Isolation und zelluläre Phänotypisierung von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet von Synovialflüssigkeit und Knochenmark von Minipigs

Zusammenfassung

Ein Protokoll zur Etablierung mesenchymaler Stammzellen (MSCs), die aus der Synovialflüssigkeit und dem Knochenmark von Minischweinen isoliert und nicht-invasiv mittels Spritzenaspiration entnommen wurden, wird vorgestellt. Die zelluläre Phänotypisierung wurde mittels Durchflusszytometrie nach Zellisolierung und in vitro Kultivierung von Knochenmark und Synovialflüssigkeiten, die aus MSCs gewonnen wurden, durchgeführt.

Zusammenfassung

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurden nach Isolierung aus verschiedenen Gewebequellen, einschließlich Knochenmark und Synovialflüssigkeit, etabliert. Kürzlich wurde berichtet, dass MSCs, die aus der Synovialflüssigkeit gewonnen werden, ein Differenzierungspotenzial für mehrere Linien und immunmodulatorische Merkmale aufweisen, was darauf hindeutet, dass diese Zellen für das Tissue Engineering und systemische Behandlungen verwendet werden können. In dieser Studie wird ein Protokoll für die einfache und nicht-invasive Isolierung von MSCs aus dem Knochenmark und der Synovialflüssigkeit von Minischweinen vorgestellt, um Zelloberflächenmarker für die Zellphänotypisierung und in vitro-Kultivierung zu analysieren. Mit Hilfe von geschlechtsreifen sechs Monate alten Minischweinen wurde mit einem Knochenmarkextraktor Knochenmark aus dem Beckenkammknochen entnommen und die Synovialflüssigkeit aus dem Femorotibialgelenk aspiriert. Die Verfahren zur Entnahme von Proben aus beiden Quellen waren nicht-invasiv. Es werden Protokolle für die wirksame Isolierung von MSC aus geernteten Zellquellen und für die Schaffung von In-vitro-Kulturbedingungen zur Erweiterung stabiler MSC aus Minischweinen und die Anwendung systemischer autologe Behandlungen bereitgestellt. Für die Zellphänotypisierung wurden die Zelloberflächenmarker beider Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. In den Ergebnissen wurden die MSCs aus der Synovialflüssigkeit der Minischweine isoliert und zeigten, dass MSCs, die aus der Synovialflüssigkeit stammen, eine ähnliche Morphologie und einen ähnlichen Zellphänotyp aufweisen wie MSCs aus dem Knochenmark. Daher ist nicht-invasiv gewonnene Synovialflüssigkeit eine wertvolle Quelle für MSCs.

Einleitung

Multipotente mesenchymale Stammzellen (MSCs) können in mesenchymale Zelllinien eingeteilt werden, und MSCs wurden aus verschiedenen Gewebequellen etabliert und isoliert, wie z.B. aus Knochenmark, Nabelschnüren, Plazenten, Fettgewebe, Hauthaut, Skelettmuskulatur, Haarfollikeln, Synovialmembranen und Zähnen^1-5. Gegenwärtig wurde die Aufmerksamkeit auf synoviale MSCs gelegt, da diese Zellen bei der Behandlung von Gelenkerkrankungen wie Knochenbruch, Osteoarthritis und rheumatoider Arthritis (RA) helfen können, und aufgrund des regenerativen Potenzials von MSCs in geschädigtem Knorpel oder Knochen können sie auch bei der Behandlung von Immunmodulation oder Autoimmunerkrankungen helfen^6-8. Bei der Mehrzahl der Forschungen zu MSCs, die aus synovialen Quellen stammen, wurden MSCs aus der Synovialmembran und nicht aus der Synovialflüssigkeit verwendet^2,9; daher ist das biologische Verständnis von MSCs, die aus der Synovialflüssigkeit stammen, begrenzt.

Synovialflüssigkeit ist eine leicht zugängliche Quelle für MSCs, die während der Diagnose oder Behandlung von Patienten und bei der diagnostischen Bestätigung verschiedener Arthritis-Erkrankungen, die keine invasiven Verfahren erfordern, wie Osteoarthritis oder RA, aspiriert werden kann. Die Population von MSCs aus Synovialflüssigkeit in der Synovialhöhle ist bei arthritischen Patienten im Vergleich zu nicht-arthritischen Patienten^{signifikant erhöht 10-12}. Daher ist die Synovialflüssigkeit ein ausgezeichneter Quellkandidat für MSCs, insbesondere für die autologe Stammzelltherapie bei Patienten mit entzündeten oder verletzten Gelenken. Darüber hinaus haben MSCs, die aus der Synovialflüssigkeit stammen, eine chondrogene Kapazität, Immunmodulationsfähigkeiten und eine hohe Proliferationsrate. In dieser Studie wurden Protokolle für die Knochenmarkextraktion und die Aspiration von Synovialflüssigkeit von Minischweinen mit nicht-invasiven Methoden sowie für die In-vitro-Expansion isolierter Zellen und die Analyse von Zellphänotypen etabliert.

Protokoll

Tierversuche wurden von der Animal Center for Biomedical Experimentation in Gyeongsang National University zugelassen.

1. Die Vorbereitungen für die Tierordnung

1. Bereiten Sie die erwachsenen weiblichen minipigs für die nicht-invasive Sammlung von MSCs aus dem Knochenmark und Gelenkflüssigkeit. Führen Sie die klinische Untersuchung der minipigs einen Tag vor der Anästhesie und Probenentnahme.
   1. Geben Sie klinisch unauffälligen Tiere für körperliche Untersuchungen, die Körpertemperatur, Atemfrequenz umfassen, und die Herzfrequenz und für die Beobachtung des Verhaltens der Schweine und hämatologischen Zustände, unter Verwendung von Blutbild-Tests.
      Hinweis: Parameter Intervalle für klinisch gesunden minipigs sind 11-29 / min für die Atmungsrate, 68-98 / min für die Herzfrequenz und 37-38 ° C für die Körpertemperatur.
2. Entfernen Sie alle essbaren Betten aus dem Käfig während der präoperativen Fastenzeit von 6 bis 12 Stunden Prior auf die Verabreichung von Narkose für junge und erwachsene minipigs, 3 Stunden Fasten sollte für die Neugeborenen beobachtet werden. Bieten Wasser bis zum Zeitpunkt der Anästhesie zu trinken.

2. Vorbereitung der Tiere für Anästhesie

1. Behandeln die minipigs vor der Verabreichung von Anästhesie mit Acepromazin (0,1 mg / kg), Medetomidin (0,03 mg / kg) und Atropin (0,04 mg / kg).
   1. Injizieren Sie alle Medikamente intramuskulär (IM) eine 21 G-Nadel mit einer Länge von mindestens 30 mm für erwachsene minipigs verwenden. Führen Sie die IM-Injektion 1-3 cm hinter dem Ohr in die seitliche zervikale Muskeln oder in den Oberschenkelmuskel.
      Hinweis: Führen Sie alle Prozeduren ohne Hervorrufen Angst oder Stress bei den Tieren oder erfordern grobe Behandlung, um sicher die Prämedikation injizieren.
2. Legen Sie die minipigs in einer dorsalen liegende Position.
3. Fünfzehn Minuten nach der Verabreichung der Prämedikation, initiieren Anästhesie mit 1,5% Isofluran Admintragene durch Einatmen.
   1. Weiterhin die Inhalation von Isofluran (1,5%) durch einen Endotrachealtubus, gefolgt von einer Erhöhung der Konzentration auf 2,5%, mit Sauerstoff (1,5 L / min) als Trägergas.
4. Kontinuierlich die Herzfrequenz zu überwachen, Körpertemperatur, und perkutane Blutsauerstoffsättigung (SpO ₂₎ der minipigs während der Narkose. Verwenden Sie eine zirkulierende Wasser Decke bei einer Temperatur von 38-39 ° C auf Körpertemperatur zu halten. Tragen Sie eine ophthalmologische Salbe, die Augen vor dem Austrocknen während der Narkose zu schützen.
5. Folgen Sie Guedel Klassifizierung der Narkosetiefe ¹³ zu bewerten.

3. Vorbereitung zur Zellisolierung und Kultivierung

1. Kultivieren der abgeleiteten MSCs aus dem Knochenmark und in der Synovialflüssigkeit, bereiten 500 ml fortgeschrittener Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (ADMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Glutamax, 10 ng / ml basischen Fibroblastenwachstums factor (bFGF) und 1,0% Penicillin-Streptomycin (10.000 IU bis 10.000 & mgr; g / ml bzw. Pen-Strep).
   1. Inkubieren ADMEM bei 38,5 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO ₂ in einem CO ₂ -Inkubator.
2. Bereiten 500 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) gemäß den Anweisungen des Herstellers für die Zelltrennung und Waschen.

4. Sammeln von Knochenmark aus dem Minipigs

1. Wählen Sie eine Fläche von etwa 15 x 15 cm in der Größe auf dem Beckenkamm (Abbildung 1), und entfernen Sie die Haare aus diesem Bereich unter Verwendung von sterilisierten Rasierapparate oder elektrische Haarschneidemaschine. Sobald die minipig positioniert ist, scheuern abwechselnd die Prozedur Seite dreimal mit folgenden Sterilisationsmittel: Povidon-Jod und 70% Ethanol. Nachdem der Bereich gründlich trocken ist, sterilen Tüchern.
2. Pre-coat der 10 ml Spritze, die mit 100 U / ml Heparin indem sie sie mit 3 Spülen - 4 ml Heparin vor ejecting der Anti-Gerinnungsmittel.
   Hinweis: Führen Sie diesen Schritt Koagulation in der Spritze während Knochenmarksaspiration zu vermeiden.
3. Extrahieren von mindestens 5 ml Knochenmark aus dem Beckenkamm Knochen des minipig unter Narkose, eine Knochenmark-Extraktor (3,0 × 100 mm) fest an dem Heparin vorbeschichtet 10-ml-Spritze.

5. Isolierung von Zellen aus dem Knochenmark entnommen und in vitro Kultivierung

1. Isolieren der Zellen aus dem Knochenmark entnommen.
   1. Verdünne das extrahierte Knochenmark mit einem gleichen Volumen von DPBS in einem 15 ml konischen Röhrchen bei Raumtemperatur.
   2. 3 ml Dichtezentrifugation Medium (Ficoll-Paque) an die 15 ml konischen Röhrchen.
   3. Verdünnen, um eine 4 ml-Schicht des Knochenmarks mit DPBS, die ohne Mischen auf der Dichtezentrifugation Medien angeordnet wird, und es Zentrifuge bei 400 × g für 40 min bei Raumtemperatur.
   4. Ernten Sie die Schicht aus einkernigen Zellen(MNCs) aus dem buffy coat zwischen den zwei Schichten mit dem Plasma (obere Schicht) und die Dichtezentrifugation Medien (untere Schicht), und übertragen die MNCs in einem 15 ml konischen Röhrchen.
   5. Verdünne die übertragenen MNCs mit 7 bis 8 ml DPBS und zentrifugiert sie bei 500 × g für 10 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und waschen Sie die Zellen zweimal mit DPBS.
   6. Hängen Sie das Zellpellet in 2 ml ADMEM und übertragen sie auf eine 35-mm-Gewebekulturschale. Inkubieren der Kulturschale bei 38,5 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO _2.
2. In - vitro - Kultivierung von Zellen aus Knochenmark isoliert.
   1. Nach 48 Stunden ansaugen das Medium mit den Zellen , die nicht an der Schale befestigt sind, und 2 ml des ADMEM ersetzen und bei 38,5 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO ₂ inkubieren. Ändern Sie das Medium alle dritten Tage.
   2. Bei 70 bis 80% Konfluenz, waschen Sie die Zellen mit DPBS, distanzieren sie mit 1 ml 0,25%Trypsin / EDTA, und sie für 3 bei 37 ° C inkubieren - 5 min, bis die Zellen abzulösen.
   3. Ernte der Zellen unter Verwendung von 10 ml ADMEM, übertragen sie in einem 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren sie bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen.
   4. Suspend die geernteten Zellen in 1 ml frischem ADMEM und zähle sie eine Zählkammer.
   5. Platzieren Sie die Zellen in einer 5 bis 7,5 x 10 ⁵ / 25T - Kolben mit 4 ml ADMEM und inkubieren sie bei 38,5 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO _2. jeden dritten Tag Ändern Sie das Medium.

6. Sammlung von Synovialflüssigkeit aus den Minipigs

1. Ähnlich wie bei dem Verfahren für Mark-Aspiration Knochen, wählen Sie eine entsprechende Fläche von ca. 15 x 10 cm (Länge / Breite) über die Oberschenkelgelenk, und entfernen Sie die Haare sterilisiert mit Rasierapparaten oder elektrische Haarschneidemaschine, folgen von sanitization Verfahren (Schritt 4.1).
2. Legen Sie eine 3-ml-Spritze mit einer 23 GNadel in das Gelenk nach den Palpation Sehenswürdigkeiten (Patella und Tibia Kamm).
   1. Bewerben sanfte Saugwirkung auf die Spritzen für die Aspiration von Gelenkflüssigkeit im Gelenk. Das ungefähre Volumen der Synovialflüssigkeit aus einem gemeinsamen gesammelten 0,5-1 ml, was aber je nach der Größe des minipig oder das Gelenk. Spülen durch DPBS in der Synovialhöhle wenn das gesammelte Volumen an Synovia zu klein ist.
   2. Ab sofort zurückziehen, die Spritze Kontamination mit Blut zu vermeiden.

7. Zellisolierung aus dem gesammelten Synovialflüssigkeit und In - vitro - Kultivierung

1. Isolieren der Zellen aus dem abgesaugten Synovialflüssigkeit.
   1. Verdünne das aspirierte Synovialflüssigkeit mit einem gleichen Volumen von DPBS in einem 15 ml konischen Röhrchen bei Raumtemperatur.
   2. Zum Entfernen von Schmutz, filtern das verdünnte Synovia eine 40 & mgr; m Nylon Zelle Sieb verwendet wird.
   3. 10 ml DPBS auf das Rohr des gefilterten synovial enthaltendFluid- und Zentrifuge es bei 400 × g für 10 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und waschen Sie die Zellen zweimal mit DPBS.
   4. Suspendiere das Zellpellet in 2 ml ADMEM, setzen die Zellen auf einem 2 - 3 x 10 ⁵ Zellen / 35 mm - Gewebekulturschale mit 2 ml ADMEM und inkubieren bei 38,5 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO ₂ .
2. Wiederholen Sie Schritt 5.2 für die in vitro Kultivierung von isolierten Synovialflüssigkeit abgeleitete MSCs.

8. Post-Verfahren Pflege der Minipigs

1. Wenn nötig, schließen Sie die Haut an der Injektionsstelle Extraktor Knochenmark mit einer einzigen Naht eine Haut Hefter nach der Knochenmarkentnahme verwenden.
2. eine intramuskuläre Injektion von Enrofloxacin (5 mg / kg) und Meloxicam (0,2 mg / kg) auf die minipigs einmal täglich für 3 Tage, nachdem die Prozedur abgeschlossen ist, verabreichen.
3. Nachdem der Vorgang abgeschlossen ist, zu desinfizieren, das Knochenmark und Synovia Sammelortmit 0,1% Povidon-Iod einmal täglich für 3 Tage. Beachten Sie sorgfältig täglich auf Anzeichen von Komplikationen zu überwachen (zB Schwellungen, Eiter oder Rötung).

9. Zelle Phänotypisierung Mit Flow Cytometry

1. Wann sind die MSCs 70-80% konfluent bei Passagen 3 bis 5, waschen Sie die Zellen mit DPBS und behandeln sie mit 1 ml 0,25% (v / v) Trypsin / EDTA. Dann brüten sie bei 37 ° C 3 - 5 min, bis die Zellen abgelöst werden.
2. Ernte der Zellen unter Verwendung von 10 ml DPBS, übertragen sie in einem 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren sie bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen Lösung.
3. Um die Zellen zu reparieren, zu suspendieren das Zellpellet in 10 ml einer 3,7% igen Formaldehydlösung und halten sie bei 4 ° C für einen Tag vor der Analyse.
   1. Einen Tag nach der Fixierung, waschen Sie die Zellen mit DPBS zweimal unter Verwendung von Zentrifugation bei 300 × g für jeweils 5 min. Überstand verwerfen Lösung.
   2. Suspendiere das Zellpellet in 4 mlDPBS, das mit 1% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA), und Inkubieren des Pellets für 1 Stunde bei 4 ° C zu blockieren unspezifische Fc-vermittelte Wechselwirkungen ergänzt wird.
   3. 500 ul Aliquots der Zellsuspension in 1,5 ml Röhrchen verteilen.
   4. Für nicht-konjugierten Antikörper (CD29 und Vimentin), wasche die Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 3 min. Überstand verwerfen Lösung.
   5. Suspendiere das Zellpellet in 500 ul einer 1: 100-Verdünnung des primären Antikörpers und Inkubieren für 1 Stunde bei 4 ° C.
   6. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1% Rinderserumalbumin durch Zentrifugation bei 300 × g für jeweils 5 min. Überstand verwerfen Lösung.
   7. Suspendiere das Zellpellet in 500 ul einer 1: 100-Verdünnung von Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) -konjugiertem sekundärem Antikörper und Inkubieren für 1 Stunde im Dunkeln bei 4 ° C.
4. Für die FITC-konjugierte Antikörper (Isotyp, CD34, CD44 und CD45), waschen Sie die Zellen durch centrifusuchung bei 300 × g für 3 min. Überstand verwerfen Lösung.
   1. Suspendiere das Zellpellet in 500 ul der 1: 100-FITC-konjugierten Antikörper und Inkubieren für 1 Stunde im Dunkeln bei 4 ° C.
   2. Für beide Färbebedingungen, wasche die Zellen zweimal mit DPBS durch Zentrifugation bei 300 × g für jeweils 5 min. Überstand verwerfen Lösung.
   3. Die Zellen in 500 ul DPBS, übertragen sie in einen 5 ml - Rundbodenrohr und analysieren die Ergebnisse eines Durchflusszytometers ⁸ verwenden.

Ergebnisse

Gründung von MSCs aus dem Knochenmark und Synovialflüssigkeit von Minipigs Abgeleitet

MSCs wurden aus dem Knochenmark und articular synovialen Gelenke der minipigs erfolgreich isoliert und in vitro (2) erweitert. Spritze Aspiration von Synovialflüssigkeit ist einfach, und es ist möglich , eine ausreichende adhärenten Zellen während der in vitro Kultivierung der Primärzellen z...

Diskussion

Minipigs wurden verwendet, MSCs Isolierung aus dem Knochenmark und Gelenkflüssigkeit zu etablieren. Zu verschiedenen physiologischen Bedingungen, wie Alter, Geschlecht und Krankheits, Minipigs von isogenen Hintergrund Spender beseitigen wurden ausgewählt, um genau die Zellquelle abhängigen Charakterisierung auszuwerten. Schweine sind bekannt anatomisch, physiologisch und genetisch ähnlich wie beim Menschen zu sein, und insbesondere minipigs können Größe abgestimmte Organe produzieren; daher können sie als Ersatz Donator...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fortschrittliches Dulbecco' s modifiziertes Eagle-Medium (ADMEM)	Gibco	12491-023	MSC-Kulturmedium
Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)	Gibco	14190-144	Zellwaschmedium, frei von Ca2+/Mg2+
Fötales Rinderserum (FBS)	Gibco	16000-044	Bestandteil des MSC-Mediums
Glutamax	Gibco	35050-061	Bestandteil des MSC-Mediums
Penicillin/Streptomycin	Gibco	10378-016	Bestandteil des MSC-Mediums
Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)	Simga	F0291	Bestandteil des MSC-Mediums
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma	A6003	Bestandteil des MSC-Mediums
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072	Reagenz für die Zelldissoziation
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522	Bestandteil des MSCs Medium
Isotyp Antikörper	BD Pharmingen	BD 550616	Isotyp Kontrolle
CD29 Antikörper	BD Pharmingen	BD 552369	Integrin beta-1 MSCs Marker
CD44 Antikörper	BD Pharmingen	BD 553133	Zelloberfläche Glykoprotein MSCs Marker
CD45 Antikörper	BD Pharmingen	BD 340664	Marker für hämatopoetische Stammzellen
CD34-Antikörper	BD Pharmingen	BD 555821	Marker für hämatopoetische Stammzellen
CD90 Antikörper	BD Pharmingen	BD 555595	Thy-1-Membran-Glykoprotein MSCs-Marker
MHC Klasse II Antikörper	Santa Cruz	SC-32247	Antigen-präsentierender Zellmarker
Vimentin Antikörper	Sigma	Sigma-S6389	Typ III Zwischenfilament MSCs-Marker
Alkalische Phosphatase	Promega	S3841	Mischung aus 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) und Nitroblautetrazolium (NBT)
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	Dichtegradientenzentrifugation
Zellsieb	BD Falcon	352340	40 µ m Nylon-Zellsieb
15 ml konisches Polystyrol-Röhrchen	BD Falcon	351095	Probenentnahme und Zellisolierung
35 mm Schalen	Nunc	153066	Zellkulturschale
Knochenmarkextraktor	GmbH Medizintechnologie, Deutschland	1145-1W010	TrokaBone, 3,0 x 100 mm
Hämatokritkammer	Marinfeld	640130	Zellzählkammer
Atropin	Jeil Pharmaceutical Co, Südkorea		Atropinsulfat Hydrat
Acepromazin	Samu Median, Südkorea		Präanästhetikum Beruhigungsmittel und Antiemetikum
Medetomidin	Pfizer		Anästhetikum und Analgetikum
Enrofloxacin	Bayer Healthcare, Deutschland		Antibiotika
Meloxicam	über Veterinärmedizin, Argentinien	Entzündungshemmendes und schmerzstillendes Medikament
	Korea Pharma, Südkorea		Sterilisationsmittel
Ethanol	Sigma	E7023	Sterilisationsmittel
Heparin	Sigma	H3393	Antikoagulationsmittel
Formaldehyd	Sigma	F8775	Zellfixierungsmittel
Ophthalmologische Salbe	Pfizer		Oxytetracyclin HCl mit Polymyxin B-Sulfat
Zirkulierende Wasserdecke	Gaymar Industries		Erwärmungssystem während und nach der Anästhesie
Hautklammergerät	Covidien, USA		Nahthautverschluss
CO2 Inkubator	Thermo Forma	3111	Zellkulturausrüstung
Durchflusszytometer	BD Biosciences		Zellanalysator
Minipig	PWG Genetics Korea, Ltd.	T-Typ	Miniatur-Molch