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Methodenartikel

Adenoviralen Gentherapie für diabetische Keratopathie: Auswirkungen auf die Wundheilung und Zellmarker Expression in Human Organ kultivierten Hornhäute und Limbale Epithelial Stammzellen

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DOI:

10.3791/54058

⸱

7. April 2016

 ,  , 
1Eye Program, Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Departments of Biomedical Sciences and Neurosurgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein Beispiel für eine adenovirale Gentherapie bei menschlichen diabetischen Organkulturen wird vorgestellt, um die verzögerte Wundheilung und die deutlich reduzierte Expression von epithelialen Stammzellmarkern in diesen Hornhäuten zu normalisieren. Es wird auch die Optimierung dieses Prozesses in stammzellangereicherten limbalen Epithelkulturen beschrieben.

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist molekularen Veränderungen in humanen diabetischen Cornea zu beschreiben und zu zeigen, wie sie durch adenovirale Gentherapie in organ kultivierten Hornhaut gelindert werden. Die diabetische Hornhauterkrankung ist eine Komplikation des Diabetes mit häufigen Störungen der Hornhautnerven und epitheliale Wundheilung. Wir haben auch signifikant verändert Expression mehrerer putative epitheliale Stammzellmarkern in humanen diabetischen Cornea dokumentiert. Um diese Änderungen, adenovirale Gentherapie lindern wurde erfolgreich die Hochregulation von c-met proto-Onkogen-Expression durchgeführt und / oder das Herunterregulieren von Proteinasen Matrix-Metalloproteinase-10 (MMP-10) und Cathepsin F. beschleunigte Heilung dieser Therapie bei diabetischen Cornea gewickelt selbst dann, wenn nur der Limbus-Stammzellen-Kompartiment wurde transduziert. Die besten Ergebnisse wurden mit einer kombinierten Behandlung erhalten. Für mögliche Patienten Transplantation von normalisierten Stammzellen ist ein Beispiel auch der optimizati vorgestelltauf der Gen-Transduktion in Stammzell-angereichertem Kulturen unter Verwendung von polykationischen Verstärker. Dieser Ansatz kann nützlich sein, nicht nur für die ausgewählten Gene sondern auch für die anderen Mediatoren von cornealen epithelialen Wundheilung und Zellfunktion stammen.

Einleitung

Die diabetische Hornhauterkrankung führt vor allem zu degenerativen epithelialen (Keratitis) und Nerven (Neuropathie) ändert. Es wird oft von den Anomalien der epithelialen Wundheilung und Hornhautnerven Reduktion 1-4 manifestiert. Schätzungsweise 60-70% Diabetiker haben verschiedene Hornhautprobleme 1,3. Unsere Studien haben mehrere Markerproteine ​​mit veränderten Expression in humanen diabetischen Augenhornhaut einschließlich der Herunterregulation von c-met-Protoonkogen (Hepatozyten - Wachstumsfaktor - Rezeptor) und die Aufregulation der Matrix - Metalloproteinase-10 (MMP-10) und Cathepsin F 5, identifiziert 6. wir haben auch deutlich verringerte Expression von mehreren putative epitheliale Stammzellmarkern in den humanen diabetischen Cornea dokumentiert.

In den früheren Studien haben wir ein adenovirales basierten Gentherapie zur Normalisierung der Pegel von Diabetes-altered Markern unter Verwendung von humanen diabetische korneale Organkultursystem entwickelt, das langsame Wundheilung zeigt, diabetischeMarker Änderungen und die Expression Zellmarker Reduktion Stammzellen ähnlich wie die ex vivo Cornea 7,8. Diese Persistenz der Änderungen angezeigt 9 aufgrund der Existenz von epigenetischen metabolischen Speicher sein. Dieses Kultursystem wurde weiter verwendet für die Gentherapie. Die Ziele für diese Therapie wurden entweder mit reduzierter Expression bei diabetischen Cornea (c-met proto-Onkogen) oder erhöhte Expression (MMP-10 und Cathepsin F) aus Markern ausgewählt.

Das Adenovirus (AV) Therapie wurde in den gesamten Orgel kultivierten Cornea oder der korneoskleralen peripheren Limbus Raum nur verwendet. Dieses Fach beherbergt Stammzellen epithelialen, die das Hornhautepithel erneuern und sich aktiv an der Wunde 4,10-15 Heilung teilnehmen. Hier Protokolle werden für normalen und diabetischen menschlichen Cornea-Organkultur, epitheliale Wundheilung, Isolierung und Charakterisierung von Stammzellen angereicherte Limbus Zellkulturen und adenoviralen Zelle und korneale Transduktion vorgesehen. UnserErgebnisse zeigen die Machbarkeit dieser Therapie für Markerexpression zu normalisieren und bei diabetischen Cornea für mögliche künftige Transplantation Wundheilung. Sie legen auch nahe , dass die Kombinationstherapie die wirksamste Weg ist , 16-18 normalen Markierungsmuster und Epithelheilung in der diabetischen Cornea wiederherzustellen.

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Protokoll

Nationale Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) geliefert Zustimmung post-mortem gesunden und diabetischen menschlichen Augen und Augenhornhaut. NDRI des menschlichen Gewebes Sammlung Protokoll wird durch den Führungsausschuss und nach National Institutes of Health Aufsicht genehmigt. Diese Forschung wurde im Rahmen der genehmigten Cedars-Sinai Medical Center Institutional Review Board (IRB) befreit Protokoll EX-1055 durchgeführt. Collaborating Hornhautchirurgen, Drs. E. Maguen und Y. Rabinowitz, geliefert Verwerfungs korneoskleralen Felgen für die Isolierung von Stammzell-angereichertem Hornhautepithels Kulturen. Diese Forschung wurde im Rahmen der genehmigten IRB-Protokoll Pro00019393 durchgeführt.

1. Die menschliche Hornhautorgankultur

Hinweis: Normal und diabetischer Cornea oder ganze Augen werden in gekühlten Cornea - Speichermedium erhalten (zB Optisol GS) innerhalb von 48 Stunden nach dem Tod von der nationalen Anbieter NDRI.

  1. Entfernen Sie die Cornea aus Containerlager mit einer Pinzette und waschen Sie sie zweimal in das Antibiotikum-Antimykotikum (ABAM) Mischung. Bei ganzen Augen, schneiden Sie die Cornea aus den Kugeln mit einer gebogenen Schere. Lassen Sie mindestens 5 mm konjunktivaler Felge und auch die Cornea in ABAM waschen.
  2. Bereiten Sie die Mischung in der Hornhaut Konkavität angeordnet werden. Es besteht aus serumfreiem essentiellem Minimalmedium (MEM), enthaltend ABAM, 1 mg / ml Kalbshaut-Kollagen (aus einer Stammlösung von 10 mg / ml in 0,1 N Essigsäure hergestellt), 1% Agar, und Insulin-Transferrin-Selenit Ergänzung 7.
  3. Mikrowellen diese Mischung für die Sterilisation und Agar Auflösung zum Sieden. Es kann bis zu 1 Minute dauern, alles zu lösen. Lassen Sie die Rohrkappe teilweise offen, weil die Mischung leicht überläuft, wenn es kocht. Aus diesem Grund können mehrere siedendem Zyklen benötigt werden, die jeweils für 10-15 sec. Abkühlen der Mischung auf 37-39 ° C.
  4. Legen Sie die Cornea epithelialen Seite nach unten in sterile 60-mm-Schalen. Füllen Sie die Hornhaut Höhlung mit etwa 0,5 ml der Mischung in 1.2 beschrieben. DasMischung verfestigt sich auf die Hornhaut innerhalb von 2 min.
  5. Legen Sie die Cornea - Agar - Seite nach unten in sterile 60-mm - Schalen und fügen Sie den vollständigen Medium , das MEM mit ABAM und Insulin-Transferrin-Selenit Ergänzung 7 (37 ° C) zu halten sein Niveau in etwa auf dem Limbus für Luft-Flüssigkeit - Grenzfläche Kultur. Das Medium Volumen 7-8 ml pro Schale.
  6. Die Schalen werden mit den Hornhäuten in einem 5% CO 2 Inkubator mit einer Wasserwanne befeuchtete (diese Weise Feuchtigkeit auf oder über 95% gehalten) bei 35 ° C (normale Hornhauttemperatur). 100 l Medium (zwei Tropfen) täglich auf dem Epithel der Hornhaut zu befeuchten.
  7. Überwachen Sie die Hornhautmorphologie und die epitheliale die Lebensfähigkeit der Zellen mikroskopisch unter Durchlicht ein Standardmikroskop mit einem 4X-Objektiven verwendet. Tun Sie dies einmal pro Tag.
  8. Ändern Sie das Medium alle drei Tage. Die Cornea kann für mindestens 3 Wochen kultiviert werden. Für die Gentherapie Experimente, Kultur die Hornhäute für 3-5 Tage, dann TRANSDUCe mit Genen von Interesse (4,1-4,4), lassen für weitere 3-5 Tage auf dem Transgen und unterliegt dem Protokoll Wundheilung abhängig (2,1-2,4).

2. Epithelial Wundheilung

Anmerkung: In den diabetischen Cornea, die epitheliale Debridement durch mechanisches Abkratzen nicht möglich ist, da die zerbrechliche Epithelbasalmembran in dem Prozess abgetrennt wird, das nicht in den normalen Cornea geschieht. Somit sind die normalen und diabetischen Cornea unter ähnlichen Bedingungen der Wundheilung zu halten, chemische Entfernung des Epithels mit n-Heptanol 19 verwendet. Dieses Verfahren entfernt das Epithel, aber hinterlässt eine intakte Basalmembran in den normalen und diabetischen Augenhornhaut.

  1. Zentrale epithelialen debridement 20, legen Sie einen 5 mm Filterpapierscheibe in n-Heptanol auf der zentralen Hornhautvorderfläche 75 Sekunden lang getränkt auszuführen.
  2. Entfernen Sie den Filter und waschen Sie die Cornea in voller Medium. Füllen Sie die Vertiefung mit 0,5 ml Agar-KollagenMischung und Kultur wie in 1.4. Nach Debridement sterben die Epithelzellen in der Regel und abzustreifen Zurücklassung mikroskopisch intakten Basalmembran 7.
  3. Verwenden Sie 8,5 mm Scheiben größeren epitheliale Wunden in den Experimenten zu schaffen, mit nur Limbus Gentherapie. Dadurch wird die Einbindung der Limbus-Stammzellen in den Heilungsprozess zu gewährleisten.
  4. Überwachen Sie die Hornhautheilung mikroskopisch. Machen Sie Fotos mit 4x und 10x täglich, bis der Epitheldefekt vollständig geheilt ist. Der Heilungsprozess kann von 2 bis 15 Tage dauern, je nach Zustand (normal oder Diabetiker) und Wundgröße.
    Hinweis: Während des Heilungsprozesses, schwarze Spinne-ähnliche Zellen werden am oberen Brennebene beobachtet. Diese Zellen sind apoptotische Stromatumoren Keratozyten , die nach der epithelialen Entfernung 4 starben. Die Heilung wird bestimmt , vollständig zu sein , wenn diese toten Zellen überwuchert von der Heilung Epithel sind und nicht mehr sichtbar sind (Abbildung 2, Einschub).
  5. Nach der HeilungAbschluss, schneiden Sie die Cornea in der Hälfte, betten sie in OCT - Verbindung und Verfahren zur indirekten Immun auf Cryostatschnitten oder für Western - Blots 16,21.

3. Isolierung von Limbale Zellen und Pflege von Stammzell-angereichertem Kulturen

Hinweis: Bereiten Sie den primären Limbus epithelialen Stammzellen (LESC) angereicherter Kulturen von den korneoskleralen Felgen. Die Felgen kommen von gesunden Spendern und verworfen nach Hornhauttransplantationen aus der Zusammenarbeit Chirurgen in der Standard - Cornea - Speichermedium (zB Optisol) empfangen werden. Ansonsten können die LESC angereicherten Kulturen von den Felgen von normalen und diabetischen ganze Hornhaut exzidiert erhalten werden oder Globen von NDRI in der Hornhautspeichermedium empfangen wird.

  1. Wenn die ganze Hornhaut oder Kugeln verwendet werden, zuerst die Limbus-Bereiche zu isolieren. Um dies zu tun, legen Sie die Hornhaut auf einer sterilen Plastikschale mit epithelialen Seite nach oben und entfernen Sie den zentralen Bereich mit einem 9-mm Trephine (Kreishornhautmesser).Entsorgen Sie diesen zentralen Teil. Dann auszuschneiden die Limbuszone einen 13 mm trephine verwenden und den äußeren konjunktivaler Teil verwerfen. Zur Isolierung Zellen verwenden, um die Bagel-like Limbus Felge. Vor der Zellisolierung, entfernen Sie die Endothelzellen und anhaftende Reste der Iris von der Innenseite der Hornhaut gegenüber der Oberfläche Epithel mit einem sterilen Wattestäbchen.
  2. Isolieren Limbus Zellschichten mit Dispase Behandlung. Inkubieren jeder korneoskleralen Felge mit 2,4 U / ml Dispase II in 1,5 ml Keratinozyten serumfreiem Medium (KSFM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 ° C für 2 Stunden 22 ergänzt.
  3. Sanft Leichtigkeit der Felge unter einem Sezieren Stereomikroskop mit einer Pinzette die Limbus-epithelialen Zellschicht ab und die Zellen in 1 ml 0,25% Trypsin distanziere - 0,02% EDTA-Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
  4. Waschen Sie die Zellen in 10 ml Medium (zB Epilife) und pelletieren sie bei 300 xg in einer Tischzentrifuge für 5 min bei Raumtemperatur.
  5. resuspendieren the Zellen in Kulturmedium: Medium mit N2, B27 und menschliches Wachstums Keratinozyten Ergänzungen und 10 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF).
  6. Samen der Zellen bei 3.000-5.000 Zellen / ml in Fläschchen oder 60 mm - Schalen überzogen mit einem Gemisch aus humanen Basalmembranproteine ​​einschließlich Fibronectin, Typ IV Collagen und Laminin (FCL) bei 0,5-1 & mgr; g / cm 2, in der KSFM Mittel.
  7. Kultur der Zellen in einem befeuchteten (95% oder höherer Luftfeuchtigkeit) CO 2 Inkubator bei 37 ° C , bis sie bilden vollständig konfluenten Monolayern. Dies kann 1-2 Wochen dauern.
    Hinweis: Sie regelmäßig die Zellidentität durch positive immunzytochemische Färbung bestätigen für mutmaßliche LESC Marker einschließlich PAX6, Keratin (K) 14, K15, K17 und ΔNp63α. Die Färbung Details einschließlich der primären Antikörper wurden 8,16-18,22 veröffentlicht.
  8. In den Durchgang der konfluenten Zellen, behandeln sie mit 1 ml 0,05% Trypsin-Lösung (1: 5 Verdünnung der 0,25% ige Lösung) für 10 min bei 37 ° C. 5 ml Soja trypsin Inhibitorlösung (10 mg / ml), verdünnt 1: 4 in einem Medium und Zentrifugation der Zellen, wie in 3.5.
  9. Wasche das Zellpellet in 3 ml verdünnter Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor-Lösung. Platte der Zellen auf FCL-beschichteten (siehe 3.7) Gerichte oder Glaskammer gleitet auf 2 x 10 4 Zellen / ml.

4. adenovirale Transduktion von Orgel-kultivierten Hornhäute

Hinweis: Die rekombinanten Adenoviren (AV) umfassen AV-Vektor (kein Gen eingefügt), AV-CMET (mit c-Met - Gen offene Leserahmen), AV-shM10 (mit shRNA zu MMP-10) und AV-SHCF ( mit shRNA zu Cathepsin F). Sie sind E1 / E3-deletierten Typ 5 AV-Gene unter der Kontrolle des Major Immediate Early-Cytomegalovirus-Promotor exprimiert. Die AV-CMET Viren werden mit AV - Vektor - Auflage- / CMV / V5-DEST 16 erzeugt. Die AV-shRNA-Viren sind speziell durch Subklonierung von shRNA-Sequenzen zusammen mit hH1 Promotor und GFP-Tag-Sequenz von iLenti-EGFP Vektor in eine vermehrungsunfähige (-E1 / -E3) huma erzeugtn AV - Typ - 5 - Genom mit Adeno-4 - Expressionssystem 17.

  1. Transduzieren ein organ kultiviert Hornhaut eines jeden Paares mit AV Vektor und ein anderes Hornhaut, mit einem Gen-Expression-modulierenden AV. Verwenden , um die AV-CMET bei 0,8 bis 1,25 x 10 8 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) pro Cornea in Kulturmedium für 48 Stunden bei 37 ° C die Kornea unter der Oberfläche des Mediums zu halten jeweils in eine Vertiefung einer Schale mit 24 Vertiefungen. Verwenden Sie die AV-shRNA - Viren bei 1-2 x 10 8 pfu pro Hornhaut.
  2. Verwenden Sie die Viren für die Transduktion in voller Medium, das mit 75 ug / ml Sildenafil Citrat. Dieses Reagenz aktiviert die Caveolin Transport 21 viral Aufnahme durch die Epithelzellen zu ermöglichen. Aufgrund später kurze Halbwertszeit von Sildenafil in wässrigen Lösungen, erneut hinzufügen die gleiche Menge auf das Medium 4-5 Std. Die Standardbehandlung ist für 48 Stunden.
  3. Übertragen Cornea zu neuen Gerichten mit einem runden Ende sterilen Spatel und Kultur im Medium ohne AV den mittleren Pegel am Limbus zu halten. Nach dem Additional 4-8 Tage an der Flüssigkeit-Luft-Grenzfläche, verarbeiten die AV-behandelten Hornhäute für verschiedene Analysen oder Tests für epitheliale Wundheilung (siehe oben). Befeuchten Sie regelmäßig die Hornhaut während der Kultur von 100 ul Medium Zugabe (zwei Tropfen) auf der Hornhaut.
  4. Für die Transduktion der Limbus-Zellen nur inkubieren die Viren mit den Cornea an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche mit mittlerem Pegel am Limbus, Transduktion des zentralen Epithel zu vermeiden.

5. adenovirale Transduktion von Cultured Limbale Zellen

  1. Pflegen Sie die LESC angereicherten Kulturen im Medium mit 10 ng / ml EGF (siehe 3.5) auf Plastikschalen mit dem FCL Mischung beschichtet mit 0,5 g / cm 2.
  2. Transduzieren kultivierten Zellen, die 70-80% Konfluenz mit dem AV erreicht haben, das grün fluoreszierende Protein-Gen (AV-GFP) oder den AV-verschlüsselten shRNA-GFP in einem Bereich von Multiplizität der Infektion (MOI: 1-300 pfu / Zelle) beherbergen im Medium mit 2 ng / ml EGF. Führen Sie die transduction für 4 h bei 37 ° C in einem minimalen Volumen (0,2 ml), gefolgt von 20 Stunden in 0,5 ml Medium. Der Caveolin Transport Aktivator Sildenafil ist nicht für die Zellkultur Transduktion benötigt.
  3. Verwenden eines der folgenden Reagentien, die die AV-Bindung an der Zelloberfläche ermöglichen die AV Transduktionseffizienz zu erhöhen: entweder Polykationen (1 ug / ml poly-L-Lysin oder 5 & mgr; g / ml Polybren) oder 6 & mgr; l / ml Transduktion Reagenz ( Beispiel ViraDuctin) oder 20 & mgr; l / ml Transduktion Enhancer (zB ibiBoost).
  4. Nach dem Austausch des Mediums für das eine ohne das AV inkubieren gezüchteten Zellen für 4 Tage in der befeuchteten CO 2 -Inkubator und GFP - Expressionsniveau mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop ausgewertet.
  5. Verwenden Sie die Kratzer Wundheilung Assay Zellmigration in den AV-transduzierten Kulturen zu bewerten. Wachsen die Zellen in den Multi-Well-Kammer gleitet. Nehmen Sie die Wunden in einer Monoschicht von Zellen in einer geraden linearen Bewegung mit einer 200 & mgr; l pi KratzenPette Spitze. Nach der Verwundung, ändern Sie das Medium für ein frisches der abgelösten Zellen zu entfernen.
  6. Fotografieren Sie jeden Tag die Wunden mit einer Digitalkamera auf einem inversen Mikroskop befestigt mit 4-facher Vergrößerung. die Zeit aufzeichnen, wenn die Heilung abgeschlossen ist (die Wundränder in Berührung kommen, entlang der gesamten Wunde).

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Ergebnisse

Wir haben , daß die Unterschiede in der Expression von diabetischer Marker (zB Basalmembranproteine ​​und Integrin α3β1) und Wundheilung zwischen den normalen und diabetischen Hornhäute werden erhalten in den Hornhautorgankulturen zuvor gezeigt. Dieses Kultursystem wurde gerichtet auf die Gentherapie unterzogen, um die Niveaus von diabetes-altered Marker Normalisierung, c-Met, MMP-10 und Cathepsin F.

Wenn das gesamte ...

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Diskussion

Die Hornhaut wird aufgrund seiner Oberflächenstelle ein ideales Gewebe für die Gentherapie, wo die Genübertragung, sowie die Bewertung der Wirksamkeit und Nebenwirkungen, einfach sind. Allerdings ist eine klinische Umsetzung dieser leistungsstarken Ansatz immer noch langsam aufgrund knappen Informationen über die genetischen Ursachen der Erkrankungen der Hornhaut und der Gentherapie Targets 24. Diabetische Komplikationen Hornhautveränderungen einschließlich können in der Natur weitgehend epigenetische sein, d...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine finanziellen Interessen.

Danksagungen

Wir danken für die finanzielle Unterstützung durch NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), den CTSI-Zuschuss UL 1RR033176 (AVL) und Zuschüsse des Regenerative Medicine Institute, Cedars-Cedars Medical Center.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Minimum essentielles MediumThermo Fisher Scientific11095-080
Optisol-GS Bausch & Lomb50006-OPT
ABAM Antibiotikum-Antimykotikum-GemischThermo Fisher Scientific15240062
Kollagen aus Kalbshaut Sigma-Aldrich C9791
Agar, GewebekulturqualitätSigma-Aldbsp;A1296
n-HeptanolSigma-Aldrich 72954-5ML-F
O.C.T. Mischung VWR International25608-930
Vertrieb II Roche Applied Science4942078001
keratinozyten-serumfreies Medium (KSFM)Thermo Fisher Scientific17005042
EpiLife Medium mit CalciumThermo Fisher ScientificMEPI500CA
N2 Medium Supplement, 100xThermo Fisher Scientific17502-048
B27 Medium Supplement, 50xThermo Fisher Scientific17504-044
Human Keratinozyten Wachstumssupplement, 100xThermo Fisher ScientificS-001-5
Trypsin 0,25 % - EDTA 0,02 % mit PhenolrotThermo Fisher Scientific25200056
Trypsin 0,25 % mit PhenolrotThermo Fisher Scientific15050065
Sojabohnen-Trypsin-InhibitorSigma-Aldrich T6414
fötales RinderserumThermo Fisher Scientific26140079
Insulin-Transferrin-Selenit-Ergänzung (ITS)Sigma-Aldrich I3146-5ML
Antikörper gegen Keratin 14Santa Cruz Biotechnologysc-53253
Antikörper gegen Keratin 15Santa Cruz Biotechnologysc-47697
Antikörper gegen Keratin 17Santa Cruz BiotechnologySC-58726
Antikörper gegen Δ Np63αSanta Cruz Biotechnologysc-8609
Antikörper gegen PAX6BioLegendPRB-278P-100
Antikörper gegen Nidogen-1R& D SystemsMAB2570
Antikörper gegen Integrin & Alpha; 3Β 1EMD MilliporeMAB1992
humanes FibronektinBD Biosciences354008
humanes LamininSigma-Aldrich L4445
humanes Kollagen Typ IVSigma-Aldbsp;C6745-1ML
Adenovirus, das MMP-10 shRNA exprimiertCapital BioScienceskundenspezifisches
Adenovirus, das Cathepsin exprimiert, F shRNACapital BioSciences, kundenspezifisches
Adenovirus, das verschlüsselte shRNA exprimiert, und GFPCapital BioSciencesmaßgeschneidertes
Adenovirus, das c-metOriGene (Plasmid)SC323278
Adenovirus, das GFPKeraFASTFVQ002
Sildenafilcitrat exprimiert, 25 mgPfizeraus der Apotheke
epidermaler Wachstumsfaktor Thermo Fisher ScientificPHG0311
Poly-L-LysinSigma-Aldrich P4707
PolybrenSigma-Aldbsp;107689-10G
ViraDuctinCell BiolabsAD-200
ibiBoostibidi, Deutschland50301
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Thermo Fisher Scientific10010049
Corning Spachtel mit rundem Ende Dow Corning3005
60 mm PetrischalenThermo Fisher Scientific174888
Nunc Lab-Tek II Multiwell-Kammer-Objektträger Sigma-AldrichC6807
200 μ l PipettenspitzenBioexpressP-1233-200andere Hersteller verfügbar
Inverses Mikroskop NikonDiaphotandere Hersteller/Modelle
verfügbar befeuchteter CO2 Inkubator Thermo Fisher Scientific370 (Steri-Cycle)weitere Lieferanten/Modelle verfügbar
FluoreszenzmikroskopOlympus, JapanBX-40andere Hersteller/Modelle verfügbar
Präparier-StereomikroskopLeica, DeutschlandS4 Eandere Lieferanten/Modelle verfügbar
, , , , exprimiert

Referenzen

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