Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Anreicherung von Thymusepithelzellen (TECs) mit einem Dichtegradienten für die FACS-Isolierung. Es zeigt auch die Verwendung von EAK16-II/EAKIIH6-Peptiden zur Förderung der TEC-Aggregatbildung. Die Mikroumgebungen des Hydrogels EAK16-II/EAKIIH6 bieten die 3-D-Konfiguration, die zur Aufrechterhaltung des Überlebens und der Funktion der TECs erforderlich ist.
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Methodenartikel
Die Förderung der 3-D-Aggregation von FACS Purified Thymusepithelzellen mit EAK 16-II / EAKIIH6 Selbstaufbau Hydrogels
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Thymusinvolution, die mit Alterung oder pathologischen Beleidigungen verbunden ist, führt zu einer verminderten Produktion reifer T-Zellen. Die Wiederherstellung der Funktion eines versagenden Thymus ist entscheidend für die Aufrechterhaltung einer effektiven T-Zell-vermittelten erworbenen Immunantwort gegen eindringende Krankheitserreger. Die Regeneration und Revitalisierung des Thymus erwies sich jedoch als schwierig, vor allem aufgrund der Schwierigkeiten, die einzigartige 3D-Mikroumgebung des Thymusstromas zu reproduzieren, die für das Überleben und die Funktion der Thymusepithelzellen (TECs) entscheidend ist. Wir haben ein neuartiges Hydrogelsystem entwickelt, um die Bildung von TEC-Aggregaten zu fördern, basierend auf der selbstorganisierenden Eigenschaft der amphiphilen EAK16-II-Oligopeptide und ihres histidinylierten Analogons EAKIIH6. TECs wurden aus isolierten Thymuszellen mit Dichtegradienten angereichert, mit Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) sortiert und mit Anti-Epithelzelladhäsionsmolekülen (EpCAM) markiert, die zusammen mit Anti-His-IgGs an den A/G-Adapterkomplexen des Proteins verankert waren. Die Bildung von Zellaggregaten wurde durch Inkubation von TECs mit EAKIIH6- und EAK16-II-Oligopeptiden und dann durch Erhöhung der Ionenkonzentration des Mediums gefördert, um die Gelierung einzuleiten. TEC-Aggregate, die in EAK-Hydrogel eingebettet sind, können die Entwicklung funktioneller T-Zellen in vivo effektiv fördern, wenn sie in athyme Nacktmäuse transplantiert werden.
Einleitung
Der Thymus ist die primäre lymphoiden Organ für die Erzeugung einer vielfältigen Population von pathogen-reaktives, selbst tolerant T-Zellen, die für die Funktion des erworbenen Immunsystems wesentlich ist. Es ist ein dynamisches Organ, in dem die Entwicklung Thymozyten aus dem Knochenmark als Lymphozyten-Vorläuferzellen immigrierte, wandern durch die schwammartige dreidimensionale (3-D) Matrix des Thymus-Stroma, durchlaufen abstammungs Spezifizierung und Differenzierung, und schließlich auswandern als reifen T-Zellen. Der Erfolg dieses gut programmiert Verfahren hängt weitgehend von der Kreuzkopplung zwischen den wandernden Thymozyten und den Wohn Thymus-Epithelzell....
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Protokoll
Alle Tiere in den Experimenten verwendet wurden in der Tierhaltung bei Allegheny-Singer Research Institute im Rahmen des Protokolls überprüft und genehmigt von der Institutional Animal Care und Use Committee des Allegheny Health Network / Allegheny Singer Research Institute untergebracht.
1. Verdauen des Thymus mit Kollagenase
- Ernte Thymusdrüse.
- Euthanize 3-5 Wochen alte C57BL6 / J - Mäusen in einem Kohlendioxid (CO 2) Kammer Thymusdrüse zu ernten. Im Einzelnen stellen die Mäuse in der Kammer unter CO 2 Induktion für 3-5 min und Tod bestätigen durch Herz- oder Atemstillstand zu überprüfen.
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Ergebnisse
Um die Wirksamkeit der Verwendung der Dichtegradiententrennung Protokoll untersuchen die CD45- Stromazellen zu bereichern, geerntete Zellen, sowohl von der Oberfläche und den ausgefällten Lymphozyten Pellets wurden mit anti-CD45 und anti-EpCAM-Antikörper. Sowohl anti-Ulex Europaeus Agglutinin 1 (UEA1) und Anti-MHC-Klasse II-Antikörper wurden auch in der Färbungs Cocktail aufgenommen, um die cTEC und mTEC Untergruppen identifizieren. Wie in Abbildung 1 gezeigt, konnten wi.......
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Diskussion
Während TECs die vorherrschende Bevölkerung der Thymus-Stroma und spielen eine entscheidende Rolle für die Struktur und Funktion der Thymusdrüse sind, repräsentieren sie nur etwa 0,1-0,5% des gesamten Thymus Zellularität. Sie sind auch zerbrechlich Zellen als hohe Anteile an Zelltod werden gelegentlich folgenden Kollagenaseverdau beobachtet, dh die Behandlung TECs aus der extrazellulären Matrix (ECM) zu dissoziieren. Ihre Seltenheit (~ 200.000 pro Maus Thymus) und Zerbrechlichkeit machte es eine anspruchsvolle .......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health gewährt R21 AI113000 (WSM) und R01 AI123392 (YF) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallone) | Ethanol 200 Proof, deionisiertes Wasser |
| Präparierschere, gerade | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Graefe Zange, gerade | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Graefe Pinzette, gebogen | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Waschlösung | 1x PBS, 0,1% BSA, 2 mM EDTA | ||
| 1x PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (Rinderserumalbumin) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Aufschlusslösung | 9 ml RPMI-1640, 0,025 mg/ml Liberase TM Forschungsqualität, 10 mM HEPES, 0,2 mg/ml DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | wird als "gereinigte Kollagenase" |
| bezeichnet1 M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50 ml Zentrifugenröhrchen | Corning | 430290 | |
| 60 mm Gewebekulturschale | Falcon | 353002 | |
| 1/2 cc U-100 Insulinspritze 28 1/2 G | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5 ml Polystyrol-Tube mit rundem Boden | Falcon | 352058 | |
| 5 ml Glaspipette | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Zum Spülen der Thymusfragmente verwenden. Thymusfragmente neigen dazu, mit Plastikpipetten an der Wand zu kleben. |
| MACSmix Rohrrotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100 &Mikro; m Zellsieb | Falcon | 352360 | |
| Dichtegradient mittel: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Cell Sorting | |||
| 5 ml Polypropylen-Tube mit rundem Boden | Falcon | 352063 | |
| Anti-Maus CD16/CD32 (Fc-Block) | BD Biosciences | 553142 | Verwendung als unverdünnt, 2 &Mikro; l pro Probe |
| Anti-Maus CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Verwendung bei 1:150, 10 &Mikro; l pro Probe |
| Anti-Maus CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Verwendung bei 1:100, 10 &Mikro; l pro Probe |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| Einzelzellanalyse-Software | FlowJo | ||
| EAK Gel Assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Gereinigtes Anti-Maus-CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202"anti-EpCAM IgG" | |
| Rekombinantes Protein A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1,5 ml Safe-Lock Tuben, Biopur, steril | Fisher Healthcare | 05-402-24B | bezeichnet als "1.5 ml Mikrozentrifugenröhrchen " |
| 96-Well, Gewebekulturplatte, runder Boden mit niedrigem Verdampfungsdeckel | BD Falcon | 353917 | |
| Schaukelplattform: Nutator Mischer Nr. 1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% Saccharose | Sigma | S0389 | Vorbereiten mit sterilem destilliertem Wasser |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company& nbsp; | kundenspezifisch synthetisiert, 10 mg/ml | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | kundenspezifisch synthetisiert, 7,5 mg/ml | |
| Vollständiges Medium | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-Glutamin, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 &Mikro; M 2-Mercaptoethanol | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fötales Rinderserum) | Atlanta Biologicals | S11150 | Vor Gebrauch bei Hitze inaktiviert |
| Stift/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-Glutamin 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (nicht-essentielle Aminosäure) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1 M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100x) | Millipore | ES-007-E | |
| Plattformschüttler: Die Bauchtänzerin | Stovall Life Sciences Inc. | Modell: USBDbo |
Referenzen
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insuli....
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Nachdrucke und Genehmigungen
