Screening Multi-Enzym ein High-throughput Genetic Enzymscreening-System verwenden

Summary

Diese Arbeit stellt eine Methode des Hochdurchsatz-Screenings unter Verwendung eines universellen genetischen Enzym-Screening-Systems vor, das theoretisch auf über 200 Enzyme angewendet werden kann. Dabei identifiziert das Single-Screening-System drei verschiedene Enzyme (Lipase, Cellulase und alkalische Phosphatase) durch einfaches Wechseln des verwendeten Substrats (p-Nitrophenylacetat, p-Nitrophenyl-β-D-Cellobiosid und Phenylphosphat).

Abstract

Die jüngste Entwicklung einer Hochdurchsatz-Einzelzell-Assay-Technik ermöglicht das Screening neuartiger Enzyme basierend auf funktionellen Aktivitäten aus einer groß angelegten metagenomischen Bibliothek¹. Wir haben bereits ein genetisches Enzym-Screening-System (GESS) vorgeschlagen, das einen Dimethylphenol-Regulator verwendet, der durch Phenol oder p-Nitrophenol aktiviert wird. Da eine große Menge natürlicher enzymatischer Reaktionen diese phenolischen Verbindungen aus Phenolsubstraten produziert, kann dieses einzelne genetische Screening-System theoretisch auf das Screening von über 200 verschiedenen Enzymen in der BRENDA-Datenbank angewendet werden. Trotz der allgemeinen Anwendbarkeit von GESS erfordert die Anwendung des Screening-Verfahrens ein spezifisches Verfahren, um die maximalen Durchflusszytometriesignale zu erreichen. Im Folgenden beschreiben wir den entwickelten Screening-Prozess, der die Metagenom-Vorverarbeitung mit GESS und den Betrieb eines Durchflusszytometrie-Sortierers umfasst. Drei verschiedene phenolische Substrate (p-Nitrophenylacetat, p-Nitrophenyl-β-D-Cellobiosid und Phenylphosphat) mit GESS wurden zum Screening und zur Identifizierung von drei verschiedenen Enzymen (Lipase, Cellulase und alkalische Phosphatase) verwendet. Die ausgewählten metagenomischen Enzymaktivitäten konnten nur mit der Durchflusszytometrie bestätigt werden, aber DNA-Sequenzierung und diverse in vitro Analysen können für die weitere Genidentifikation verwendet werden.

Introduction

Eine kürzlich entwickelte Hochdurchsatz - Einzelzellen - Assay - Technik ermöglicht neue Enzyme aus einer großen Genbank auf ihre funktionellen Aktivitäten ¹ basierend gescreent werden. Auf Einzelzellebene, Transkriptionsproteinen regulieren eingesetzt Expression auszulösen Reportergens durch Abfühlen kleine Moleküle, die als Ergebnis eines Zielenzymaktivität erzeugt werden. Ein früher Ansatz involviert die Isolierung eines Phenol abbau Operon aus Ralstonia eutropha E2 unter Verwendung des substratinduzierte Genexpression Screening (SIGEX) Verfahren, bei dem das Substrat , die Expression eines Reporterproteins ² induziert. NHAr von Pseudomonas putida wurde verwendet , um Benzaldehyd - Dehydrogenase ³ und lysG aus Corynebacterium glutamicum ausgewählt wurde für die Hochdurchsatz - Screening eines neuen L-Lysin-produzierender Stamm von unterschiedlichen Mutantenbibliotheken ⁴ verwendet.

Zuvor eine genetische Enzym screening - System (GESS) wurde als allgemein anwendbare Screening - Plattform ⁵ vorgeschlagen. Dieses System verwendet das Phenol-Erkennung Dimethylphenol Regler, DmpR, von P. putida. DmpR (E135K) und eine Mutante von DmpR, können auch in GESS (pNP-GESS) zum Nachweis von p - Nitrophenol (pNP) eingesetzt werden. In Gegenwart von Zielenzymen Herstellung phenolische Verbindungen, GESS in E. coli - Zellen emittiert ein Fluoreszenzsignal, das eine schnelle Trennung von Einzelzellen ermöglicht , eine Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer verwenden (FACS). Aber die Expression des Enzyms metagenomic erscheint als schwächer zu sein, daß der herkömmliche rekombinante Enzyme; Daher wurde GESS ausgelegt phenolische Verbindungen mit maximaler Empfindlichkeit zu erfassen , indem die Kombination der ribosomalen Bindungsstelle (RBS) und Terminatorsequenzen zusammen mit optimalen Betriebszustand ⁵ untersuchen.

Einer der wesentlichen Vorteile von GESS ist, dass diese einzelne Methode ermöglicht es theoretisch das Screening von over als 200 verschiedene Arten von Enzymen in der BRENDA - Datenbank (Tabelle 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013,7) , indem einfach verschiedene Substrate verwendet. Es zeigte sich, dass Cellulase, Lipase gezeigt, und Methyl - Parathion Hydrolase (MPH) kann mit geeigneten Substraten von p - Nitrophenyl- Butyrat, p - Nitrophenyl-cellotrioside und Methyl - Parathion jeweils ⁵ unter Verwendung von pNP-GESS nachgewiesen werden. Vor kurzem wurde nachgewiesen , daß eine alkalische Phosphatase (AP), die eine der neuen Enzyme ist pNP-GESS identifiziert verwendet wird , ist das erste thermolabilen AP in kälteangepassten marine Metagenomen gefunden ^6.

Hier Details des Screening - Prozesses präsentiert mit pNP-GESS die Aktivitäten von drei verschiedenen Arten von enzymes- Lipase Nachweis, Cellulase und alkalische Phosphatase -und schnell neue Kandidaten Enzyme aus einer metagenomic Bibliothek ^5,6 identifizieren. Die Verfahren umfassen die Vorverarbeitung Metagenom mit pNP-GESS und Betrieb eines flow-Zytometrie Sortierer. Während die erhaltenen Treffer müssen zur weiteren Identifizierung sequenziert werden, erstreckt sich dieses Protokoll, das Verfahren auf eine Bestätigung zu den Schritten der Enzymaktivität unter Verwendung von Durchflusszytometrie.

Protocol

1. Vorbereiten der Metagenom-Bibliothek mit pNP-GESS

1. Konstruieren Sie eine Metagenom - Bibliothek in E. coli mit einem Vektor , der eine Fosmid Fosmid Bibliothek Produktions Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers ^5.
2. 100 ul Aliquots der Bibliothek zur Lagerung bei -70 ° C, die eine Quelle der metagenomic Bibliothekszellen ist.
   Anmerkung: Die optische Dichte eines bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD ₆₀₀₎ dieser Bibliothek stock gemessenen Probe ist etwa 100.
3. Auftauen 100 ul der Vorrats metagenomic Bibliothek auf Eis und Beimpfen für 2 h mit 37 ° C inkubiert in einem 500 ml-Kolben, enthaltend 50 ml Luria-Bertani (LB) und 12,5 & mgr; g / ml Chloramphenicol.
4. Ernte der Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen durch Zentrifugation bei 1.000 xg für 20 min bei 4 ° C.
5. Das Pellet schnell in 50 ml eiskaltem destilliertem Wasser (DW) und Zentrifuge bei 1000 × g für 20 min bei 4 ° C wieder.
6. Resuspend das Pellet in 50 ul eiskaltem DW mit 10% (v / v) Glycerin. Verwenden Sie 50 ul dieser Zelle aliquoten für die Elektroporation.
7. Legen Sie die Mischung aus elektro Zellen 50 & mgr; l und pGESS (E135K) ⁵ DNA (100 ng) in einer eiskalten Elektroporationsküvette und elektroporieren (1,8 kV / cm, 25 & mgr; F) die Mischung.
8. Schnell 1 ml SOB-Medium mit Katabolitenrepression (SOC) Medium und die Zellen vorsichtig resuspendieren.
9. Übertragen Sie die Zellen in 14 ml Rundbodenrohr mit einer Pipette und Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde.
10. Verbreiten 500 ul der gewonnenen Zellen auf LB 20 x 20 cm quadratische Platte, die 12,5 & mgr; g / ml Chloramphenicol und 50 ug / ml Ampicillin. Inkubieren Platte bei 30 ° C für 12 Stunden.
11. Schaben die Kolonien eine Zellschaber und sammeln Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen mit eiskalten Zelle Speichermedien.
12. Zentrifuge bei 1.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Das Pellet in 10 ml eiskaltem Zelle Speichermedieneiner OD ₆₀₀ von 100 zu erreichen.
13. 20 ul Aliquot der Zellen für die Lagerung bei -70 ° C.

2. Entfernen Fehlalarme aus der Metagenom-Bibliothek

1. Auftauen Lager metagenomic Bibliothekszellen (aus Schritt 1.13), die Metagenom-DNA Fosmid und pGESS (E135K) auf Eis.
2. Beimpfen von 10 & mgr; l der Zellen in 2 ml LB, enthaltend 50 ug / ml Ampicillin und 12,5 ug / ml Chloramphenicol in einem 14-ml-Rundbodenröhrchen. bei 37 ° C inkubieren, bei 200 rpm für 4 Stunden unter Schütteln.
3. Inzwischen schalten Sie die FACS-Maschine und öffnen Sie die Standard-FACS-Software. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Düsenspitze Durchmesser, 70 & mgr; m; Forward Scatter Area (FSC-A) Empfindlichkeit, 300 V-logarithmische Verstärkung; Side Scatter Area (SSC-A) Empfindlichkeit, 350 V-logarithmische Verstärkung; Fluoresceinisothiocyanat Area (FITC-A) Empfindlichkeit, 450 V-logarithmische Verstärkung; Schwellenparameter, FSC-A-Wert 5.
   Hinweis: Typische Einstellungen gegeben sindfür die FACS - Gerät in der Tabelle der Materialien erwähnt. Passen Sie die Einstellungen für andere FACS-Geräte.
4. Verdünne die metagenomic Bibliothekszellen aus Schritt 2.2 durch Zugabe von 5 ul der Probe auf eine 5-ml-Rundbodenröhrchen mit 1 ml PBS.
5. Legen Sie die verdünnte Bibliothek Probe auf die Ladeöffnung des FACS Gerät und klicken Sie auf die Schaltfläche Laden auf dem Acquisition Armaturenbrett des FACS-Software.
6. Stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 - 1.500 Veranstaltungen / sec durch Klicken und die Durchflussrate auf dem Armaturenbrett zu steuern.
7. Erstellen Sie log skaliert FSC-A vs. Protokoll auf einem globalen Arbeitsblatt SSC-Streudiagramm skaliert durch Klicken auf die Dot Plot - Schaltfläche in der Werkzeugleiste. Stellen Sie die Streu Gate R1 die Singulett-Ereignisse (Bakterienpopulation) mit dem Polygon-Tor-Taste in der Werkzeugleiste zu umfassen.
8. Plot ein Histogramm mit Zellzahl gegen log auf dem Arbeitsblatt FITC-A skaliert durch einen Klick auf Histogramm - Taste. Dann stellen Sie die FITC Spannung von der Cytometer Register Einstellungen auf Inspektorfenster steuern, dass die Spitze der glockenförmigen Verteilung von weniger als 10 ² von FITC-A ist.
9. Erstellen Sie ein Protokoll skaliert FSC-A vs. das Protokoll FITC-A Plot, indem Sie auf dem globalen Arbeitsblatt auf dem Dot Plot-Schaltfläche klicken. Stellen Sie eine Sortier Tor R2 auf dem Grundstück das Polygon-Gate-Button in der Werkzeugleiste, so dass das Tor zwischen + 5% und -5% Zellen, die aus der Mitte der Verteilung (insgesamt 10% der Zellen rund um den Gipfel des glocken befindet förmige Kurve).
10. Legen Sie eine Sammelröhrchen , das 1,2 ml LB sowohl die R1 und R2 Tore befriedigend 50 ug / ml Ampicillin und 12,5 ug / ml Chloramphenicol am Ausgang des FACS Instrument und sortieren 10 ⁶ Zellen enthält.
11. Entfernen Sie die Sammelröhrchen, Kappe und sanft Wirbel.

3. metagenomische Enzymscreening

1. Inkubieren der sortierten Zellen (aus Schritt 2.11) bei 37 ° C mit 200 Umdrehungen pro Minute , bis die OD ₆₀₀ 0,5 Schütteln erreicht.
2. 1 & mgr; l Induktions Lösung Kopieren Sie die intrazelluläre Fosmid Kopienzahl zu verstärken. Inkubieren der Zellen für weitere 3 h bei 37 ° C mit Schütteln bei 250 Upm.
3. Zur Herstellung von Zellen für die Sortierung, 0,5 ml der kultivierten Zellen hinzuzufügen und ein geeignetes Substrat (p - Nitrophenyl Acetat, p - Nitrophenyl-β-D-cellobiosid oder Phenylphosphat) in einen 14-ml - Rundbodenrohr in einer Endkonzentration von 100 uM.
   1. Für eine Kontrollprobe mit 0,5 ml der kultivierten Zellen aus Schritt 3.2 in einen 14-ml-Rundbodenrohr. Füge das gleiche Volumen an PBS als das Substratvolumen in Schritt 3.3.
4. Inkubieren der zwei Proben bei 37 ° C mit bei 200 Upm für 3 h schütteln.
5. Inzwischen bereiten die FACS-Maschine mit den gleichen Konfigurationen wie Schritt 2.3.
6. Zugabe von 5 & mgr; l der Zellen (für die Sortierung) und Kontrollzellen zu zwei 5 ml-Rundbodenröhrchen mit 1 ml PBS, respectively.
7. Das Röhrchen enthält Kontrollzellen auf ter Verladehafen der FACS, und klicken Sie auf die Schaltfläche Laden auf Acquisition Armaturenbrett des FACS-Software. Stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 - 3.000 Veranstaltungen / sec durch auf dem Armaturenbrett Flow Rate Tasten steuern.
8. Erstellen Sie log skaliert FSC-A gegen log SSC-A skaliert Streudiagramm mit einem Klick auf Dot Plot - Taste auf dem globalen Arbeitsblatt der Software und stellen Sie die Streu Gate R1 die Singulett - Ereignisse (Bakterienpopulation) mit dem Polygon - Tor - Taste auf das zu umfassen Werkzeugleiste.
9. Erstellen Sie log skaliert FSC-A gegen log FITC-A skaliert Streudiagramm , indem Sie auf dem Arbeitsblatt auf dem Dot Plot Schaltfläche klicken und stellen Sie eine Sortier Gate R2 auf dem Grundstück mit dem Polygon - Tor - Taste auf der Werkzeugleiste , so dass weniger als 0,1% negative Zellen sind innerhalb des R2-Gatter erkannt.
10. Bringen Sie die Steuerprobenröhrchen mit dem Sortierprobenröhrchen und stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 - 3.000 Veranstaltungen / s durch die Strömungsgeschwindigkeit Tasten am Armaturenbrett steuern.
11. Legen Sie eine Sammelröhrchen, das 0,5ml LB am Auslass des FACS - Instrument und aussortieren 10 ⁴ Zellen erfüllt sowohl die R1 und R2 Gattern.
    Hinweis: Das Sortierkriterium von oben 0,1% bis 5% des FITC-A in der R2 Gate reichen kann. In diesem Protokoll wurden obersten 1% Zellen als positive gesammelt.
12. Entfernen Sie die Sammelröhrchen, Kappe und sanft Wirbel.
13. Verbreiten Sie die 0,5 ml gesammelten Proben auf zwei Agarplatten (90 mm Petrischalen) mit LB, 50 ug / ml Ampicillin, 12,5 ug / ml Chloramphenicol und Inkubation über Nacht die Platte bei 37 ° C.
14. Falls erforderlich, zusätzliche Runden der Sortierung für FITC-A-Anreicherung durch Wiederholen der Schritte 3,1-3,14.

4. Hit Auswahl und Enzymaktivität Bestätigung

1. Durchflusszytometrie-Analyse
   1. Von der Platte inkubiert bei Schritt 3.14, wählen Sie eine Kolonie zeigen keine Fluoreszenz eine Kolonie-Picker unter der Beobachtung von 488 nm Wellenlänge einer LED-Beleuchtung verwendet wird.
   2. Impfen der ausgewählten Kolonie in einem 14-ml-round Boden - Röhrchen mit 2 ml LB unter Schütteln bei 200 rpm 50 & mgr; g / ml Ampicillin und 12,5 ug / ml Chloramphenicol bei 37 ° C , enthaltend bis zu dessen OD ₆₀₀ 0,5 erreicht.
   3. In 2 ul Induktions Lösung Kopieren Sie die intrazelluläre Fosmid Kopienzahl zu verstärken. Inkubieren der Zellen für weitere 3 h bei 37 ° C mit Schütteln bei 250 Upm.
   4. Bereiten Sie eine 14 ml-Rundbodenrohr und 1 ml der kultivierten Zellen (Schritt 4.1.3). Hinzufügen eines geeigneten Substrats (p - Nitrophenyl Acetat, p -nitrophenyl- β -D-cellobiosid, oder Phenyl phosphat) in einer Endkonzentration von 100 uM.
      1. Zur Kontrolle, fügen Sie die 1 ml kultivierten Zellen aus Schritt 4.1.3 in einem 14 ml-Rundbodenrohr und das gleiche Volumen an PBS als Substrat Volumen in Schritt 4.1.4 hinzuzufügen.
   5. Inkubieren der zwei Proben bei 37 ° C mit bei 200 Upm für 3 h schütteln.
   6. Inzwischen bereiten die FACS-Maschine mit den gleichen Konfigurationen wie Schritt 2.3.
   7. Werden 5 ul der Kontrolle und Substrat behandelten Zellen zu 5 ml Rundbodenröhrchen mit 1 ml PBS, respectively.
   8. Legen Sie die Röhrchen mit Kontrollzellen auf dem Ladeanschluss des FACS-Gerät und klicken Sie auf die Schaltfläche Laden auf Acquisition Armaturenbrett des FACS-Software. Stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 - 3.000 Veranstaltungen / s unter Verwendung von Flow Rate Tasten auf dem Armaturenbrett.
   9. Klicken Sie auf Acquisition Taste FITC-A zu messen.
   10. Bringen Sie die Steuerprobenröhrchen mit dem Substrat behandelt Probenröhrchen. Stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 - 3.000 Veranstaltungen / s unter Verwendung von Flow Rate Tasten auf dem Armaturenbrett.
   11. Klicken Sie auf Acquisition Taste FITC-A zu messen.
   12. Vergleichen der Fluoreszenz der beiden Gruppen von Zellen durch ein Histogramm der Zellzahl aufgetragen gegen den log FITC-A skaliert.
2. Andere Tests Enzymaktivität zu bestätigen
   1. Zur weiteren Identifizierung der Enzymkandidaten ausgewählt, extrahieren Fosmid DNA-Standard Extraktion Pro mitverfahren aus den handelsüblichen Extraktions Kits und die Nukleotidsequenz zu analysieren, oder das Enzym in vitro Aktivität getestet ^6,7.

Results

Die drei phenolischen Substrate wurden untersucht, um neue metagenomic Enzyme aus einer Metagenom Bibliothek von Ozean-Wattsedimente in Taean, Südkorea identifizieren durch das vorgeschlagene Protokoll folgen. Für die Bibliothekskonstruktion, durchschnittlich 30 bis 40 kb Metagenoms Sequenzen wurden in Fosmide eingeführt, die auf dem E. beruhen coli F - Faktor Replikon und als eine einzige Kopie in einer Zelle dargestellt. Beachten Sie, dass Fosmide haben zur Konstrukti...

Discussion

Eine Erhöhung der Produktionseffizienz von Biokatalysatoren ist ein Schlüssel für den Erfolg von bio-chemischen Industrie Basis ⁹ und Metagenom gilt als einer der besten natürlichen Enzymquelle. In diesem Sinne ist es wichtig , neue Enzyme aus der Metagenoms Screening wo die Mehrheit der genetischen Ressourcen ¹⁰ nicht erforscht. Mehrere Screening - Verfahren entwickelt worden , die Enzymprodukte unter Verwendung von Transkriptionsaktivatoren ^{11, 12} , aber diese Techniken erfordern spezi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CopyControl	Epicentre	CCFOS110	Produktionskit für Fosmid-Bibliotheken
CopyControl Induktionslösung	Epizentrum	CCIS125	Fosmid Kopierinduktionslösung
EPI300	Epizentrum	EC300110	Elektrokompetente Zelle
pCC1FOS	Epizentrum	CCFOS110	Fosmid-Vektor
Gene Pulser Mxcell	Bio-Rad		Elektroporationsküvette und Elektroporatsystem
FACSAria III	Becton Dickinson		Durchflusszytometrie (FACS-Gerät)
AZ100M	Nikon		Mikroskop
UltraSlim	Maöstrogen		LED-Strahler
50 ml konisches Röhrchen	BD Falcon
14 ml Röhrchen mit rundem Boden	BD Falcon
5-ml-Tube mit rundem Boden	BD Falcon
p-Nitrophenylphosphat	Sigma-Aldrich	N7653	Substrat
p-nitrophenyl β-D-Cellobiosid	Sigma-Aldrich	N5759	Substrat
p-nitrophenylbutylat	Sigma-Aldrich	N9876& nbsp;	Substrat
Luria-Bertani (LB)	BD Difco	244620	Trypton 10 g/L, Hefeextrakt 5 g/L, Natriumchlorid 10 g/L
Super Optimal Brühe (SOB)	BD Difco	244310	Trypton 20 g/L, Hefeextrakt 5 g/L, Natriumchlorid 0,5 g/L, Magnesiumsulfat 2,4 g/L, Kaliumchlorid 186 mg/L
Super Optimale Brühe mit Katabolit-Repression (SOC)		SOB, 0,4 % Glukose
2x Hefeextrakt Trypton (2xYT)	BD Difco	244020	Pankreasverdau von Casein 16 g/L, Hefeextrakt 10 g/L, Hefeextrakt 5 g/L
Zellspeichermedien			2x YT Brühe, 15% Glycerin, 2% Glucose
pGESS(E135K)			Ein DNA-Vektor, der dmpR, egfp-Gene mit ihren entsprechenden Promotoren, RBS und Terminator enthält. Siehe die Referenz 5 im Manuskript für mehr Details.
Chloramphenicol	Sigma	C0378
Ampicillin	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		Durchflusszytometrie Softwareversion 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0,8 % NaCl, 0,02 % KCl, 0,0144 % Na2HPO4, 0,024 % KH2OP4, pH 7,4