Valutazione della myofilament Ca Published: August 1, 2016 doi: 10.3791/54057

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Zai Hao Zhao¹, Chun Li Jin¹, Ji Hyun Jang¹, Yu Na Wu¹, Sung Joon Kim¹, Hong Hua Jin², Lan Cui², Yin Hua Zhang^1,2,3

¹Department of Physiology & Biomedical Sciences, Ischemic/hypoxic Disease Institute, Seoul National University College of Medicine, ²Yan Bian University Hospital, ³Institute of Cardiovascular Sciences, University of Manchester

Abstract

L'insufficienza cardiaca e aritmie cardiache sono le principali cause di mortalità e morbilità in tutto il mondo. Tuttavia, il meccanismo di patogenesi e malfunzionamenti miocardio nel cuore malato deve essere ancora pienamente chiariti. Prova convincente recente dimostra che i cambiamenti nel myofilament Ca ²⁺ sensibilità influenzano Ca ²⁺ intracellulare attività omeostasi e canali ionici in miociti cardiaci, i meccanismi fondamentali responsabili del potenziale d'azione cardiaco e la contrazione nei cuori sani e malati. Infatti, le attività di canali ionici e trasportatori sottostanti potenziali d'azione cardiaci (ad esempio, Na ^+, Ca ²⁺ e canali K ⁺ e Na ⁺ -Ca ²⁺ scambiatore) e Ca ²⁺ movimentazione proteine ​​intracellulari (ad es., Recettori rianodinici e Ca ²⁺ -ATPasi nel reticolo sarcoplasmatico (SERCA2a) o fosfolambano e la sua fosforilazione) sono convenzionalmente misurata condotta in basemangiato i meccanismi fondamentali di attacco cardiaco eccitazione-contrazione (EC). Entrambe le attività elettrica nella membrana e intracellulari Ca ²⁺ cambiamenti sono i segnali di attivazione di accoppiamento CE, che myofilament è l'unità funzionale di contrazione e rilassamento, e myofilament Ca ²⁺ sensibilità è indispensabile nella realizzazione di prestazioni myofibril. Tuttavia, pochi studi incorporano myofilament Ca ²⁺ sensibilità nell'analisi funzionale del miocardio a meno che non è al centro dello studio. Qui, descriviamo un protocollo che misura sarcomere accorciamento / ri-allungamento e il livello di intracellulare di Ca ²⁺ usando Fura-2 AM (rilevamento raziometrico) e valutare i cambiamenti di myofilament Ca ²⁺ sensibilità nei miociti cardiaci da cuori di ratto. L'obiettivo principale è quello di sottolineare che myofilament Ca ²⁺ sensibilità dovrebbe essere presa in considerazione in abbinamento CE per l'analisi meccanicistica. un'indagine completa di isui canali ionici, trasportatori, intracellulare di gestione di Ca ^2+, e myofilament Ca ²⁺ sensibilità che sono alla base dei miociti contrattilità nei cuori sani e malati fornirà informazioni preziose per la progettazione di strategie più efficaci di traslazione e valore terapeutico.

Introduction

Cardiac accoppiamento eccitazione-contrazione (EC) è lo schema fondamentale per analizzare le proprietà meccaniche del miocardio, cioè, la funzione contrattile del cuore ^1,2. Accoppiamento CE è avviata da depolarizzazione della membrana secondaria alle attività di canali ionici sarcolemma (ad esempio, il canale Na ⁺ voltaggio-dipendenti, che può essere misurata mediante tecniche di patch-clamp). Successiva attivazione di voltaggio-dipendenti di tipo L Ca ²⁺ canali (LTCCs) e Ca ²⁺ afflusso tramite LTCCs innescare la maggior parte di Ca ²⁺ rilascio attraverso i recettori rianodinici (RyRs), aumentando la concentrazione citoplasmatica di Ca ²⁺ dal nanomolari (nm ) a livello micromolare (micron). Tale aumento di Ca ²⁺ citosolico promuove Ca ²⁺ legame troponina C (TNC) a filamenti sottili e suscita cambiamenti conformazionali del complesso filamento per facilitare l'interazione actina-miosina e myocardi raggiungeAl contrazione ^3. Viceversa, il citosolico Ca ²⁺ è ri-uptaken indietro nel reticolo sarcoplasmatico (SR) attraverso il Ca ²⁺ -ATPasi in SR (SERCA2a) o viene estrusa dalla miociti tramite la Na ⁺ / Ca ²⁺ scambiatore e la plasmalemmal Ca ²⁺ ATPasi ^1,2. Di conseguenza, il declino della Ca citosolico ^{2 +} istiga cambiamenti conformazionali di filamenti sottili di nuovo allo stato originale, con conseguente dissociazione di actina-miosina e miociti relax ^1-3. In questo schema, l'attività di SERCA2a è generalmente considerato per determinare la velocità di rilasciamento miocardico perché il 70 - 90% di citosolico rimozione Ca ²⁺ nella maggior cellule cardiache mammifero ^1. Come tale, anormale Ca ²⁺ movimentazione da LTCC, RyR e SERCA2a, ecc è stato considerato i meccanismi primari per contrattilità alterata e relax nel cuore malato ^1-4.

2+ che funziona come il messaggero in conti di accoppiamento CE per circa l'1% del totale intracellulare di Ca ²⁺ e la maggior parte di Ca ²⁺ è destinata a intracellulari di Ca ²⁺ buffer ^5,6. Ciò è dovuto al fatto che i vari Ca ²⁺ buffer sono abbondanti in miociti cardiaci, ad esempio, i fosfolipidi di membrana, ATP, fosfocreatina, calmodulina, parvalbumina, myofibril TnC, miosina, SERCA2a e calsequestrina nella SR. ^5,6,7. Tra questi, SERCA2a e TnC sono i predominanti Ca ²⁺ buffer ^5,6,7. Inoltre, Ca ²⁺ vincolante ai suoi buffer è un processo dinamico durante contrazione (ad esempio, 30-50% di Ca ²⁺ si lega a TnC e dissociare da esso durante Ca ²⁺ transitori ⁷⁾ e la variazione di Ca ²⁺ causa aggiuntiva vincolante "release" del libero Ca ²⁺ al citosol, i risultati nelle alterazioni della intracellulare Ca ²⁺ concentration. Di conseguenza, perturbazione del intracellulare livello di Ca ²⁺ induce movimenti myofilament anomali, che sono i precursori di disfunzione contrattile e aritmie ^8,9. Molti fattori (sia fisiologici e patologici) possono essere le fonti di modificazioni post-trascrizionali di proteine ​​myofilament, che influenzano myofilament Ca ²⁺ buffering e myofilament Ca ²⁺ sensibilità ^8-10. Recentemente, è stato riportato che le mutazioni nelle proteine ​​myofilament aumentano il Ca ²⁺ affinità di legame e intracellulare movimentazione Ca ^2+, innescando potenziamento pausa-dipendente di Ca ²⁺ transitori, rilascio anormale Ca ^2+, e aritmie ^8. In linea con questo concetto, abbiamo anche dimostrato che myofilament Ca ²⁺ desensibilizzazione nei cuori di ratto ipertesi secondari per l'up-regolazione di neuronale ossido nitrico sintasi è associata ad diastolica elevata e sistolica Ca ²⁺ livelli^11, che a sua volta, aumenta la vulnerabilità del LTCC Ca ²⁺ -dipendente inattivazione ^12. Quindi, myofilament Ca ²⁺ sensibilità è un regolatore "attivo" di intracellulare omeostasi e miociti funzione contrattile Ca ^2+. E 'diventato necessario analizzare le interazioni tra myofilament e Ca ²⁺ movimentazione proteine ​​per un'indagine approfondita di miociti accoppiamento CE e la funzione cardiaca.

Qui, descriviamo un protocollo che valuta i cambiamenti di myofilament Ca ²⁺ sensibilità in isolate miociti cardiaci. Analisi completa di intracellulare Ca ²⁺ profilo, myofilament Ca ²⁺ sensibilità e la contrazione sarà scoprire nuovi meccanismi meccanici del miocardio sottostanti.

Protocol

Il protocollo è in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio pubblicati dal National Institutes of Health delle Nazioni Unite (NIH Publication No. 85-23, rivisto 1996). E 'stato approvato dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) di Seoul National University (approvazione IACUC no .: SNU-101.213-1).

1. Buffer Preparazione (Materiali e attrezzature Tabella)

1. Preparare 300 ml di soluzione di isolamento fresco il giorno dell'esperimento (in mM: NaCl, 135; KCl, 5,4, MgCl _2, 3,5, glucosio, 5; HEPES, 5; Na ₂ HPO _4, 0,4, taurina, 20; pH 7,4 con NaOH).
2. Preparare 100 ml di soluzione di conservazione fresco il giorno dell'esperimento (in mM: NaCl 120; KCl 5,4; MgSO ₄ 5; CaCl ₂ 0.2; sodio piruvato 5; glucosio 5,5; taurina 20; HEPES 10; mannitolo 29; pH 7,4 con NaOH).
3. Preparare 1L di soluzione di perfusione (in mm: NaCl, 141.4, KCl, 4; NaH ₂ PO _4, 0,33; MGCl _2, 1; HEPES, 10; glucosio, 5.5; CaCl _2, 1.8; mannitolo, 14.5; pH 7,4 con NaOH).
4. Preparare 30 ml di soluzione di collagenasi 1 aggiungendo collagenasi (1 mg / ml), proteasi (0,1 mg / ml), albumina di siero bovino (BSA, 1.67mg / ml), e Ca ²⁺ (0.05 mM) a 25 ml di isolamento soluzione.
5. Preparare 20 ml di soluzione di collagenasi 2 aggiungendo collagenasi (1 mg / ml), BSA (1.67 mg / ml), e Ca ²⁺ (0.05 mM) di 16,7 ml di soluzione di isolamento.
6. Preparare 40 ml di soluzione di BSA aggiungendo 0,4 g di BSA a 40 ml di soluzione di isolamento. Separati da 10 ml e 30 ml in due bicchieri. Aggiungere Ca ²⁺ a 30 ml di soluzione di BSA in modo che la concentrazione finale di Ca ²⁺ nella soluzione BSA è 1 mM.

2. Preparazione per l'isolamento di ventricolare sinistra (LV) miociti

1. Trasferire 8-12 ratti Sprague-Dawley (SD) settimane di età, di sesso maschile in gabbie di trasporto puliti dal stabulario per la stanza di preparazione e l'isolamento.
2. Hmangiare due bagni di acqua a 37 ^° C.
   Nota: utilizzare il bagno uno di acqua per l'acqua - serbatoio camicia ed i tubi di perfusione del sistema di perfusione Langendorff. Utilizzare l'altro bagno d'acqua per agitare tronchi tessuto miocardico in modo da separare singoli miociti.
3. Aggiungere 5 ml e 3,3 ml di soluzione di BSA (senza Ca ²⁺⁾ a 25 ml di soluzione di collagenasi 1 e 16,7 ml di soluzione di collagenasi 2 per compensare il volume a 30 ml e 20 ml, rispettivamente.
4. Aggiungere soluzione di isolamento (100 ml) e soluzione di collagenasi 1 (30 ml) alla colonna 1 (Col. 1) e la colonna 2 (Col. 2) nel sistema Langendorff perfusione, rispettivamente (Figura 1A).
5. Ossigenare la soluzione di isolamento e soluzione di collagenasi 1 nella Colonna 1 e Col.2 tramite il tubo di collegamento ossigeno nel sistema di perfusione Langendorff (Figura 1A). Analogamente, soluzione di collagenasi ossigenato 2 e la soluzione BSA nel bagnomaria agitazione con 100% O ₂ tramitetubo di collegamento di ossigeno.

3. Isolamento di LV miociti

1. Anestetizzare un ratto SD tramite iniezione intraperitoneale di sodio pentobarbital (30 mg / kg) e confermare lo stato anestetico da punta pizzicare e la mancanza di recesso riflessione.
2. Spostare il ratto di un vassoio dissezione. Nella posizione supina, fissare le quattro gambe ai lati del corpo con nastro.
3. Applicare incisioni metà assiale del torace con le forbici chirurgiche per aprire il torace, assicurando di non danneggiare il cuore. Utilizzare un altro paio di forbici pulite per sezionare il cuore dai vasi di collegamento (ad esempio, superiore e vena cava inferiore, vasi polmonari, e l'aorta) e la membrana pericardica ^13.
4. Lasciare una porzione dell'aorta di lunghezza sufficiente (5 - 8 mm), bloccare l'aorta con pinza sottile, e rapidamente montare la cannula del sistema di perfusione Langendorff entro 1 min (Figura 1A). Tie filo di sutura 4/0 strettamente sopra l'aorta.
5. Smontare il cuore digerita tagliando l'aorta e trasferirla tenendo l'aorta con una pinza nel pallone contenente soluzione di isolamento fresco (Figura 1BI). Usare le forbici sottili e pinze per tagliare la maggior parte della parete libera LV (compreso il setto) in pezzi più piccoli (~ 22 mm, Figura 1Bii).
6. Trasferire i pezzi in un pallone contenente soluzione di collagenasi fresca pre-riscaldato e ossigenata 2 (figura 1Biii). Agitare per 10 min. Mantenere fornire ossigeno alla soluzione di collagenasi miociti contenente 2.
7. Spostare il miociti - sospensione in una provetta da 10 ml centrifuga using contagocce con un bulbo di aspirazione e aggiungere Ca ²⁺ - contenente soluzione di BSA (1: 1 in volume). Centrifugare a 30 g per 2 minuti e scartare il surnatante. Risospendere il pellet miociti in 5 ml di soluzione di BSA. Centrifuga e scartare il surnatante.
8. Disperdere il pellet miociti e tenere miociti in 10 ml di soluzione di storage pre-ossigenato a temperatura ambiente (Figura 1Biv-VI).
9. Ripetere le procedure (passi 3.7 - 3.9) si con il restante tessuto LV nel pallone.
   Nota: Mantenere ripetendo le procedure (punti 3.7 - 3.9) si ancora fino maggior parte del tessuto LV scompare per ottenere una buona resa di miociti.
10. Mantenere i miociti in soluzione di archiviazione per 6-8 ore a temperatura ambiente fino alla fine degli esperimenti.

4. Le misurazioni simultanee di intracellulari Ca ²⁺ transitori e miociti Contrazione

1. miociti carico LV con la acetossimetil estere Fura-2 AM (2 micron).
   Nota: eseguire tutte le operazioni di carico e gli esperimenti con i miociti caricato in un tubo scuro (Figura 1Bvii).
   1. Centrifuge sospensione miociti (1 ml) a 2.000 xg per 10 sec. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet miociti in 1 ml di soluzione Tyrode con una bassa concentrazione di Ca ²⁺ (250 micron, materiali e attrezzature tabella).
   2. Aggiungere Fura-2 del mattino e polossamero 407 (2 ml), disperdere delicatamente la sospensione dei miociti, e mantenere la miscela a temperatura ambiente (20 - 24 ^° C) per 15 minuti (Figura 1Bvii).
   3. Centrifugare la miscela per 5 sec, scartare il surnatante e disperdere il pellet miociti in 1 ml di soluzione di perfusione contenente 500 mM Ca ^2+. Dopo 10 minuti, centrifugare la miscela per 5 secondi e scartare il surnatante.
   4. Aggiungere la soluzione perfusione fresco (500 mM Ca ^2+, 1 ml) e mantenere il Fura-02:00 - pellet miociti caricata in questa soluzione per registrazioni.
2. Misura di LV miociti contrazione e intracellulare di Ca ²⁺
   1. Prima di registrare, riempire il tubo perfusione che attraversa uncamicia d'acqua con la soluzione Tyrode, che è pre-riscaldata a 36 ^o C.
   2. Mettere qualche goccia della Fura 02:00 - loaded sospensione dei miociti LV sulla camera di un microscopio a fluorescenza invertito per 5-8 min. Lentamente profumato la soluzione di Tyrode (2,2 ml / min).
   3. Premere il tasto "start" sul pannello frontale del stimolatore digitale per avviare stimolazione del campo (2 Hz).
      Nota: La tensione di uscita (10 V, 5 msec durata) è applicato al miociti nella camera attraverso fili di platino posizionate su entrambi i lati della camera.
      1. Selezionare i miociti che si contraggono in modo stabile (non quelli visualizzazione iper o ipo-contrazione) per la registrazione.
   4. Regolare la miociti di scelta nella posizione orizzontale del sistema di rilevazione sarcomero basato su video e regolare la messa a fuoco del microscopio per ottenere immagini ottimali di sarcomeri. Posizionare la scatola rettangolare viola sulla zona in cui sarcomeres chiari sono chiaramente rispettati solo alla mediadi lunghezze sarcomero (picco rosso) mostra un picco singolare affilato (Figura 2A, immagine in basso).
   5. Registrare le variazioni di lunghezza sarcomero in risposta alla stimolazione del campo (Figura 2A e B).
      Nota: utilizzare i miociti caricati entro 1 - 2 ore.
   6. Regolare il diaframma della telecamera in modo che il campo nel sistema di rilevazione sarcomere video-based è la dimensione della miociti (Figura 2A). Stimolare la miociti con eccitazione a 360 nm / 380 nm ed emissione a 510 nm (frequenza di acquisizione 1.000 Hz). Record accorciamento sarcomere e il rapporto Fura2 AM con stimolazione del campo (Figura 2B).

5. Valutazione di myofilament Ca ²⁺ Sensibilità

1. La media dei lunghezze sarcomero e Ca ²⁺ transitori a stato stazionario (10 - 20 tracce) e tracciare il ciclo di fase piano del rapporto di Fura-2 rispetto alla lunghezza del sarcomero dello stesso miociti (entrambe con valore misuratoS e delta cambi; Figura 2C).
2. In ogni trama, definire il rapporto Fura -2 al relax% 50 (EC _50, Figura 2C). Confronto sia il loop e EC ₅₀ di ogni intervento.

Representative Results

miociti LV sono isolati da normali e ipertesi cuori di ratto. Miociti a forma di bastoncello con striature chiare (che rappresenta sarcomeri) e contrazioni stabili in risposta alla stimolazione campo sono considerati come i miociti ottimali e sono selezionati per le registrazioni (Figura 2A). Nell'esempio illustrato in F IGURA 2A, un Fura 02:00 MOLLA LV miociti è posizionato orizzontalmente e la apertura della telecamera viene regolata in modo che il miociti occupa la maggior parte del campo di registrazione e area minima di sfondo è incluso. Nel campo della registrazione, regolare le dimensioni della scatola viola cliccando e trascinando la casella sullo schermo del computer (attraverso il programma di registrazione). Quando la lunghezza media sarcomero mostra un brusco picco rosso, avviare la registrazione (Figura 2A, immagine in basso).

Sia la lunghezza sarcomero e intracellulare di Ca ²⁺ transie NTS (Fura-2 rapporti) sono registrate contemporaneamente dagli stessi miociti (Figura 3A). Le tracce medi di lunghezza sarcomero e Ca ²⁺ transitori sono mostrati nella Figura 3B. Individualmente, lunghezze diastolica / sistolica sarcomero, il tempo di picco (PT), e sarcomere accorciamento sono misurati per indagare l'ampiezza e la dinamica dei miociti contrattilità. Tempo di relax% 50 (TR ₅₀₎ viene analizzato per valutare il rilassamento del miociti. Allo stesso modo, la diastolica e sistolica Fura-2 rapporti (Ca ²⁺ transitori), il tempo di picco (PT) di Ca ²⁺ transitori e costante di tempo di Ca ²⁺ smorzamento transitorio (tau) vengono analizzati per valutare miociti contrazione e rilassamento (Tabella 1). In questo esempio, le ampiezze di Ca ²⁺ transitori sono moderatamente aumentati nei miociti LV da un ratto iperteso e contrazione è moderatamente ridotta (Figura 3B e Tabella 1).

contenuti "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Inoltre, i rapporti tra la Fura - 2 il rapporto e la lunghezza del sarcomero (che indica la myofilament Ca ²⁺ sensibilità dei miociti LV) sono riportati in entrambi i ratti sham e ipertesi ( . Figura 3C) la Fura 2 - sarcomere lunghezza traiettoria durante la fase di rilassamento del myocyte definisce un quasi-equilibrio citosol Ca ^2+, Ca ²⁺ myofilament vincolante, e la lunghezza sarcomere ^14, pertanto, la fase di rilassamento è confrontata tra i due gruppi. lo spostamento verso destra della traiettoria in miociti dal gruppo ipertesi indica una risposta myofilament ridotto a Ca ²⁺ (Figura 3C). di conseguenza, l'intracellulare Ca ²⁺ concentrazione richiesta per mezzo di rilassamento (EC ₅₀₎ viene aumentata (Figura 3C) , riferendosi a myofilament Ca ²⁺ -desensitization in ipertensione.

Figura 1. Le procedure per isolare miociti LV dal cuore di ratto. (A) Il sistema di perfusione Langendorff utilizzato per perfusione della soluzione di isolamento nel cuore cannulato tramite l'aorta (inserto, ingrandita del cuore montato sul sistema di perfusione) (B) i - iii. Il cuore dopo la digestione con soluzione di collagenasi 1 e sezionato tessuti LV in un piatto e pallone (B) IV - VI:.. sospensione miociti dopo l'aggiunta della soluzione di collagenasi 2, miociti pellet dopo centrifugazione, e ri-sospensione pellet miociti nella soluzione di conservazione (B) VII: incubazione, incubare LV miociti in Fura 02:00 - soluzione contenente isolamento (2 mM Fura 02:00, 250 micron Ca ²⁺ e con 2 ml polossamero 407); washout, lavare miociti LV con soluzione di isolamento con 500 mM Ca ^2+; stoccaggio, tenere Fura-2 AM - miociti LV caricati insoluzione di isolamento fresco contenente 500 mM Ca ^2+. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Misurazione della sarcomere accorciamento e il rapporto Fura-2 (indicativa del livello intracellulare Ca ^2+). (A) Un diagramma di sarcomere, l'immagine di un Fura-2 MOLLA LV miociti e la lunghezza media sarcomere (picco rosso) vengono visualizzati sul computer. Nel pannello inferiore, la linea nera è la media di ogni riga di pixel orizzontali all'interno della regione viola di interesse. La linea blu sono gli stessi dati azzerato ad ogni estremità. La linea rossa è la trasformata rapida di Fourier (FFT) spettro di potenza, che rappresenta il numero di segnali FFT è calcolato. Un pe acutoak significa una registrazione sarcomero pulito. (B) registrazioni simultanee di lunghezza sarcomero e il rapporto della Fura -2 in risposta alla stimolazione campo (2 Hz). trama (C) Fase-piano del rapporto di Fura 2 vs lunghezza sarcomero dello stesso LV miociti (si noti che sia la lunghezza effettiva rapporto e delta / Fura 2 variazioni di questi parametri vengono analizzati). EC ₅₀ (Fura rapporto 2 al 50% relax, cerchio indicato dalla freccia) è il confronto qualitativo delle myofilament Ca ²⁺ sensibilità tra i gruppi. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Risultati rappresentativi delle analisi di LV miociti contrazione sham e ratti ipertesi. (A) tracce prime di sarcomere shortening e Fura - 2 misurazione del rapporto in LV miociti da farsa e ratti ipertesi (B) tracce media di lunghezza sarcomero e Fura -. 2 segnali. Parametri analizzati nelle tracce medi sono riportati in Tabella 1. (C) Trame Phase-piane del Fura - 2 rapporto rispetto alla lunghezza sarcomero (sia la lunghezza effettiva e Fura - 2 rapporto e delta variazioni di tali parametri) nei due gruppi . Il ciclo traiettoria viene spostata verso destra e CE ₅₀ tende ad essere superiore a ipertensione, suggerendo myofilament Ca ²⁺ desensibilizzazione. PT, il tempo di picco (sec); Tau, costante di tempo di Ca ²⁺ smorzamento transitorio (sec) (ottenuto montando la fase di declino della Fura - rapporto di 2 con una funzione esponenziale) .TR _50: tempo per il relax del 50% (sec). Clicca qui per vedere una versione più grandedi questa figura.

	parametri	finzione	Ipertensione
Intracellulare Ca 2+	Diastolica Ca 2+	1.189	1.124
	Sistolica Ca 2+	1.71	1.691
	Ampiezza (Δ ratio)	0,521	0,567
	Tempo di picco (PT, s)	0,021	0,031
	Tau (s)	0,079	0.076
sarcomere	diastolica	1.758	1.78
	lunghezza sarcomero (micron)
	sarcomere	0,122	0,115
	Grasso solido vegetale o animale per cucinare (16; di lunghezza, mm)
	Tempo di picco (PT, s)	0,064	0,055
	Time to 50%	0,032	0.03
	Relax (TR 50, s)
EC50	[Ca 2 +] i (Fura-2 ratio) per il 50% sarcomere relengthening	0,2382	0,3224

Tabella 1. Analisi della Fura - 2 rapporto (intracellulare di Ca ²⁺⁾ e sarcomero misure di lunghezza.

Discussion

Qui, descriviamo i protocolli per valutare i cambiamenti di myofilament Ca ²⁺ sensibilità in un'unica miociti cardiaci isolati e sottolineare l'importanza di misurare questo parametro insieme a proprietà elettrofisiologiche, intracellulari di Ca ²⁺ transitori, e la dinamica myofilament. Questo perché le registrazioni di uno o due dei parametri non possono spiegare i meccanismi sottostanti contrazione cardiaca e relax. A differenza dei metodi convenzionali che misurano miociti contrazione e intracellulare Ca ²⁺ profilo singolarmente ^1, il presente metodo esamina entrambi i parametri simultaneamente nelle stesse miociti cardiaci.

Un certo numero di metodi sono generalmente utilizzati per valutare l'myofilament Ca ²⁺ sensibilità dei muscoli o miociti ^15,16,17, ad esempio, un esame delle interazioni tra esogena Ca ²⁺ e sarcomere / lunghezza delle cellule / tensione nei miociti dalla pelle(Trattato con detergenti come la saponina o β-Esin per permeabilize la membrana). Lunghezze sono misurati con fotodiodo e tecniche di diffrazione del fascio laser, e tensione con trasduttori di forza o fibre di carbonio). Queste tecniche sono ampiamente usati in studi muscolari perché permettono valutazioni quantitative di myofilament Ca ²⁺ sensibilità. Tuttavia, le attività dei canali ionici endogene nella membrana plasmatica e intracellulare movimentazione Ca ^2+, quelli sono necessari per avviare i meccanismi di myofilament, vengono trascurati in queste tecniche. Inoltre, le strisce muscolari o miociti sotto studio sono prestirato per una certa lunghezza diastolica, e, in queste condizioni, la lunghezza sarcomero iniziale possono differire dalla lunghezza effettiva diastolica dei miociti (soprattutto in condizioni di malattia e con interventi). Questo evidenzia il vantaggio di misura di corrente dove organelli cellulari rimangono relativamente imperturbato, quindi, consentendo valu completozione della funzione contrattile dei miociti.

Comprensibilmente, la qualità dei miociti (Ca ²⁺ -tolerating) e il carico ottimale della Fura - 2AM sono due elementi chiave per la valutazione di successo del myofilament Ca ²⁺ sensibilità. Pertanto, numerose modifiche sono applicate al protocollo per ottenere miociti astiformi vitali (60-80% delle cellule totali, come descritto in precedenza ^18,19,20). In primo luogo, una bassa dose di Ca ²⁺ è aggiunto alle soluzioni durante i processi di digestione (ad esempio, la concentrazione di Ca ²⁺ è 50 mM nelle soluzioni collagenasi e 200 mM nella soluzione di conservazione). In secondo luogo, durante il processo di digestione, BSA viene aggiunto alle soluzioni collagenasi per migliorare la stabilità della membrana. Terzo, la maggior parte delle soluzioni sono ossigenato durante l'isolamento, che aumenta la percentuale di miociti funzionali e la durata degli esperimenti (6-8 hr). In quarto luogo, miociti isolati sono conservati in deposito soluzione containing 200 micron Ca ^2+.

Per ottenere carico ottimale con Fura 02:00, due differenti Ca ²⁺ concentrazioni (250 e 500 micron) vengono utilizzati e polossamero 407 (2 ml, 20% preparato in dimetilsolfossido) viene aggiunto per migliorare la permeabilità di Fura-02:00 attraverso la membrana e la sua stabilità in miociti. Va notato che tutti Ca ²⁺ indicatori coloranti sono Ca ²⁺ buffer ^21. Pertanto, i ricercatori dovrebbero evitare di un'alta concentrazione di Fura-2 AM o una incubazione più lungo per evitare il buffering eccessivo e ridotta contrattilità miociti. Si raccomanda che miociti contrazione senza Fura - 2 caricamento è controllato ordinariamente, che è un passo essenziale per stimare la qualità di miociti e lo stato di caricamento. La variabilità nel carico è inevitabile. Pertanto, è importante controllare la variabilità dei miociti contrazione, in particolare, se il numero di contrarre miociti nella camera è simile prima e unaopo carico. L'analisi dei miociti iper o ipo-contraenti deve essere evitato perché non rappresentano lo stato medio di miociti e possono causare risultati distorti e valutazioni.

Va notato che i cambiamenti misurati nel rapporto Fura 2 sono riflessi della intracellulare livello di Ca ^2+, piuttosto che la concentrazione chimica effettiva di Ca ^2+. Pertanto, il metodo descritto qui di valutare cambiamenti qualitativi di myofilament Ca ²⁺ sensibilità, piuttosto che la sensibilità reale di miofilamenti di Ca ^2+. Calibrazione di Fura - 2 segnale alla concentrazione intracellulare di Ca ²⁺ è la soluzione per acquisire affidabili Ca ²⁺ concentrazioni nei singoli miociti. La procedura di taratura richiede miociti loading varie concentrazioni di Ca ²⁺ coniugata Fura - 2 AM (Ca ²⁺ concentrazione da 0 a 39 mM), e ottenuto Fura - 2 coefficienti sono calcolati con the seguente formula: [Ca ^2+] _i = Kd * (R - Rmin) / (Rmax - R) * F380max / F380min ^21. È possibile ricavare i valori medi aggregati di Ca ²⁺ concentrazioni attraverso una tale procedura di calibrazione. Tuttavia, poiché il carico di Ca ²⁺ indicatori è variabile tra miociti e calibrazione non viene eseguita in una singola cella, Ca ²⁺ concentrazioni possono non essere acquisiti in modo accurato. Inoltre, se F360 / F380 è misurata anziché F340 / F380 (come nel presente studio), il rapporto di Fura 2 è meno accurata (perché F360 è la lunghezza d'onda isobestic di Fura-2 fluorescenza ^22). Tuttavia, è ancora un valido metodo per valutare i cambiamenti qualitativi nei myofilament Ca ²⁺ sensibilità negli esperimenti fisiologici, in particolare nei cuori umani malati, dove miofilamenti possono essere modificati in concomitanza dopo cambiamenti nell'ambiente intracellulare. Si raccomanda che questo metodo è combinato con metodi alternativi (come dedescritto in precedenza nella sezione Discussione) per analizzare con precisione la vera sensibilità dei miofilamenti di Ca ^2+.

L'altra limitazione del metodo nello studio della miociti contrazione è la condizione scarica. Essa può sottostimare o sovrastimare i cambiamenti nella myofilament Ca ²⁺ sensibilità. Pertanto, per valutare con precisione myofilament Ca ²⁺ sensibilità, l'analisi deve essere eseguita con misure alternative per la valutazione sia qualitativa che quantitativa.

La tecnica è applicabile per la valutazione della funzione miocardica nei cuori sani e malati, compresi i campioni cardiache umane, dove l'ambiente redox cellulare e modificazioni post-trascrizionali vengono modificati, con conseguente alterazioni concomitanti nelle funzioni myofilament. In particolare, i canali ionici, intracellulare omeostasi di ioni e proteine ​​regolatrici in miofilamenti sono interattivi; Pertanto, tutti questi componenti funzionano in concert per determinare le prestazioni di cuore in vivo (ad esempio, come misurato nel ecocardiografia).

In conclusione, si descrive un metodo per valutare i cambiamenti di myofilament Ca ²⁺ sensibilità e sottolineiamo l'importanza di analizzare questo parametro insieme con elettrofisiologia cardiaca, intracellulare movimentazione Ca ^2+, e miociti contrazione per ottenere un profilo completo della funzione dei miociti. Myofilament Ca ²⁺ sensibilità deve essere misurata sistematicamente negli studi meccanicistici che utilizzano modelli di cuore malato, dove i cambiamenti in questi parametri così come le varie vie di segnalazione intracellulare sono interconnessi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM