig das Tier zu betäuben, und dann anschließend das für die Dauer des Verfahrens auf 1-2% zu senken.
  2. Injizieren Sie die Anästhesielösung intraperitoneal bei einer Dosis von 200 & mgr; l pro 20 g Körpergewicht der Maus. Überprüfen Sie, ob das Tier die richtige Ebene der Sedierung durch Zehe Prise Test erreicht hat, und bestätigen, dass die Herz- und Atemfrequenz sind normal (etwa 600 Schläge und 160 Atemzüge pro Minute, jeweils).
  3. Verwenden Sie einen elektrischen Klipper das Haar von der Stelle der Biopsie an der dorsalen Rückenhaut, wobei darauf geachtet, nicht zu nick oder beschädigen die darunter liegende Haut zu entfernen.
  4. Bereiten Sie die Operationsstelle durch die Rasur Abwischend Bereich in einer anterioren-to-posterior mit Betadine und Alkoholtupfer. Sicherstellen, dass alle Haarabschnitte von der Website entfernt werden.
  5. Skizzieren Sie die Biopsiestelle eine schwarze Markierung, legen Sie das Tier auf eine wärmende Unterlage in einem aseptischen OP-Bereich mit und decken mit einem sterilen Operationstuch (zu Demonstrationszwecken wurde sterile Abdeckung weggelassen Sichtbarkeit zu erhöhen).
    Hinweis: Um die Längsschnitte der Haarfollikel zu erhalten, die längere Kante der Biopsie (die Kante werden für die Histologie geschnitten, ~ 1 cm) in einer anterior-posterioren Richtung laufen soll (parallel zur Richtung der Haarfollikel), parasagital zu der dorsalen Mittellinie (1A).
  6. Verwenden Sie eine sterile # 11 Skalpell eine vollständige Dicke Exzision entlang des markierten Bereichs zu machen, ohne die zugrunde liegende Muskelfaszie zu beschädigen.
    Hinweis: Die ausgeschnittene Hautgewebe enthält die Epidermis, Dermis, subkutanes Fett und panniculus carnosus. Bluten ist in der Regel minimal.
  7. Flatten ter Hautprobe auf einem trockenen Papiertuch ausgeschnitten, Seite Dermis nach unten, schneiden Sie das überschüssige Papiertuch, und speichern Sie die Probe in kaltem PBS für bis zu 1 Stunde weg, wenn andere Proben gesammelt werden müssen. Wenn Sie fertig sind, gehen Sie zu den Schritten 3.1 oder 3.2 Proben für die Histologie zu verarbeiten, oder Schritt 4 für ganze Montage β-Galactosidase (LacZ) Färbung.
  8. Suture schließen Sie die Biopsiestelle mit 6-0 Nylonnaht, in einem einfachen unterbrochenen Muster etwa 3 mm voneinander entfernt.
  9. Rückkehr nicht Mäuse, die Chirurgie in den gleichen Käfig wie andere Tiere durchlaufen, bis nach vollständiger Genesung haben.
  10. Überwachen Tiere unmittelbar nach der Operation, bis sie wieder zu Bewusstsein, und auch täglich, bis die OP-Bereich verheilt ist, in der Regel innerhalb von 1 Woche. Verwenden Sie Analgetika entsprechend bezeichneten institutionellen Tierpflege und Richtlinien zur Verwendung, wenn Mäuse Anzeichen von Schmerzen oder Leiden aufweisen. Entfernen Nähte innerhalb von 7-10 Tagen nach der Operation.
    Hinweis: Bei Bedarf vorbereiten Analgetikum Lösung von Carprofen Verdünnung (50 mg / ml Stamm solutIon) 1: 100 in sterilem Wasser. Injizieren Sie die Lösung subkutan zwischen die Schulterblätter in der Nähe der Genick, in einer Dosis von 200 & mgr; l pro 20 g Körpergewicht (5 mg / kg Maus Körpergewicht).

3. Verfahren Die Proben für die Histologie

Hinweis: Um das zu beheben und verarbeiten, um die ausgeschnittenen Gewebe, entweder Methode unten, je nach Anwendung.

  1. Um in Paraffin eingebettete histologische Proben, fixieren Sie die Haut in 3,7% Formalin in PBS O / N bei RT und Speicher in 70% Ethanol für bis zu 2 Wochen generieren. Entfernen Sie das Papiertuch, bevor sie in Paraffin eingebettet wird.
  2. Für gefrorene histologischen Proben zu erzeugen, um das Gewebe in kaltem 4% Paraformaldehyd in PBS versenken und sanft für 1 Stunde schütteln. Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie die Probe mit 3 Änderungen von PBS, etwa jeweils 5 Minuten. Als nächstes wird die Probe in 30% Saccharose in PBS überschwemmen das Gewebe ( "Sucrose Versenken") zu cryoprotect.
  3. Inkubieren unter leichtem O / N bei 4 ° C schütteln. Am nächsten Tag, entfernen Sie das Papier Schlepptauel und überschüssiges Fettgewebe von der Hautseite der Haut wegschneiden. Einbetten des Gewebes direkt in Oktober und lagern Sie den gefrorenen Block bei -80 ° C.
    Hinweis: Nach dem Schneiden, entweder Paraffin oder gefrorenen Proben können durch Immunhistochemie gefärbt werden TDs zu identifizieren, Merkel - Zellen und Nerven Antikörper gegen Keratin 17, Keratin 8 und Neurofilament mit jeweils wie vorstehend beschrieben 5,19.

4. Visualize Proben von Whole-mount LacZ-Färbung

  1. Bereiten Sie X-gal-Färbung Lösung.
    1. Kombinieren 0,94 g monobasisches Natriumphosphat und 2,6 g dibasisches Natriumphosphat in 250 ml sterilem Wasser. Der pH-Wert auf 7,3. Dazu werden 0,5 ml 1 M Magnesiumchlorid, 0,528 g Kalium-Ferrocyanid und 0,412 g Kaliumferricyanid. In 250 ul octylphenyl-Polyethylenglykol und 125 mg Deoxycholat. Die Basislösung kann für bis zu 6 Monate im Dunkeln bei 4 ° C gelagert werden.
    2. Bereiten 50x Lager X-gal solution von Dimethylformamid zur X-gal Vorratsflasche Zugabe einer 50 mg / ml Lösung zu erzeugen. Bewahren Sie diese Lösung bei -20 ° C im Dunkeln.
    3. Unmittelbar vor der Verwendung, Lager X-gal-Lösung 01.50 in X-gal Basenlösung verdünnen Färbelösung zu erzeugen. Für kleinere Biopsien (<1 cm 2), aliquoten 1-2 ml Färbelösung pro Probe.
  2. Befestigen Sie die Hautprobe in Schritt gesammelt 2,7 in einer Lösung, die 2% Paraformaldehyd / 0,2% Glutaraldehyd in kaltem PBS für 30 min auf Eis sanft schütteln. Für kleinere Biopsien (<1 cm 2), 1-2 ml Fixierungslösung pro Probe verwenden.
    Hinweis: Alternativ fixieren Proben in 2-4% Paraformaldehyd nur, oder nur in 0,5% Glutaraldehyd. Optimale Fixierung Bedingungen hängen von dem Gewebe, dem Grad der LacZ-Expression und Anwendung.
  3. Entfernen Sie die Fixierungslösung und Spülen Proben mit 3 Änderungen der PBS, 5 min jeweils auf einem Schüttler bei RT.
  4. Entfernen Sie das Papiertuch unterhalb der Probe und wegschneiden excess Fettgewebe von der dermalen Seite der Haut durch das Fett mit stumpfen Pinzette greifen und Trimmen mit Dissektionsscheren.
  5. Tauchen Sie die Probe in X-gal-Färbung Lösung und Inkubation bei 37 ° CO / N. LacZ - Expression wird als blauer Fleck unter einem Binokular (Abbildung 1B) sichtbar sein.
    Hinweis: Wenn die Signalstärke schwach ist, ersetzen Sie die Färbelösung am nächsten Tag und wiederholen Sie die O / N Inkubation. Wenn die Hintergrundfärbung zu intensiv ist, reduzieren die Zeit der Färbung oder der Probe bei RT inkubieren anstelle von 37 ° C.
  6. Entfernen Sie die Färbelösung und waschen Sie die Proben in drei Änderungen von PBS für ca. 5 min 3% DMSO enthält, vorsichtig bei RT schütteln.
  7. Wasch Proben in 2-3 Änderungen von 70% Ethanol für jeweils 5 Minuten. Store Proben in 70% Ethanol.

5. Chirurgische Denervation

  1. Anesthetize das Tier, wie in Schritt 2.2 und rasieren die gesamte Rückenhaut.
  2. Bereiten Sie den OP-Bereich of der Rückseite Haut mit Betadine und Alkoholtupfer, und das Tier mit einem sterilen Operationstuch abdecken (zu Demonstrationszwecken wurde sterile Abdeckung zu erhöhen Sichtbarkeit weggelassen). Halten Sie das Tier warm und ein Heizkissen mit, während in einem aseptischen OP-Bereich arbeitet.
  3. Einen Einschnitt ein steriles Skalpell # 11 entlang der dorsalen Mittellinie von der Basis des Halses etwa 0,5 cm oberhalb des Schwanzes verwenden.
  4. Mit stumpfen Pinzette, reflektieren die Haut sanft auf der linken Seite von der Flanke entfernt das darunter liegende Gewebe aus den Skapulier Fettpolstern in der Nähe des Halses zu visualisieren über dem Hinterbein nur.
    Hinweis: dorsale Hautnerven als weiße Stränge erscheinen , die kaudal durch die transluzente Faszie des Rumpfwand reisen , bevor scharfe Kurven machen und das lockere Bindegewebe unter der Haut eintritt (Abbildung 2).
  5. Mit ultra-feinen Pinzette unter einem Lichtmikroskop seziert, entfernen Sie die Nerven ausschließlich von der linken Seite der Animal liegt an anatomischen Stellen T3-12 durch Zupfen von wo die Segmente Biegung an der Rumpfwand an ihren Eintrittsstellen in die Haut (Abbildung 2).
    1. Orient Zange vertikal und die Nerven zu entfernen um etwa 0,5 cm unterhalb ihrer bend Seiten Greifen und Ziehen nach oben, wodurch die Nerven zu dehnen und zu trennen von dem umgebenden Gewebe (2C - E). Achten Sie darauf, zu vermeiden benachbarte Blutgefäße zerreißen.
    2. Weiter, bis alle Nerven von der Rumpfwand an der Haut verlauf entfernt werden. Sie nicht die Nerven innerhalb der dichten Faszie des Rumpfwand stören. Halten Sie das Gewebe feucht während des gesamten Verfahrens durch periodisches Tropfen steriler 0,9% Salzlösung anwenden.
    3. Alternativ entfernen Nerven durch ihre proximalen Enden in der Nähe der Rumpfwand mit einer Pinzette greifen und schnippeln mit einer feinen Schere. Danach trennen die distalen Enden in der Nähe der Haut (2F - H). Schließlich entfernen Sie die intervening Nervensegmente (Abbildung 2i).
  6. Entfernen Sie alle Nerven von der Hautlappen ausgesetzt in Schritt 5.4. Diese Fasern umfassen , um die distalen Zweige der dorsalen Hautnerven und erscheinen als weiße verzweigenden Stränge angeordnet sporadisch im Bindegewebe auf der dermalen Seite der Haut Klappe (Figuren 2J - K).
    1. Um diese feinen Zweige zu entfernen, positionieren Sie die feinen Pinzette auf die Hautoberfläche in etwa parallel, greifen die Nerven und zupfen nach oben zu vermeiden, Blutgefäße zu stören und Stechen der Haut. Fortfahren, bis alle sichtbaren Nerven entfernt wurden.
  7. Mit stumpfen Dissektion, spiegeln die Haut auf der rechten Seite der Rückenmittellinie Schnitt, aber nicht entfernen Sie die Nerven. Dies wird als der Gegenscheinoperierten Kontrolle dienen.
  8. Suture entlang der dorsalen Mittellinie in einer einfachen unterbrochenen Muster den Schnitt zu schließen. Überwachen Sie das Tier während der Wiederherstellung und Post-opertiv wie zuvor gezeigt (Schritte 2,8-10). Entfernen Nähte innerhalb von 7-10 Tagen nach der Operation.
  9. Um funktionell beurteilen stabil Denervierung bis zu mehreren Wochen nach der Operation, entfernen Sie die Haare aus der Rückenhaut eine elektrische Klipper verwenden.
  10. stechen Sie vorsichtig die denervierten Hautbereich eine Injektionsnadel, und beachten Sie, ob das Tier, in der Regel durch Schaudern oder den Kopf drehen reagiert. Wenn der Hautbereich stabil denervierten wurde, wird das Tier zeigen wenig oder keine Antwort.
  11. Mit einem schwarzen Marker, umreißen die Fläche keine Antwort, sowie eine Fläche von ähnlicher Größe und Lage auf der Gegenseite Schein.
  12. Sammeln Sie Biopsien von diesen Seiten, wie in den Schritten 2.1-2.9 für die Analyse.
    Hinweis: Alternativ kann die gesamte dorsale Rückenhaut, einschließlich denervierten und scheinoperierten Regionen können für ganze-mount-Färbung ähnlich wie ein einzelnes Blatt entfernt werden, wie in Schritt 4 beschrieben.

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Ergebnisse

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Durch die Erzeugung von Mäusen Tamoxifen-induzierbare Gli1-CreERT2 und einem LacZ - Reporter - Allel exprimieren , ist es möglich , TD Epithelien und verfolgen das Schicksal dieser Zellen im Laufe der Zeit sichtbar zu machen. Das gesamte Denervierung Verfahren kann in der Regel innerhalb von 1 Stunde pro Maus abgeschlossen sein und minimal Qualen des Tieres verursachen sollte.

Unsere frühere Studien haben gez...

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Diskussion

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Nerves dienen wichtige Funktionen nicht nur in der Empfindung, sondern auch in Säugetierorgan Entwicklung, Pflege und Regeneration 13,24-27. Wie Nerven kürzlich verwickelt in verschiedenen Hautkrankheiten haben, werden die hier beschriebenen Techniken kann die Anforderung für Innervation in einer Vielzahl von Tierkrankheitsmodellen zur Untersuchung verwendet werden. Tatsächlich erlaubt die einseitige Denervierung Technik für den direkten Vergleich der Haut mit entweder intakten oder gestört Nerven aus der gle...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Die Autoren danken Autumn Peterson für die Hilfe bei der Mausfotografie, Daniel Thoresen für die Hilfe bei Mäusen und Dr. Nicole Ward und Abdelmadjid Belkadi für die Hilfe bei der chirurgischen Denervierung. Diese Studien wurden durch Mittel des National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (Zuschüsse R00AR059796 und R01AR065409) unterstützt. die Abteilung für Dermatologie der Universität von Michigan; das Biological Sciences Scholars Program; das Zentrum für Organogenese; das Comprehensive Cancer Center der Universität von Michigan; und der John S. and Suzanne C. Munn Cancer Fund. S.C.P. wurde mit Mitteln des National Institute of General Medical Sciences gefördert (Grant T32 GM007315). Diese Arbeit wurde auch vom NIH Intramural Research Program, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AlkoholvorbereitungspadsPDIB339
AnaSed (Xylazin)LloydNADA 139-236
Antikörper, Anti-Keratin 8Entwicklungsstudien Hybridoma BankTROMA-IRatten-Antikörper, Verwendung in einer Konzentration von 1:500
Antikörper, Anti-Keratin 17Cell Signaling#4543Kaninchen-Antikörper, Verwendung in einer Konzentration von 1:1.000
Antikörper, Anti-NeurofilamentCell SignalingC28E10Kaninchen-Antikörper, Verwendung in einer Konzentration von 1:500
Betadine VorbereitungspadsMedlineMDS093917
Carprofen (Rimadyl)Zoetis
Cordless wiederaufladbare HaarschneidemaschineWahlTrimmer Modell 8900
MaisölSigma-AldrichC8267
KryostatLeicaCM1860
DAPIThermoFisher ScientificD1306Verwendung in einer Konzentration von 1:1.000
DesoxycholatSigma-AldrichD6750
EnthaarungscremeNairN/A
DimethylforamidSigma-Aldrich319937
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-AldrichD8418
GlutaraldehydSigma-AldrichG5882
ImmEdge PenVector LaboratoriesH-4000
Ketamin HClHospiraNDC 0409-2051-05
MagnesiumchloridSigmaM8266
Mikro-DeckglasVWR48404-454
Mikro-ObjektträgerVWR48311-703
10% neutrales gepuffertes FormalinVWRBDH0502-4LP
6-0 Nylon NahtmaterialDemeTECHNL166012F4P
Octylphenyl-PolyethylenglykolSigma-AldrichI8896
O.C.T. VerbindungSakura Tissue-Tek4583
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
KaliumferrocyanidSigma-AldrichP9387
KaliumferricyanidSigma-Aldrich702587
Natriumphosphat monobasischSigma-AldrichP9791
Natriumphosphat zweibasischSigma-AldrichS5136
SaccharoseSigma-Aldrich84097
TamoxifenSigma-AldrichT5648-1G
Ultrafeine PinzetteDumont0103-5-PO
VectashieldVector LaboratoriesH1000
X-galRoche10 651 745 001Vor der Verwendung in Dimethylforamid auflösen, um einen 50-fachen Stamm zu erzeugen

Referenzen

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Cutaneous Surgical DenervationMouse Skin DiseaseTouch Dome MorphologyDorsal Cutaneous NerveWhole Mount StainingGenetic LabelingSham Operated ControlHistological Section AnalysisHedgehog SignalingMerkel Cells

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