Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG), die aus Ratten isoliert wurden, und die Kultivierung von DRG-Neuronen auf einem statischen, vorgedehnten Zellkultursystem, um die Axonausrichtung zu verbessern, mit anschließender Co-Kultur von Schwann-Zellen (SCs), um die Myelinisierung zu fördern.

Zusammenfassung

Die Axonregeneration ist ein chaotischer Prozess, der hauptsächlich auf eine unorganisierte Axonausrichtung zurückzuführen ist. Damit eine ausreichende Anzahl von regenerierten Axonen die Läsionsstelle überbrücken kann, ist daher eine gut organisierte axonale Ausrichtung erforderlich. Da die Demyelinisierung nach einer Nervenverletzung die Leitfähigkeit der überlebenden Axone stark beeinträchtigt, ist die Remyelinisierung entscheidend für das erfolgreiche Funktionieren der regenerierten Nerven. Zuvor haben wir gezeigt, dass mesenchymale Stammzellen (MSCs), die sich auf einer vorgedehnten induzierten anisotropen Oberfläche ausrichten, da die Zellen eine größere effektive Steifigkeit in gestreckter Richtung als in senkrechter Richtung wahrnehmen können. Wir zeigten auch, dass eine anisotrope Oberfläche, die aus einer mechanisch vorgedehnten Oberfläche entsteht, die Ausrichtung sowie das Wachstum und die Myelinisierung von Axonen in ähnlicher Weise beeinflusst. In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Präparation einer vorgedehnten anisotropen Oberfläche, die Isolierung und Kultivierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG) auf einer vorgedehnten Oberfläche zur Verfügung und zeigen das Myelinisierungsverhalten einer Co-Kultur von DRG-Neuronen mit Schwann-Zellen (SCs) auf einer vorgedehnten Oberfläche.

Einleitung

In Nervenverletzungen sind die proximalen und distalen Nervenstümpfe oft von der direkten Neuausrichtung Nervenfaszikel verhindert aufgrund der Läsionsstelle ^1-2. Normalerweise werden Axon Striche hoch geordnete und ausgerichtete Bündel von Axonen zusammen, die komplexe Netzwerke von Konnektivität bilden. Allerdings ist die Nervenregeneration ein chaotischer Prozess wegen schlecht organisiert Axon Ausrichtung ^3-4. Um daher eine ausreichende Anzahl von regenerierenden Axonen zu erzeugen, das der Läsionsstelle brücken, ist es notwendig, gut organisierte axonalen Ausrichtung zu induzieren. Darüber hinaus begleitet Demyelinisierung Nervenverletzunge....

Protokoll

Alle Verfahren zur Isolierung der Zellen wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Michigan State University genehmigt.

1. Herstellung von vorgespannter anisotroper Oberfläche

1. Mischen Sie eine 10: 1-Lösung von Base und Härter und gießen Sie die Mischung in eine Gewebekulturschale (12 cm Durchmesser). Verwenden Sie 4.900 mg Base und 490 mg Mittel für die gesamte Vernetzungs Mischung härtet.
2. Halten Sie die Gelmischung unter Vakuum für 20 min Luftblasen zu entfernen.
3. Legen Sie das Gel-Gemisch in dem Ofen über Nacht Aushärtung bei 60 ° C.
4. Nachdem die Membran aushärtet PDMS, Behandlung der Oberfläche....

Ergebnisse

Die vorgedehnten Zellkultursystem DRG axon Ausrichtung gefördert ^10. DRG-Neuronen wurden auf vorgestreckten und ungereckten Oberflächen für 12 Tage. Die Axone wurden für β-III-Tubulin gefärbt ihre Ausrichtung zu zeigen. 2 vergleicht axon Ausrichtung auf den vorgestreckten und ungestreckte PDMS Substrate nach 12 Tagen Kultur. Die DRG Axone parallel zur Streckrichtung ausgerichtet sind, während sie zufällige Ausrichtung zeigte und bildeten ein miteinander verbun.......

Diskussion

Zur Induktion Axon Ausrichtung auf vorgedehnte Oberfläche gibt es zwei wichtige Schritte: 1) die PDMS-Membran muss flach sein und homogener Dicke; und 2) Gliazellen müssen aus dem DRG entfernt werden. Nach dem Mischen in einem Ofen die PDMS und Vernetzer und der Härtung sollte das vernetzte PDMS Gel sorgfältig ein Verkanten zu vermeiden, auf einer flachen Tischplatte und behandelt gehalten werden. Die Sauerstoffplasmabehandlung der PDMS Membran sollte innerhalb von 6 h von PLL-Beschichtung eingehalten werden, da die Hyd.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Neurobasales Medium 1x	GibcoBRL	21103-049
B27 Supplement 50x	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100x	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nervenwachstumsfaktor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillin-Streptomycin	GibcoBRL	15140-122
0,05 % Trypsin-EDTA/1 mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysin	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysin	Sigma	p-6407
Fluor-2-Desoxyuridin	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolationspuffer
Typ I Kollagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum-Hyklon		SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Silikonkammer	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Plasma-Reinigungs-/Ätzsystem	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 Antikörper	Sigma- Aldrich	M7898
Kaninchen Komplement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standard Wachstumsmedium			Für 500 ml Neurobasales Medium 1x fügen Sie 10 ml B-27 50x, 5 ml Glutamax-I 100x, 2,5 ml Penicillin/Streptomycin (Penn/Streptomycin), 1 ml Albumax-I und 1 μ l von NGF-- 7S (50 μ g/ml).
FDU Uridin Stammlösung			FDU 100 mg in 10 ml ddH2O (10 mg/ml), in der Haube filtrieren und aufgeteilt in 500 μm; l aliquotiert und bei -20 μC lagern. Uridin 5 g in 166,7 ml ddH2O (33 mg/ml), in der Haube filtrieren, in 200 μm teilen; l aliquotiert und bei -20 °C lagern. Nehmen Sie 61,5 μ l FDU (10 mg/ml) und 20,5 μ l Uridin (33 mg/ml) und fügen Sie 4.918 μm hinzu; l ddH2O zu einer endgültigen Stammkonzentration auffüllen, dann in 1 ml Aliquot dividieren und bei -20 μC lagern.