Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung einzelner Zellen mit einer mikrofluidischen Plattform, die ein neues Mikrotiter-Designkonzept verwendet, um eine hocheffiziente Einzelzellisolierung und eine langfristige klonale Kultur zu ermöglichen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Untersuchung der Heterogenität einzelner Zellen ist für viele biologische Fragen entscheidend, aber technisch schwierig. Daher besteht ein Bedarf an einer einfachen, aber dennoch hochdurchsatzstarken Methode, um Einzelzellkulturexperimente durchzuführen. Hier berichten wir über eine mikrofluidische Chip-basierte Strategie für die hocheffiziente Einzelzellisolierung (~77%) und demonstrieren ihre Fähigkeit, langfristige Einzelzellkulturen (bis zu 7 Tage) und zelluläre Heterogenitätsanalysen mit klonogenen Assays durchzuführen. Diese Anwendungen wurden mit KT98 neuralen Stammzellen der Maus und A549 und MDA-MB-435 menschlichen Krebszellen demonstriert. Eine hohe Effizienz der Einzelzellisolierung und eine langfristige Kulturfähigkeit werden durch die Verwendung von Mikrovertiefs unterschiedlicher Größe an der Ober- und Unterseite des mikrofluidischen Kanals erreicht. Das kleine Mikrotiter-Array ist für die präzise Isolierung von Einzelzellen ausgelegt, und das große Mikrotiter-Array wird für die klonale Einzelzellkultur im mikrofluidischen Chip verwendet. Diese mikrofluidische Plattform stellt einen attraktiven Ansatz für Einzelzellkulturanwendungen dar, da sie flexibel anpassbare Zellkulturräume für verschiedene Kulturstrategien bietet, ohne die Isolationseffizienz zu verringern.
Einleitung
Derzeit Einzelzellen einzeln in einem Kulturraum platziert wird üblicherweise durch Verwendung limitierende Verdünnung oder fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) erzielt. Für viele Laboratorien limitierende Verdünnung ist ein zweckmßiges Verfahren, da es nur eine Pipette und Gewebekulturplatten benötigt, die leicht verfügbar sind. In diesem Fall wird eine Zellsuspension zu einer geeigneten Zelldichte seriell verdünnt und dann in Kulturvertiefungen gegeben durch eine manuelle Pipette. Diese abgeteilten Einzelzellen werden dann für die Zellanalyse verwendet werden, wie genetische Heterogenität Screenen 1 und Koloniebildung 2. Jedoch ist dies....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Hinweis: Die Fotomasken-Designs für unsere Mikrofluidik-Vorrichtung Fertigung wurden gezeichnet von einem Computer Aided Design (CAD) Software. Die Entwürfe wurden dann verwendet, um Chrom Photomasken herzustellen Kommerzielle Dienst. Die PDMS - Geräte wurden unter Verwendung von weichen Lithographietechniken hergestellt. 11
1. Herstellung von Urformen von Lithography
- Vor dem photolithographischen Prozeß 12, verwenden , um die 4-Zoll - Siliziumwafer als Substrat und entwässern um die Wafer in einem konventionellen Ofen bei 120 ° C für 10 min.
- Reinigen Sie die dehydriert Silizium-Wafern durch Saue....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Die mikrofluidische Plattform für Einzelzellisolierung und Kultur umfasst einen Mikrokanal (200 & mgr; m in der Höhe) mit zwei Sätzen von Mikrovertiefungsanordnungen (2A). Die zwei Sätze von Mikrovertiefungsarrays werden als capture-Well (25 um Durchmesser und 27 um Tiefe) und Kultur-Well (285 & mgr; m im Durchmesser und 300 & mgr; m in der Tiefe) bezeichnet für die Einzelzell-Isolierung und Kultur sind und jeweils Capture-gut ist in der Mitte einer Kultur gu.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Mikrowell-basierten Gerätesysteme 6,14 wurden für die Einzelzell - Manipulation und Analyse, wie beispielsweise großflächige Einzelzelle verwendet und 6 einzigen hämatopoetischen Stammzellproliferation Trapping 15. Obwohl gut Größe, Anzahl und Form können für spezifische Anwendungen angepasst werden, die Einzelzellisolierung Effizienz wird immer gefährdet , wenn die Größe des Bohrlochs erhöht. 9,15
Um diese Einschränkung zu überwinden, Park et .......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der National Health Research Institutes (03-A1, BNMP11-014) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| AutoCAD-Software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Teile-Nr. 057C1-74A111-1001 |
| Siliziumwafer | Eltech corperation SPE0039 | ||
| Konventioneller Ofen | YEONG-SHIN Firma | ovp45 | |
| Plasmareiniger | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasmabehandlungssystem |
| SU-8 50 Negativ-Fotolack | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 Negativ-Fotolack | MicroChem | Y131273 | |
| Spin Coater | Synrex Co., GmbH. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Heizplatte | YOTEC Firma | YS-300S | |
| Msak Aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 Entwickler | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylenglykolmonomethyletheracetat |
| Scanning-Laser-Profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorsilan | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Gefährlich. Korrosiv für die Atemwege, reagiert heftig mit Wasser. |
| Exsikkator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Platzsparender Vakuum-Exsikkator 190 mm weißer Boden |
| Polydimethylsiloxan (PDMS) Kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core Stanzer | Ted Pella Inc. | 15072 | mit 0,75 mm Innendurchmesser |
| Ablösbares Klebeband | 3M Company | Scotch Ablösbares Klebeband 811 | |
| Stereomikroskop | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM Basalmedium | Gibco | 12800-017 | |
| Fötales Rinderserum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotika | Biowest | L0014-100 | Glutamin-Penicillin-Streptomycin |
| Rekombinantes Enzymgemisch | Innovative Zelltechnologie | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) Zellmembranfarbstoff | BD Biosciences | 354218 | Wird als Zelltracker verwendet |
| Spritzenpumpe | Harvard Gerät | 703007 | |
| Kunststoff Spritze (1 ml) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 Gauge stumpfe Nadeln | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Schlauch aus Polytetrafluorethen (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | Innendurchmesser, 0,51 Mm; Außendurchmesser, 0,82 Mm |
Referenzen
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
