Methodenartikel

Schnelle Überprüfung von Terminatoren Mit PGR-Blau Plasmide und Golden Gate Assembly

DOI:

10.3791/54064

⸱

25. April 2016

 ,  , 
1Department of Biology, Ouachita Baptist University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll verwendet die Golden Gate Assembly und das Plasmid pGR-blue, um die Stärke von in silico gefundenen Terminatoren schnell zu quantifizieren.

Zusammenfassung

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Das Ziel dieses Protokolls ist es, die schnelle Verifizierung von bioinformatisch identifizierten Terminatoren zu ermöglichen. Darüber hinaus wurde das Plasmid (pGR-Blue) speziell für dieses Protokoll entwickelt und ermöglicht die Quantifizierung der Terminatoreffizienz. Als Proof of Concept wurden sechs Terminatoren im Mykobakteriophagen Bernal13 bioinformatisch identifiziert. Nach der Identifizierung wurden die Terminatoren als Oligonukleotide mit den entsprechenden klebrigen Enden hergestellt und zusammen geglüht. Mit Hilfe der Golden Gate Assembly (GGA) wurden dann Terminatoren in pGR-Blue geklont. Unter sichtbarem Licht erscheinen falsch positive Kolonien blau und positiv transformierte Kolonien sind weiß/gelb. Nach Induktion eines induzierbaren Arabinose-Promotors (pBad) mit Arabinose kann die Koloniestärke bestimmt werden, indem das Verhältnis des produzierten grün fluoreszierenden Proteins (GFP) zum produzierten roten fluoreszierenden Protein (RFP) gemessen wird. Mit pGR-Blue kann das Protokoll in nur drei Tagen abgeschlossen werden und ist ideal für ein Bildungsumfeld. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, dass dieses Protokoll nützlich ist, um in silico Vorhersagen der Terminatoreffizienz im Zusammenhang mit der Regulation der Transkription zu verstehen.

Einleitung

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Große Projekte in der synthetischen Biologie erfordern die Verwendung von hochwirksamen Transkriptionsterminatoren, um die Genexpression zu regulieren. Die Identifizierung neuartiger Terminatoren erfordert eine bioinformatische Analyse neuartiger Genome. Da jedoch immer mehr bioinformatische Software entwickelt wird, die jeweils einen einzigartigen Algorithmus für die Vorhersage verwendet, kommt es zu mehr Diskrepanz zwischen den mutmaßlichen Ergebnissen. Da dieser Prozess etwas subjektiv ist und in silico durchgeführt wird, müssen diese Vorhersagen biologisch bestätigt werden. 1 Darüber hinaus erfordert das Volumen der durch In-silico-Analyse identifizierten mutmaßlichen Terminatoren den Einsatz von Klonierungsstrategien, die in einem relativ kurzen Zeitrahmen abgeschlossen werden können.

Das PGR-Blue-Plasmid ist eine Modifikation des PGR-Plasmids, das neu gestaltet wurde, um die Golden Gate Assembly (GGA) zu verwenden, um das Klonierungsverfahren zu vereinfachen, indem es ermöglicht, dass alle Reaktionsschritte gleichzeitig in einem Mikrozentrifugenröhrchen durchgeführt werden können. 2,3 Die Farbselektion wurde in das Plasmid integriert, um die Identifizierung positiver Kolonien zu erleichtern. Eine erfolgreiche Ligation sollte im sichtbaren Licht weiß/gelb sein und unter blauem (450 nm) oder ultraviolettem (UV) Licht grün fluoreszieren, wenn sie auf Platten mit Arabinose gezüchtet wird. Da ungeschnittenes pGR-Blau ein blaues Chromo-Protein (amilCP) enthält, sind Kolonien, die ein unmodifiziertes Plasmid enthalten, unter sichtbarem Licht blau. Diese Vereinfachung zusammen mit dem optimierten Protokoll ermöglicht es den Forschern, innerhalb von drei bis vier Tagen von der bioinformatischen Identifizierung zur biologischen Bestätigung zu gelangen. Die Designnatur dieses Systems kann sowohl im Forschungslabor als auch im Bildungsbereich von Vorteil sein.

Das pGR-Blue-Plasmid ermöglicht die Quantifizierung der Terminatorstärke. 4 Ein einzelner induzierbarer Arabinose-Promotor wird zur Herstellung von grün fluoreszierendem Protein (GFP) und rotem fluoreszierendem Protein (RFP) verwendet. Der Terminator wird nach der GFP-Sequenz, aber vor der RFP-Sequenz in das Plasmid kloniert, wodurch die Transkription des RFP-Proteins gestoppt wird. Die Stärke des Abschlusswiderstands wird durch das Verhältnis von erzeugtem GFP zu erzeugtem RFP bestimmt.

Der Bericht Vision and Change5 schlug vor, dass die Ausbildung in den Bereichen Mathematik, Informatik, Naturwissenschaften und Technik (MINT) forschungsbasierte Erfahrungen in den Unterricht integriert. 6 Dies erfordert jedoch die Entwicklung von Protokollen, die von Studierenden mit begrenzten Fähigkeiten in einem definierten Zeitrahmen durchgeführt werden können. Während das Protokoll in nur drei Tagen durchgeführt werden kann, wurde es auch so konzipiert, dass jeder wichtige Schritt in einer separaten wöchentlichen (2-3 Stunden) Laborperiode durchgeführt werden kann, um eine Course Research Experience (CRE) zu erstellen. Auf diese Weise dauert das Verfahren zwischen drei und sechs Wochen und eignet sich sowohl für Einführungs- als auch für Aufbaukurse in Genetik, Zellbiologie oder Bioinformatik.

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Protokoll

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1. Planung und Bestellung von Oligonucleotiden mit den entsprechenden Sticky Ends

  1. Identifizieren Sie potenzielle rho-unabhängige Terminatoren durch genomische Analyse Programme , die online frei verfügbar sind. 7
  2. Wenn sie mit doppelsträngiger DNA arbeiten, bestimmen die Orientierung des Terminators zu testen. 7 PGR-Blue - Plasmid nur Abbrechern in der 5 'zu 3' - Richtung auf der Oberseite (Vorwärtsstrang) ligiert prüft.
    1. Konvertieren Sie einen Boden (rückwärts) Strang Terminator seine umgekehrt Komplement der Sequenz zum Testen in pGR-Blau mit dem kostenlosen Online - Software neu zu orientieren, zum Beispiel ApE.
  3. Nachdem die Ausrichtung bestimmt wird, korrekt zu sein, fügen Sie das sticky end "5'-CGAC-3 '" an das 5'-Ende des oberen Stranges. Fügen Sie das sticky end "5'-CCGC-3 '" an das 5' - Ende des unteren Strang. 8 Dadurch wird sichergestellt , dass ligierte Insert wird in den entsprechenden eingefügt werdenmit GGA Orientierung.
  4. Sobald Sequenzen bestimmt werden, zu bestellen im Handel als Einzelstrang-Oligonukleotiden.

2. Ausglühen Oligonucleotides (Gilt nur für gefriergetrocknete DNA)

  1. Re-suspendieren einzelnen Oligonukleotide in Nuklease freiem Wasser zu einer Konzentration von 100 uM.
  2. Machen 10x Annealing-Puffer: 1 M NaCl und 100 mM Tris-HCl pH 7,4. Annealing-Puffer kann bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden. Sobald Anelierungspuffer hergestellt und Oligonukleotide erneut suspendiert sind, beginnen die Glühen 8.
  3. Für jeden Terminator getestet werden, 16 & mgr; l ultrareinem Wasser in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen hinzufügen.
  4. Fügen Sie 2 ul 10 fach Anelierungspuffer zu jedem Reaktionsgefäß.
  5. 1 ul des Obertrums Oligonukleotid (100 uM) von dem gewünschten Terminator.
  6. 1 ul des Untertrums Oligonukleotid (100 uM) von dem gewünschten Terminator.
  7. Erstellen eines Siedewasser-bath unter Verwendung von auf einer heißen Platte einen 1000-ml-Becher etwa 400 ml Leitungswasser und Ort enthalten.
  8. Legen Sie die Reaktionsgefäße aus Schritt 2.6 in einem Schwimmer und kochen für 4 min. Nach 4 min, drehen Sie die Heizplatte aber lassen Sie das Rohr und schweben im Wasserbad langsam abkühlen O / N (18 h) 8 ab. Speichern der geglühten Terminatoren bei -20 ° C.

3. Golden Gate Assembly (Standard Mix - Cost Efficient)

  1. Machen Sie eine 40 nM Verdünnung der angelagerten Terminatoren. In 124 ul Nuklease freiem Wasser auf 1 ul geglüht Terminatoren-Mix (100 & mgr; M).
    1. Zentrifugieren Sie die Proben für 30 Sekunden bei 10.000 × g und auf Eis lagern.
  2. In ein neues Röhrchen geeignet für den Thermocycler verwendet werden, fügen Sie 6 ul Nuclease freies Wasser.
  3. 1 & mgr; l handelsüblichen DNA - Ligasepuffer [300 mM Tris-HCl (pH 7,7-7,8), 100 mM MgCl 2, 100 mM DTT und 10 mM ATP]. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte auf dem Eis.
  4. Hinzufügen1 ul PGR-Blue (35-50 ng / ul) Ziel Plasmid mit dem Reaktionsgefäß.
  5. 1 & mgr; l der 40 nM geglühten Terminatoren an den Mikrozentrifugenröhrchen.
  6. In 0,5 ul kommerziellen High-Fidelity-BsaI Restriktionsendonuklease zum Reaktionsgefäß.
  7. In 0,5 ul kommerzieller DNA-Ligase an das Reaktionsgefäß.
  8. Zentrifugieren der Reaktionsmischung bei 10.000 × g für 120 Sekunden. Dann legen Sie den Schlauch direkt in den Thermocycler.
  9. Führen Sie die Thermocycler-Programm: 20 Zyklen von 1 min bei 37 ° C, gefolgt von 1 min bei 16 ° C, gefolgt von 1 Zyklus von 15 min bei 37 ° C. Verwenden Proben sofort oder einfrieren und bei -20 ° C. 8

4. Golden Gate Assembly (Commercial Master Mix - Zeit Efficient)

  1. In 124 ul nukleasefreiem Wasser zu 1 & mgr; l der 100 & mgr; M Terminatoren in Schritt erstellt geglüht 2. Dies schwächt die Terminator-DNA-Konzentration auf 40 nM.Führen Sie diesen Schritt in einem neuen, markierten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. In ein neues Röhrchen geeignet für den Thermocycler, fügen Sie 14 ul Nuklease freiem Wasser. Stellen Sie sicher, dass das neue Rohr entsprechend markiert ist.
  3. In 2 ul Gewerbe Master Mix Puffer zum Reaktionsgefäß.
  4. 1 ul PGR-Blau-Plasmid (35-50 ng / ul) zum Reaktionsgefäß.
  5. In 2 ul der 40 nM geglühten Terminatoren an den Mikrozentrifugenröhrchen.
  6. 1 & mgr; l Gewerbe Master Mix zum Reaktionsgefäß.
  7. Zentrifugieren Sie die 40 nM Röhrchen bei 10.000 × g für 120 Sekunden. Dann legen Sie den Schlauch direkt in den Thermocycler.
  8. Führen Sie die Thermocycler-Programm: 1 Zyklus von 60 min bei 37 ° C von 1 Zyklus von 15 min bei 55 ° C gefolgt. Verwenden Proben sofort oder einfrieren und bei -20 ° C.

5. Transformation und Kolonieselektion

  1. Bereiten Sie Luria Base (LB) Agar-Petrischalen mit 1 mM Konzentration Ampicillin (Amp) und eine 10 mM Konzentration von Arabinose (ARB). Bereiten Sie mindestens 10 ml 1 M L -Arabinose Stammlösung , da diese Stammlösung wird in späteren Schritten verwendet werden.
  2. Verwenden Sie einen hocheffizienten (10. August - 10. SEPTEMBER Transformanten / ug) chemisch kompetente E. coli (JM109) Zellen für die Transformation. 9 Für die besten Ergebnisse, 3-5 ul der Ligationsreaktion zu 50 ul kompetente Zellen hinzuzufügen. Wenn chemische kompetente Zellen verwenden, befolgen Sie die Transformationsprotokoll spezifisch für die Zellen verwendet wird.
  3. Die Hälfte (25 ul) der transformierten Zellen auf vorgewärmte LB (Amp / arb) Agarplatten einer sterilen L-förmigen "Hockeyschläger" mit und Inkubation O / N bei 37 ° C. Aufgrund der schnellen Geschwindigkeit der Zersetzung des Ampicillin, nicht inkubieren nicht über 24 h bei 37 ° C.
  4. Führen Kolonieselektion basierend auf Farbe durch visuelle Inspektion. Eine erfolgreiche Unterbindung sollte weiß / gelb in sichtbares Licht und fluoresziert grün under Blau (450 nm) oder UV-Licht. Ein erfolgloser Ligatur wird eine Kolonie produzieren, die nach 18 in Farbe unter sichtbarem Licht blau ist - 20 Stunden.

6. Überprüfung und Quantifizierung von Terminator

  1. Bereiten Sie 5 ml sterile LB-Brühe Röhrchen mit 1 mM Ampicillin und 10 mM Arabinose. Die Anzahl der Rohre erforderlich ist, ist abhängig von der Anzahl der Terminatoren getestet und Kontrollen (Zellen, die mit Ampicillin-Resistenz, die fluoreszieren, und die Zellen nicht den ungeschnittenen pGR Blau Plasmid enthält) wird.
  2. Unter sichtbarem Licht wählen Sie eine sterile Schleife mit 2-3 weiß / gelb Kolonien (Schritt 5.4). Lassen Sie die Proben bei 37 ° C und 160 rpm für 16-18 h in Brühen auf einem Schüttler inkubiert. Sie brüten nicht diese Proben für mehr als 24 Stunden.
    1. Optional können ein Spektrophotometer optische Zelle Dichte bei 600 nm (OD 600) , um zu bestimmen ausreichende Zellwachstum zu gewährleisten. Im Allgemeinen wird ein OD 600 von ~ 0,8-1,0 nach 16-18 h des Wachstums beobachtet.
  3. Benutzeneine sterile 96-Well-Platte für die verbleibenden Schritte aus. Führen Sie diese Schritte in einer aseptischen Umgebung und in dreifacher Ausfertigung. In 199 ul sterilem LB + Amp / Arabinose Brühe (1 mM Ampicillin / 10 mM Arabinose) in jede Vertiefung. Fügen Sie Platz auf der Platte für drei separate Steuerungen.
    1. Verwenden Sie die folgenden drei Steuerelemente: Ein gut (1) mit LB + Amp / Arabinose Brühe nur und ein gut (2) für nicht-transformierten kompetenten Zellen (leer) als Rohling zu dienen. Für die Quantifizierung (3) des Terminators Stärke, ungeschnittene ursprüngliche pGR enthaltenden Zellen oder mit einem Gehalt pGR-Blau mit einer nicht abbrechenden Sequenz ligiert sollte (Referenzsteuerung für die Quantifizierung) einbezogen werden. Siehe Abbildung 1 für Plattenleser Layout.
  4. Pipette 1 ul der Zelllösung aus dem O / N Brühen in einzelne Wells der 96-Well-Platte.
  5. Dichtungsplatten mit einer atmungsfähigen Deckel und schütteln für 18-20 Stunden bei 37 ° C und 160 Umdrehungen pro Minute.
  6. Mit Hilfe eines Plattenlesegerät, bestimmen OD 600 durch LesenExtinktion bei 600 nm. Messen Sie GFP - Fluoreszenz wie folgt: Anregung 395 und Emission 509. Measure RFP Fluoreszenz wie folgt: Anregung 575 und Emission 605. Nach 18-20 h, die OD 600 sollte etwa 0,5 betragen.
  7. Um eine Veränderung der Wachstums normalisieren, verwenden Sie die Gleichung: figure-protocol-1 sowohl für GFP und RFP.
  8. Nach der Normalisierung, bestimmen die Gleichung relativ Terminator Stärke unter Verwendung von figure-protocol-2

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Ergebnisse

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Dieses Protokoll wird produzieren Zellen pGR-Blau mit einem Terminator ligiert zwischen GFP und RFP mit Golden Gate Assembly (Abbildung 2) enthält. Positive Kolonien ligierte Insert enthält, kann auf der Grundlage Farbe ausgewählt werden. Im sichtbaren Licht werden positive Kolonien weiß / gelb und Fehlalarme werden blaue Kolonien nach 18-20 h Inkubation bei 37 ° C (Abbildung 3) zu erzeugen.

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Diskussion

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Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die richtige Oligonukleotid-Design bis zur Bestellung vor. Die Oligonukleotide müssen die entsprechenden klebrigen Enden sowohl an die 5'-Enden der oberen und unteren hinzugefügt Stränge, um sicherzustellen, dass GGA Einbau möglich ist. Darüber hinaus ist es wichtig, die Ausrichtung von links mit Blick auf Terminatoren (Terminatoren, die Transkription auf dem Untertrum stoppen), die der rechten Verblendung (endet Transkription auf dem oberen Strang) Terminatoren weil GF...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Autoren möchten Malcom Campbell und Todd Eckdahl mit dem Genome Consortium for Active Teaching (GCAT) und dem HHMI-Science Education Alliance bestätigen - Phage Hunters Advancing Genomics und Evolutions Science (SEA-Phagen) Programm.

Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse aus dem National Center for Research Resources (P20RR016460) und dem National Institute of General Medical Sciences (P20GM103429) von den National Institutes of Health. Diese Forschung wurde teilweise von der National Science Foundation unter Gewährung # IIA-1457888 unterstützt. Zusätzlich institutionelle (Ouachita Baptist University) Mittel wurden durch die JD Patterson Summer Research Fellowship zur Verfügung gestellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
pGR-Blue PlasmidAddgene68374
pGR-PlasmidAddgene46002
AeraSeal-(Sterile Sheets)Excel ScientificBS-25Sterile Sheets nur
10x T4 DNA Ligase PufferNEB
BsaI-HFNEBR3535SDas Nicht-HF-Enzym funktioniert, ist aber weniger hitzestabil.
NEB Golden Gate Assembly MixNEBE1600SCommerial Master Mix, auf den im Protokoll Bezug genommen wird.
T4 DNA-LigaseNEBM0202S
Runde Mikrozentrifuge Floating RackNova Tech InternationalF18875-6401
Ampicillin-NatriumsalzSigma AldrichA9518
L-(+)-ArabinoseSigma AldrichA-3256D-Arabinose induziert den pBAD-Promotor Luria
Base (LB) - Brühe, MillerSigma AldrichL1900
Luria Base (LB) - Agar, MillerSigma AldrichL2025
Tecan-Infinite M200 Plate ReaderTecan
Mix & Go Competent Cells - Stamm JM109Zymo ResearchT3005Verwenden Sie das vom Unternehmen empfohlene Transformationsprotokoll
ApE: Eine Plasmid-Editor-Softwarehttp://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
Tris-HCl,PromegaH5121
Natriumchlorid in molekularer Qualität, (kristallin/biologisch, zertifiziert)Fisher ChemicalS671
Kommerzielle OligonukleotidsyntheseIntegrierte DNA-Technologien (IDT)http://www.idtdna.com/site
Mikrotest-Gewebekulturplatten - 96 Well (steril)Falcon35-3072
Mykobakteriophagen "Bernal13"GenbankKJ510413
Nukleasefreies WasserIntegrierte DNA-Technologien (IDT)IDT004
Steril, L-förmig Hockey-Stick CellLife Science Products6444-S1
Nano-Drop 2000c UV-Vis SpektrometerThermo Scientific2000c
ARNold: ein Web-Tool zur Vorhersage von Rho-unabhängigen Transkriptionsterminatoren.
http://rna.igmors.u-psud.fr/

Referenzen

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Schlagwörter

Terminator VerifizierungQuantifizierung der Terminator St rkebioinformatische Terminator IdentifizierungOligonukleotid AnnealingFluoreszenzverh ltnisanalyseKolonie FarbscreeningArabinose induzierbarer PromotorGFP RFP Normalisierung

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