Beurteilung der myofilament Ca Published: August 1, 2016 doi: 10.3791/54057

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Zai Hao Zhao¹, Chun Li Jin¹, Ji Hyun Jang¹, Yu Na Wu¹, Sung Joon Kim¹, Hong Hua Jin², Lan Cui², Yin Hua Zhang^1,2,3

¹Department of Physiology & Biomedical Sciences, Ischemic/hypoxic Disease Institute, Seoul National University College of Medicine, ²Yan Bian University Hospital, ³Institute of Cardiovascular Sciences, University of Manchester

Abstract

Herzinsuffizienz und Herzrhythmusstörungen sind die häufigsten Ursachen für Mortalität und Morbidität weltweit. Jedoch bleibt der Mechanismus der Pathogenese und myokardialen Funktionsstörung in dem erkrankten Herzen vollständig geklärt werden. Recent zwingenden Beweis zeigt , daß Änderungen in der myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit beeinflussen intrazellulärem Ca ²⁺ Homöostase und Ionenkanalaktivitäten in Kardiomyozyten, die wesentlichen Mechanismen , die für die kardialen Aktionspotentials und Kontraktion in gesunden und kranken Herzen. Tatsächlich Aktivitäten von Ionenkanälen und Transportern Herzaktionspotentiale zugrunde liegen (zB Na ^+, Ca ²⁺ und K ⁺ -Kanäle und der Na ⁺ -Ca ²⁺ Exchanger) und die intrazelluläre Ca ²⁺ Umgang mit Proteinen (z. B. Ryanodinrezeptoren und Ca ²⁺ -ATPase in Retikulum (SERCA2a) oder Phospholamban und seine Phosphorylierung) werden üblicherweise auf Evalu gemessenaßen die grundlegenden Mechanismen von Herz Erregung und Kontraktion (EG) Kupplung. Beide elektrischen Aktivitäten in der Membran und die intrazelluläre Ca ²⁺ Veränderungen sind die Triggersignale von EC - Kopplung, wohingegen myofilament die Funktionseinheit der Kontraktion und Entspannung, und myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit ist zwingend notwendig , bei der Umsetzung von Myofibrillen Leistung. Dennoch wenige Studien inkorporieren myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit in die funktionelle Analyse des Myokards , wenn es im Mittelpunkt der Studie. Hier beschreiben wir ein Protokoll , das Sarkomerverkürzung / re-Verlängerung und der intrazellulären Ca ²⁺ Ebene mit Fura-2 AM (ratiometrisch Erkennung) und bewerten die Veränderungen von myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit in Herzmuskelzellen aus Rattenherzen misst. Das Hauptziel ist , dass myofilament betonen Ca ²⁺ Empfindlichkeit sollte für mechanistische Analyse in Betracht EG Kupplung genommen werden. Umfassende Untersuchung von iauf den Kanälen, Ionentransporter, intrazellulärer Ca ²⁺ Handhabung und myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit , die myocyte Kontraktilität in gesunden und kranken Herzen zu Grunde liegen wird für die Gestaltung wirksamer Strategien der translationalen und therapeutischen Wert wertvolle Informationen liefern.

Introduction

Kardiale Erregungs Kontraktion (EC) Kopplung ist das Grundschema für die mechanischen Eigenschaften des Myokards Analyse, dh die kontraktile Funktion des Herzens ^1,2. EC Kopplung durch Membrandepolarisation sekundär zu den Aktivitäten von sarkolemmalen Ionenkanäle (beispielsweise die spannungsabhängigen Na ⁺ Kanal, der durch Patch-Clamp - Techniken gemessen werden kann) eingeleitet wird. Nachfolgende Aktivierung von spannungsabhängigen L-Typ - Ca ²⁺ -Kanälen (LTCC) und Ca ²⁺ -Einstrom durch LTCCs den Großteil der Ca ²⁺ -Freisetzung durch Ryanodin - Rezeptoren (RyRs) auslösen, die cytosolische Ca ²⁺ -Konzentration von nanomolaren Erhöhung (nM ) (uM) Ebene mikromolar. Eine solche Erhöhung der cytosolischen Ca ²⁺ Ca ²⁺ fördert die Bindung an Troponin C (TnC) in dünnen Fäden und entlockt Konformationsänderungen des Filaments Komplex die Actin-Myosin - Wechselwirkung zu erleichtern , und erreicht myocardial Kontraktion ^3. Umgekehrt wird die cytosolische Ca ²⁺ erneut uptaken zurück in das sarkoplasmatische Retikulum (SR) durch die Ca ²⁺ -ATPase in SR (SERCA2a) oder aus dem Myozyten über das Na ⁺ / Ca ²⁺ -Austauscher und dem Plasmalemma extrudiert Ca ²⁺ ATPase ^1,2. Folglich stiftet der Rückgang der cytosolischen Ca ²⁺ Konformationsänderungen von dünnen Fäden wieder in den ursprünglichen Zustand, was zur Dissoziation von Aktin-Myosin und myocyte Entspannung ^1-3. In diesem Schema wird die Aktivität von SERCA2a allgemein als die Geschwindigkeit der myokardialen Entspannung zu bestimmen , weil es für die 70 - Konten - 90% der cytosolischen Ca ²⁺ Entfernung in den meisten Säugetierherzzellen ^1. Als solche anormalen Handhabung Ca ²⁺ von LTCC, RyR und SERCA2a usw. hat die primären Mechanismen für beeinträchtigte Kontraktilität und Entspannung in das kranke Herz ^1-4 betrachtet.

2+ , die Funktionen als der Bote in der EG - Kopplung entfallen rund 1% der gesamten intrazellulären Ca ²⁺ und die Mehrheit der Ca ²⁺ gebunden ist , an intrazelluläre Ca2 ⁺ Puffer ^5,6. Dies ist aufgrund der Tatsache , dass verschiedene Ca ²⁺ Puffer in Herzmyocyten reichlich vorhanden sind, beispielsweise Membran - Phospholipiden, ATP, Phosphokreatin, Calmodulin, Parvalbumin, Myofibrille TnC, Myosin, SERCA2a und Calsequestrin in der SR. ^5,6,7. Unter ihnen sind SERCA2a und TnC die vorherrschenden Ca2 ⁺ Puffer ^5,6,7. Weiterhin ²⁺ Ca seiner Bindungspuffern während twitch ein dynamischer Prozess ist (beispielsweise 30-50% der Ca ²⁺ bindet an TnC und distanzieren von ihm während Ca ²⁺ Transienten ⁷⁾ und die Änderung in Ca ²⁺ Bindungs ​​Ursache zusätzlicher "Freigabe" von freiem Ca ²⁺ in das Cytosol führt zu den Veränderungen der intrazellulären Ca ²⁺ concentration. Folglich Störung der intrazellulären Ca ²⁺ Ebene induziert abnorme myofilament Bewegungen, die die Vorläufer der Kontraktions Dysfunktion und Arrhythmien ^8,9. Viele Faktoren (sowohl physiologische und pathologische) können die Quellen der post-transkriptionalen Modifikationen myofilament Proteine ​​sein, die myofilament Ca ²⁺ Pufferung und myofilament ^{2+ 8-10} Empfindlichkeit Ca beeinflussen. Vor kurzem wurde berichtet , dass Mutationen in myofilament Proteine ​​, die die Ca ²⁺ erhöhen Bindungsaffinität und die intrazelluläre Ca2 ⁺ Handhabung, die Auslösung Pause abhängige Potenzierung von Ca ²⁺ Transienten, abnormal Ca ²⁺ Freisetzung und Arrhythmien ^8. Im Einklang mit diesem Konzept haben wir auch , dass myofilament Ca ²⁺ Desensibilisierung bei hypertensiven Rattenherzen sekundär auf die Hochregulation der neuronalen Stickstoffmonoxid-Synthase mit erhöhten systolischen und diastolischen Ca ²⁺ Ebenen zugeordnet gezeigt^11, die wiederum ¹² die Anfälligkeit der LTCC auf Ca ²⁺ -abhängigen Inaktivierung erhöht. Daher ist myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit ein "aktives" Regulator der intrazellulären Ca ²⁺ Homöostase und Myozyten kontraktilen Funktion. Es ist notwendig geworden , Wechselwirkungen zwischen myofilament und Ca ²⁺ zu analysieren Proteine ​​für die gründliche Untersuchung von myocyte EG - Kopplung und die Herzfunktion Handhabung.

Hier beschreiben wir ein Protokoll , das die Veränderungen der myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit in isolierten Kardiomyozyten bewertet. Umfassende Analyse der intrazellulären Ca ²⁺ Profil, myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit und Kontraktion werden neuartige Mechanismen der myokardialen Mechanik raben.

Protocol

Das Protokoll ist in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch die UN-National Institutes of Health veröffentlicht (NIH Publication No. 85-23, überarbeitet 1996). Es wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der Seoul National University (IACUC Zulassung Nr .: SNU-101213-1) zugelassen.

1. Puffer Vorbereitung (Tabelle Materialien und Geräte)

1. Bereiten 300 ml frisches Isolationslösung am Tag des Experiments (in mM: NaCl, 135; KCl, 5,4; MgCl ₂ 3,5; Glucose, 5; HEPES, 5; Na ₂ HPO _4, 0,4; Taurin, 20; pH 7,4 mit NaOH).
2. Herstellung von 100 ml frischem Aufbewahrungslösung am Tag des Experiments (in mM: NaCl 120; KCl 5,4; MgSO ₄ 5; CaCl ₂ 0,2; Natrium-Pyruvat 5; 5,5 Glucose; Taurin 20; HEPES 10; Mannit 29; pH 7,4 mit NaOH).
3. Bereiten 1L Perfusionslösung (in mM: NaCl, 141,4; KCl, 4; NaH ₂ PO _4, 0,33; MgCl _2, 1; HEPES, 10; Glucose, 5,5; CaCl _2, 1,8; Mannit, 14.5; pH 7,4 mit NaOH).
4. Herstellung von 30 ml Kollagenase - Lösung 1 durch Kollagenase - Zugabe (1 mg / ml), Protease (0,1 mg / ml), Rinderserumalbumin (BSA, 1.67mg / ml) und Ca ²⁺ (0,05 mM) 25 ml Isolations Lösung.
5. Es werden 20 ml Kollagenase - Lösung 2 durch Kollagenase Zugabe (1 mg / ml), BSA (1,67 mg / ml) und Ca ²⁺ (0,05 mM) zu 16,7 ml Isolierungslösung.
6. Vorbereitung 40 ml BSA-Lösung durch Zugabe von 0,4 g BSA zu 40 ml Isolationslösung. Separate 10 ml und 30 ml in zwei Bechern. Hinzufügen Ca ²⁺ zu 30 ml BSA - Lösung so , dass die endgültige Ca ²⁺ -Konzentration in der BSA - Lösung beträgt 1 mM.

2. Vorbereitung für die Isolierung der linksventrikulären (LV) Myozyten

1. Übertragen 8-12 Wochen alte, männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten in sauberen Transportkäfigen aus dem Tier Anlage zur Herstellung und Isolierung Raum.
2. Hessen zwei Wasserbäder bis 37 ^o C.
   Hinweis: Verwenden Sie ein Wasserbad für das Wasser - ummantelten Reservoir und den Perfusionsschläuche des Langendorff-Perfusionssystem. Verwenden Sie die anderen Wasserbad Myokardgewebe Stämme, um zu agitieren einzelnen Myozyten zu trennen.
3. 5 ml und 3,3 ml BSA - Lösung (ohne Ca ²⁺⁾ zu 25 ml Kollagenase - Lösung 1 und 16,7 ml Kollagenase - Lösung 2 , um das Volumen auf 30 ml zu begrenzen und 20 ml.
4. Hinzufügen Isolationslösung (100 ml) und Kollagenase - Lösung 1 (30 ml) zu Spalte 1 (Col. 1) und der Spalte 2 (Col. 2) in der Langendorff - Perfusionssystem, bzw. (1A).
5. Oxydieren das Isolationslösung und Kollagenase - Lösung 1 in Spalte 1 und Spalte 2 über das Sauerstoffverbindungsrohr in der Langendorff - Perfusionssystem (1A). In ähnlicher Weise oxygenate Kollagenase - Lösung 2 und die BSA - Lösung im Schüttelwasserbad mit 100% O ₂ über dieSauerstoff Verbindungsrohr.

3. Isolierung von LV Myozyten

1. Anesthetize eine SD - Ratte über intraperitoneale Injektion von Natriumpentobarbital (30 mg / kg) und das Anästhetikum Status durch Zeh bestätigen Kneifen und der Mangel an Rückzug Reflexion.
2. Bewegen Sie die Ratte auf eine Dissektion Fach. In der Rückenlage, sichern Sie die vier Beine an den Seiten des Körpers mit Klebeband.
3. Bewerben Brust-Mitte axiale Einschnitte mit chirurgischen Schere, um die Truhe zu öffnen, um sicherzustellen, das Herz nicht zu beschädigen. Verwenden Sie ein anderes Paar saubere Schere , um das Herz von den Verbindungsgefäße zu sezieren (zB obere und untere Hohlvene, Lungengefäße und Aorta) und Perikardmembran ^13.
4. Lassen Sie einen Teil der Aorta eine ausreichende Länge (5-8 mm), klemmen die Aorta mit einer feinen Pinzette, und montieren Sie schnell die Kanüle des Langendorff - Perfusionssystem innerhalb von 1 min (1A). Binden Sie Nähfaden 4/0 dicht über der Aorta.
5. Abmontieren verdaut Herz durch die Aorta schneiden und übertragen es durch Halten der Aorta mit einer Pinzette in den Kolben mit frischen Isolationslösung (Abbildung 1Bi). Verwenden einer feinen Schere und Pinzette die meisten der LV freien Wand zu schneiden (einschließlich des Septum) in kleinere Stücke (~ 22 mm, Abbildung 1Bii).
6. Übertragen Sie die Stücke in einen Kolben vorgewärmte und mit Sauerstoff angereicherte frische Kollagenase - Lösung 2 (Abbildung 1Biii) enthält. Schütteln für 10 min. Halten Sie sich an die myocyte haltigen Kollagenase-Lösung 2 liefert Sauerstoff.
7. Bewegen Sie den myocyte - Suspension auf eine 10 ml Zentrifugenröhrchen Tropfer mit einem Saugball mit und fügen Ca ²⁺ - enthält BSA - Lösung (1: 1 in Volumen). Zentrifuge bei 30 g für 2 min und den Überstand verwerfen. Resuspendieren des Pellets Myozyten in 5 ml BSA-Lösung. Zentrifuge und den Überstand verwerfen.
8. Disperse die myocyte Pellets und halten Myozyten in 10 ml vorge mit Sauerstoff angereicherte Speicherlösung bei RT (Abbildung 1Biv-vi).
9. Wiederholen Sie die Verfahren (Schritte 3,7-3,9) mit dem restlichen LV Gewebe in den Kolben.
   Hinweis: Bewahren Sie die Verfahren zu wiederholen (Schritte 3,7 bis 3,9) erneut, bis die meisten der LV Gewebe verschwindet eine gute Ausbeute an Myozyten zu erhalten.
10. Halten Sie die Myozyten in Speicherlösung für 6-8 Stunden bei RT bis zum Ende der Experimente.

4. Gleichzeitige Messungen intrazellulärer Ca ²⁺ Transienten und Muskelzellen Kontraktions

1. Last LV Myozyten mit dem Acetoxymethylester Fura-2 AM (2 uM).
   Hinweis: Führen Sie alle Ladevorgänge und Experimente mit geladenen Myozyten in einem dunklen Rohr (Abbildung 1Bvii).
   1. Centrifuge die Myozyten-Suspension (1 ml) bei 2.000 xg für 10 sec. Überstand verwerfen und erneut zu suspendieren die myocyte Pellet in 1 ml Tyrode - Lösung mit einer niedrigen Ca ²⁺ Konzentration (250 & mgr; M, Tisch Materialien und Geräte).
   2. In Fura-02.00 und Poloxamer 407 (2 ul), sanft die myocyte Suspension zu dispergieren, und halten Sie die Mischung bei RT (20 bis 24 ^° C) für 15 Minuten (Abbildung 1Bvii).
   3. Zentrifuge die Mischung für 5 Sekunden, um den Überstand verwerfen und die Myozyten - Pellet in 1 ml Perfusionslösung ²⁺ , enthaltend 500 uM Ca dispergieren. Nach 10 min Zentrifugation der Mischung für 5 Sekunden und den Überstand verwerfen.
   4. In frischen Perfusions - Lösung (500 & mgr; M Ca ^2+, 1 ml) und halten Sie die Fura-02.00 - geladen myocyte Pellet in dieser Lösung für Aufnahmen.
2. Messung des LV Myozyten Kontraktion und intrazellulären Ca ²⁺
   1. Vor der Aufnahme, füllen Sie das Perfusions-Schlauch, der durch eine läuftWassermantel mit der Tyrode - Lösung, die auf 36 ^o C vorgewärmt ist
   2. Legen Sie ein paar Tropfen des Fura 02.00 - geladen LV myocyte Suspension auf die Kammer eines invertierten Fluoreszenzmikroskop 5 - 8 min. perfuse langsam die Tyrode-Lösung (2,2 ml / min).
   3. Drücken Sie die Schaltfläche "Start" auf der Frontplatte des digitalen Stimulator Feldstimulation (2 Hz) starten.
      Hinweis: Die Ausgangsspannung (10 V, 5 msec Dauer) wird in der Kammer durch Platindrähte mit den Myozyten aufgebracht auf jeder Seite der Kammer positioniert ist.
      1. Wählen Sie Myozyten stabil, dass Vertrag (nicht diejenigen, die Anzeige Hyper- oder Hypo-Kontraktion) für die Aufnahme.
   4. Stellen Sie die myocyte der Wahl in der horizontalen Position des videobasierten Sarkomers Detektionssystem und stellen Sie den Fokus des Mikroskops optimale Bilder von Sarkomere zu erhalten. Positionieren Sie den lila rechteckigen Kasten auf dem Gebiet, in dem klar Sarkomere klar, bis die durchschnittliche beobachtet werdenvon Sarkomers Längen (rot Peak) zeigt eine singuläre scharfe Spitze (2A, unteres Bild).
   5. Aufzeichnen der Änderungen der Sarkomerlänge in Reaktion auf Feldstimulation (2A und B).
      Hinweis: Verwenden Sie die geladenen Myozyten in 1 - 2 Stunden.
   6. Stellen Sie die Blende der Kamera so , dass das Feld in der videobasierten Sarkomers Detektionssystem ist die Größe der Myozyten (2A). Stimulieren die Myozyten mit einer Anregung bei 360 nm / 380 nm und Emission bei 510 nm (Erfassungsfrequenz 1000 Hz). Nehmen Sie Sarkomerverkürzung und die Fura2 AM Verhältnis mit Feldstimulation (2B).

5. Bewertung der myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit

1. Der Mittelwert der Sarkomers Längen und Ca ²⁺ Transienten im Steady-State (10 - 20 Spuren) , und zeichnen Sie die Phase-Ebene Schleife des Fura-2 - Verhältnis vs. Sarkomerlänge des gleichen myocyte (beide mit Messwerts und Deltaänderungen; 2C).
2. In jedem Plot definieren Fura -2 - Verhältnis bei 50% Relaxation (EC _50, 2C). Vergleichen Sie sowohl die Schleife und EC ₅₀ von jeder Intervention.

Representative Results

LV Myozyten werden aus normalen und hypertensiven Rattenherzen isoliert. Stabförmige Myozyten mit klaren Riefen (die Sarkomere) und stabile Kontraktionen in Reaktion auf Feldstimulation werden als die optimale Myozyten zu sein und sind für die Aufnahmen (2A) ausgewählt. In dem Beispiel in F ild 2A gezeigt ist , -beladene a Fura 02.00 LV Myozyten ist horizontal und die Blende der Kamera positioniert ist , so eingestellt, dass die Myozyten der größte Teil des Aufzeichnungsfelds und minimale Hintergrundbereich belegt ist enthalten. Im Aufzeichnungsfeld, passen Sie die Abmessungen des lila Box durch Klicken und Ziehen Sie dieses Feld auf dem Computerbildschirm (durch das Aufnahmeprogramm). Wenn die durchschnittliche Sarkomerlänge eine scharfe rote Spitze zeigt, starten Sie die Aufnahme (2A, unteres Bild).

Sowohl Sarkomerlänge und intrazellulärer Ca ²⁺ transie nts (Fura-2 - Verhältnisse) gleichzeitig aus den gleichen Myozyten (3A) aufgezeichnet. Die mittleren Spuren Sarkomerlänge und Ca ²⁺ Transienten werden in 3B gezeigt. Einzeln diastolischen / systolischen Sarkomers Längen Zeit Peak (PT) und Sarkomerverkürzung werden gemessen, um die Amplitude und die Dynamik von Myozyten Kontraktilität zu untersuchen. Zeit bis 50% Relaxation (TR ₅₀₎ analysiert , um die Relaxation der Myozyten zu beurteilen. In ähnlicher Weise der diastolischen und systolischen Fura-2 - Verhältnisse (Ca ²⁺ Transienten), Zeit (PT) von Ca ²⁺ Transienten und Zeitkonstante von Ca ²⁺ vorübergehende Zerfall (tau) zu Peak werden analysiert , um myocyte Kontraktion und Entspannung (Tabelle beurteilen 1). In diesem Beispiel werden die Amplituden der Ca ²⁺ Transienten in LV Myozyten von einer hypertensiven Ratte moderat erhöht und Kontraktion moderat reduziert (3B und Tabelle 1).

Inhalt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Darüber hinaus sind die Beziehungen zwischen dem Fura - 2 - Verhältnis und Sarkomerlänge (die myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit von LV Myozyten anzeigt) sind in beiden Schein und hypertensiven Ratten aufgetragen ( . 3C) , um die Fura-2 - Sarkomerlänge Trajektorie während der Entspannungsphase des Myozyten definiert ein quasi~~POS=TRUNC von Cytosol Ca ^2+, Ca ²⁺ myofilament Bindung und Sarkomerlänge ^14; daher wird die Entspannungsphase zwischen den beiden verglichenen Gruppen. die Rechtsverschiebung der Flugbahn in Myozyten aus der Gruppe hypertensive. Dementsprechend eine reduzierte myofilament Antwort auf Ca ²⁺ (3C) zeigt, die intrazelluläre Ca ²⁺ -Konzentration , die für Halb Relaxation (EC ₅₀₎ erhöht wird (3C) , die sich auf myofilament Ca ²⁺ -desensitization in Hypertonie.

Abbildung 1. Verfahren für die LV Myozyten von Rattenherzen zu isolieren. (A) Das System Langendorff - Perfusion verwendet , um die Isolationslösung in das Herz über die Aorta (kleines Bild, vergrößertes Bild des montierten Herz auf dem Perfusions - System) eine Kanüle eingeführt , um perfuse (B) i - iii. Das Herz nach der Verdauung mit Kollagenase - Lösung 1 und seziert LV Gewebe in einer Schale und Kolben (B) iv - vi:.. Muskelzellen - Suspension nach der Zugabe von Kollagenase - Lösung 2, Myozyten Pellet nach Zentrifugation und resuspendiert Myozyten - Pellet in Aufbewahrungslösung (B) vii: Inkubation inkubieren LV Myozyten in Fura 02.00 - haltige Isolationslösung (2 uM Fura 2 AM, 250 & mgr; M Ca ²⁺ und mit 2 ul Poloxamer 407); Auswaschen, waschen LV Myozyten mit Isolationslösung mit 500 & mgr; M Ca ^2+; Lagerung, halten Fura-2 AM - geladen LV Myozyten infrische Isolationslösung , die 500 & mgr; M Ca ^2+. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Messung der Sarkomerverkürzung und der Fura-2 - Ratio (indikativ für die intrazelluläre Ca2 ⁺ Ebene). (A) Ein Diagramm Sarkomers, ein Bild einer Fura-2 -beladenen LV Myozyten und der gemittelte Sarkomerlänge (die rote peak) auf dem Computer angezeigt. In der unteren Platte, ist die schwarze Linie die durchschnittliche jeder horizontalen Pixelzeile innerhalb der violetten Bereich von Interesse. Die blaue Linie ist die gleichen Daten an jedem Ende auf Null gesetzt. Die rote Linie ist die schnelle Fourier-Transformation (FFT) Leistungsspektrum, das die Anzahl der Signale die FFT repräsentiert hat berechnet. Eine scharfe peak bedeutet eine saubere Sarkomers Aufnahme. (B) Die gleichzeitige Aufnahmen von Sarkomerlänge und der Fura -2 - Verhältnis in Reaktion auf Feldstimulation (2 Hz). (C) Phase-Ebene Grundstück des Verhältnisses Fura 2 gegen Sarkomerlänge des gleichen LV myocyte (beachten Sie, dass sowohl die tatsächliche Länge / Fura 2-Verhältnis und Deltaänderungen dieser Parameter analysiert werden). EC ₅₀ (Fura 2 - Verhältnis bei 50% Entspannung, Kreis durch einen Pfeil) ist der qualitativen Vergleich von myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit zwischen den Gruppen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse der Analyse von LV myocyte Kontraktion in der Sham und hypertensiven Ratten. (A) Raw Spuren von Sarkomers shortening und Fura - 2 Verhältnismessung in LV Myozyten von Schein und hypertensiven Ratten (B) Durchschnittliche Spuren von Sarkomerlänge und Fura -. 2 Signale. 2 - Verhältnis vs. Sarkomerlänge (sowohl die tatsächliche Länge und Fura - - 2 - Verhältnis und delta Änderungen dieser Parameter) in den beiden Gruppen Parameter in den gemittelten Spuren analysiert werden in Tabelle 1 (C) Phase Lebene Plots der Fura gezeigten . Die Trajektorie Schleife wird nach rechts verschoben und ₅₀ EC neigt in Hypertension , höher zu sein, myofilament Ca ²⁺ Desensibilisierung hindeutet. PT, Zeit (sec) zu Peak; Tau, Zeitkonstante von Ca ²⁺ vorübergehende Zerfall (sec) (erhalten durch den Rückgang Phase des Fura - Fitting - 2 - Verhältnis mit einer Exponentialfunktion) .TR _50: Zeit bis 50% Relaxation (sec). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version zu sehendieser Figur.

	Parameter	Schein	Hypertonie
Intrazellulärem Ca 2+	Diastolischen Ca 2+	1,189	1,124
	Der systolische Ca 2+	1,71	1,691
	Amplitude (Δ-Verhältnis)	0,521	0,567
	Time to Peak (PT, s)	0,021	0,031
	Tau (s)	0,079	0,076
Sarkomers	Der diastolische	1,758	1,78
	Sarkomerlänge (um)
	Sarkomers	0,122	0,115
	Kürzung (16; Länge, mm)
	Time to Peak (PT, s)	0,064	0,055
	Time to 50%	0,032	0,03
	Entspannung (TR 50, s)
EC50	[Ca 2+] i (Fura-2 - Verhältnis) 50% Sarkomers relengthening	0,2382	0,3224

Tabelle 1. Analyse der Fura - 2 - Verhältnis (intrazelluläre Ca2 ⁺⁾ und Sarkomerlänge Messungen.

Discussion

Hier beschreiben wir die Protokolle Änderungen von myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit in einzelnen isolierten Kardiomyozyten zu bewerten und betonen die Bedeutung der Messung dieser Parameter neben elektrophysiologischen Eigenschaften, die intrazelluläre Ca2 ⁺ Transienten und myofilament Dynamik. Dies liegt daran, die Aufnahmen von einem oder zwei der Parameter können die Mechanismen zugrunde liegenden Herzkontraktion und Entspannung nicht expliziert. Im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren , die Myozyten - Kontraktion und die intrazelluläre Ca ²⁺ Profil einzeln ^1, das vorliegende Verfahren messen sucht beide Parameter gleichzeitig im gleichen Herzmyozyten.

Eine Reihe von Verfahren sind im allgemeinen zur Bewertung der myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit von Muskeln oder Myozyten ^15,16,17, beispielsweise Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen exogenen Ca ²⁺ und Sarkomers / Zellenlänge / Spannung in enthäuteten Myozyten verwendet(Behandelt mit Detergenzien wie Saponin oder β-Esin um die Membran zu permeabilisieren). Die Längen sind mit Fotodiode und Laserstrahlbeugungsverfahren gemessen, und die Spannung mit Kraftaufnehmer oder Kohlefasern). Diese Techniken sind weit verbreitet in der Muskelstudien verwendet , weil sie quantitative Bewertungen von myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit ermöglichen. Endogene Ionenkanal - Aktivitäten in der Plasmamembran und intrazellulären Ca ²⁺ Handhabung erforderlich diejenigen sind jedoch auf die Mechanik der myofilament initiieren, werden in diesen Techniken vernachlässigt. Darüber hinaus sind die Muskelstreifen oder Myozyten in Untersuchung vorgedehnten zu einer bestimmten diastolischen Länge und unter diesen Bedingungen die anfängliche Sarkomerlänge kann von der tatsächlichen diastolischen Länge der Myozyten (insbesondere in Krankheitszuständen und mit Eingriffen) unterscheiden. Dies unterstreicht die Vorteile der aktuellen Messung, wo Zellorganellen relativ unbeeindruckt bleiben, wodurch, so dass der umfassende Evaluation von myocyte Kontraktionsfunktion.

Verständlicherweise Qualität der Myozyten (Ca ²⁺ -tolerating) und die optimale Beladung von Fura - 02.00 sind zwei Schlüsselelemente für eine erfolgreiche Beurteilung der myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit. Dementsprechend sind mehrere Modifikationen an dem Protokoll angewandt , um praktikable stabförmigen Myozyten erhalten (60-80% der gesamten Zellen, wie zuvor ^18,19,20 beschrieben). Zunächst wird eine geringe Dosis von Ca ²⁺ auf die Lösungen während der Aufschlußverfahren zugesetzt (beispielsweise die Ca ²⁺ -Konzentration beträgt 50 & mgr; M in den Kollagenase - Lösungen und 200 uM in der Speicherlösung). Zweitens, während der Verdauung wird BSA auf die Kollagenase-Lösungen zugesetzt Membranstabilität zu verbessern. Drittens sind die meisten der Lösungen während der Isolierung oxygenierten, die den Prozentsatz der funktionellen Myozyten und die Dauer der Experimente (6-8 h) erhöht. Viertens werden isolierte Myozyten in Speicherlösung c gehaltenontaining 200 uM Ca ^2+.

Um eine optimale Beladung mit Fura 02.00 zu erhalten, zwei unterschiedliche Ca ²⁺ Konzentrationen (250 und 500 & mgr; M) verwendet , und Poloxamer 407 (2 & mgr; l, 20% in Dimethylsulfoxid) zugesetzt , um die Durchlässigkeit von Fura-2AM durch die Membran zu verbessern und seine Stabilität in Myozyten. Es sollte , dass alle Indikatorfarbstoffe Ca ^{2+ 21} Puffer sind Ca ²⁺ zu beachten. Daher sollten Forscher unter Verwendung einer hohen Konzentration von Fura-2 AM oder eine längere Inkubation vermeiden übermäßige Pufferung und reduziert Myozyten Kontraktilität vermeiden. Es wird empfohlen, myocyte Kontraktion ohne Fura - 2 Laden wird routinemäßig überprüft, was ein wesentlicher Schritt ist die Qualität der Myozyten und den Ladestatus zu schätzen. Variability in Laden ist unvermeidlich. Daher ist es wichtig, die Variabilität der Myozyten-Kontraktion zu überprüfen, insbesondere, ob die Anzahl der Myozyten in der Kammer ähnlich ist, bevor und einem öffentlichenfter Laden. Analyse von Hyper- oder Hypo-Contracting Myozyten sollte vermieden werden, weil sie nicht den durchschnittlichen Stand von Myozyten repräsentieren und kann verzerrten Ergebnissen und Auswertungen führen.

Es sollte beachtet werden , daß die gemessenen Änderungen der Fura 2 - Verhältnis sind Reflexionen des intrazellulären Ca ²⁺ Ebene, anstatt die tatsächliche chemische Konzentration von Ca ^2+. Daher wertet der hier beschriebenen Verfahren qualitative Veränderungen von myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit, anstatt die tatsächliche Empfindlichkeit des Myofilamente zu Ca ^2+. Kalibrierung von Fura - 2 - Signal an die intrazelluläre Ca2 ⁺ -Konzentration ist die Lösung zuverlässig Ca ²⁺ Konzentrationen in einzelnen Myozyten zu erwerben. Das Kalibrierungsverfahren erfordert das Laden Myozyten mit verschiedenen Konzentrationen von Ca ²⁺ -konjugiertem Fura - 02.00 (Ca ²⁺ -Konzentration im Bereich von 0 bis 39 uM), und die erhaltene Fura - 2 -Verhältnissen mit th berechnete folgende Formel: [Ca ^2+] _i = Kd * (R - R min) / (Rmax - R) * F380max / F380min ^21. Es ist möglich , die gepoolten Mittelwerte Ca ²⁺ -Konzentrationen durch einen solchen Kalibrierungsverfahren abgeleitet werden . Da jedoch das Laden von Ca ²⁺ Indikatoren variable unter Myozyten und Kalibrierung ist nicht in einer einzelnen Zelle durchgeführt, Ca ²⁺ -Konzentrationen nicht genau erfasst werden. Wenn ferner F360 / F380 gemessen wird , statt F340 / F380 (wie in der vorliegenden Studie), die Fura 2 -Verhältnis weniger genau (weil F360 der isobestischen Wellenlänge von Fura-2 - Fluoreszenz ^22). Dennoch ist es immer noch eine gültige Methode zur qualitativen Veränderungen in myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit in physiologischen Experimenten beurteilen, besonders in erkrankten menschlichen Herzen, wo Myofilamente können gleichzeitig nach Änderungen in der intrazellulären Umgebung verändert werden. Es wird empfohlen, dass dieses Verfahren mit alternativen Methoden kombiniert wird (wie dezuvor in der Diskussion Abschnitt beschrieben) , um genau die wahre Empfindlichkeit von Myofilamente zu Ca ²⁺ zu analysieren.

Die andere Begrenzung des Verfahrens bei der Untersuchung von Myozyten Kontraktion der unbelasteten Zustand. Es kann die Änderungen in myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit unterschätzen oder überschätzen. Deshalb, um genau myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit, Analyse sollte durchgeführt werden , mit alternativen Messungen für sowohl qualitative als auch quantitative Bewertung zu bewerten.

Die Technik ist für myokardiale Funktion in gesunden und kranken Herzen der Beurteilung, einschließlich der menschlichen Herz Proben, in denen die zellulären Redox-Milieu und posttranskriptionales Modifikationen verändert werden, was zu einer damit einhergehenden Veränderungen in myofilament Funktionen. Insbesondere Ionenkanäle, die intrazelluläre Ionenhomöostase und regulatorische Proteine ​​in Myofilamente sind interaktiv; daher alle diese Komponenten funktionieren in concert Herzleistung in vivo zu bestimmen (beispielsweise wie in der Echokardiographie gemessen).

Abschließend beschreiben wir eine Methode , um die Änderungen von myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit und betonen die Bedeutung der Analyse dieser Parameter in Verbindung mit Herz - Elektrophysiologie, intrazellulärer Ca ²⁺ Handhabung und myocyte Kontraktion zu bewerten eine vollständige Profil von myocyte Funktion zu erhalten. Myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit sollte mit erkranktem Herzmodelle routinemßig in mechanistische Studien gemessen werden, wobei Änderungen dieser Parameter sowie verschiedene intrazelluläre Signalwege miteinander verbunden sind.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM