Methodenartikel

Erkennung von Anastasis In Vivo durch CaspaseTracker Biosensor

DOI:

10.3791/54107

⸱

1. Februar 2018

 ,  , 
1Institute for Basic Biomedical Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Anastasis ist technisch anspruchsvoll, um in Vivo zu erkennen, da die Zellen, die der Zelle Todesprozess umgekehrt haben morphologisch nicht zu unterscheiden von normalen gesunden Zellen sein können. Hier beschreiben wir Protokolle für die Erkennung und Verfolgung von Zellen, die Anastasis mit lebenden Tieren zu unterziehen, durch den Einsatz unserer neu entwickelten in Vivo -CaspaseTracker-Biosensor-System.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anastasis (griechisch für "Rising zum Leben") ist ein vor kurzem entdeckten Zelle Erholung Phänomen, wobei Zellen sterben Tod Spätstadium Zellprozesse rückgängig machen kann, die in der Regel angenommen werden, per se nicht rückgängig gemacht werden. Förderung der Anastasis Körperverletzungen im Prinzip Rettungs- oder Konserve Zellen, die schwer zu ersetzen, wie Kardiomyozyten oder Nervenzellen, wodurch Gewebe Erholung sind. Umgekehrt kann unterdrücken Anastasis in Krebszellen die Apoptose nach Anti-Krebs-Therapien unterziehen Krebs Zelltod zu gewährleisten und reduzieren die Wahrscheinlichkeit eines erneuten Auftretens. Allerdings haben diese Studien behindert wurde, durch den Mangel an Tools für die Verfolgung des Schicksals der Zellen, die Anastasis mit lebenden Tieren zu unterziehen. Die Herausforderung ist es, die Zellen zu identifizieren, die die Zelle Tod trotz ihrer morphologisch normale Erscheinung nach der Wiederherstellung rückgängig gemacht haben. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, haben wir entwickelt, Drosophila und Säugetieren CaspaseTracker-Biosensor-Systeme, die erkennen und dauerhaft zu verfolgen, die Anastatic Zellen in Vitro oder in Vivo. Hier präsentieren wir Ihnen in-Vivo -Protokolle für die Erzeugung und Nutzung von das CaspaseTracker dual Biosensor-System zu erkennen und verfolgen Anastasis in Drosophila Melanogaster nach vorübergehenden Aussetzung zu Zelle Tod Reize. Während konventionelle Biosensoren und Protokolle Zellen aktiv durchmachenden apoptotischen Zelltod beschriften können, der CaspaseTracker-Biosensor kann dauerhaft beschriften, Zellen, die nach der Aktivierung der Caspase - ein Markenzeichen der Spätphase Apoptose, erholt haben und gleichzeitig aktive apoptotische Prozesse zu identifizieren. Dieser Biosensor kann auch die Erholung der Zellen aufspüren, die andere Formen des Zelltods versucht, die direkt oder indirekt Caspase-Aktivität beteiligt. Daher ist dieses Protokoll ermöglicht es uns, kontinuierlich verfolgen das Schicksal dieser Zellen und deren Nachkommen, die Erleichterung der Zukunftsforschung der biologischen Funktionen, molekulare Mechanismen, physiologischen und pathologischen folgen und therapeutische Implikationen der Anastasis. Wir diskutieren auch die entsprechenden Steuerelemente, um Zellen zu unterscheiden, die Anastasis von denen zu unterziehen, die nicht-apoptotische Caspase-Aktivität in Vivoanzeigen.

Einleitung

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Programmierten Zelltod, z. B. Apoptose, spielt eine wesentliche Rolle in der embryonalen Entwicklung und normale Homöostase durch den Wegfall von unerwünschter, verletzter oder gefährliche Zellen in mehrzelligen Organismen1,2,3. Der Verlust des Gleichgewichts zwischen Zelle Tod und überleben kann zu fatalen Folgen wie Krebs, Herzversagen, Autoimmunität und Degeneration4,5,6,7,8führen. Aktivierung des Henkers, die Caspasen traditionell als der "Point Of No Return" Apoptose9,10,11, als es betrachtet löst schnelle und massive zellulären Abriss12, 13,14,15,16. Anspruchsvolle dieses allgemeinen Dogma, haben wir bewiesen, kultivierten sterbenden primäre Zellen und Krebszellen nicht nur nach Aktivierung der Caspase, sondern auch folgende wichtige Zelle Tod Kennzeichen einschließlich der Plasmamembran Blebbing, Schrumpfung der Zelle wiederherstellen zu können, mitochondriale Fragmentierung, Freisetzung von mitochondrialen Cytochrom c in das Zytosol, nukleare und Chromatin Kondensation, DNA-Schäden, nukleare Fragmentierung, Zelle Oberfläche Exposition von Phosphatidylserin (PS) und Bildung von apoptotischen Körper 17 , 18 , 19 , 20 , 21. schlagen wir die Anastasis ist eine innere Zelle Erholung Phänomen, wie sterbende Zellen nach Entfernung der Zelle Tod Reize17,18,19,20, erholen können 21. wir prägte den Begriff "Anastasis" (Αναστάσης)18, was bedeutet "steigt zum Leben" in griechischer Sprache, zu dieser unerwarteten Zelle Erholung Phänomen zu beschreiben. Unsere Beobachtung der Anastasis wird weiter unterstützt durch unabhängige Studien, die zeigen auch Erholung der Zellen nach Phosphatidylserin Externalisierung22,23,24, mitochondriale begrenzte äußeren Membran Permeabilisierung25, Aktivierung der gemischte Abstammung Kinase-wie (MLKL) und Zelle Schrumpfung26.

Charakterisierung der Mechanismen zur Regulierung der Anastasis wird Paradigma-Verschiebung physiologische, pathologische und therapeutische Konsequenzen haben. Anastasis könnte einen bisher unbekannten zellschützenden Mechanismus zu retten oder bewahren wichtige postmitotischen Zellen und Gewebe, die schwer zu ersetzen sind, und möglicherweise Konto für Herzinsuffizienz Umkehrung von ventrikulären entladen mit Links ventrikulären darstellen unterstützen Sie Geräte (LVAD)27,28, Wiederherstellung der Sehzellen nach vorübergehender Exposition von übermäßigen hellen29,30,31, oder Reparatur von Neuronen nach Gehirn Verletzungen32. Wenn ja, Förderung der Anastasis Zell- und Erholung verbessern könnte. Umgekehrt könnte Anastasis eine unerwartete Flucht Taktik zu Zelle Tod-induzierenden Therapie verursacht Krebs Wiederauftreten17,18Überleben von Krebszellen verwendet werden. Deshalb unterdrücken Anastasis im sterben Krebszellen während und nach Behandlung von Krebs könnte eine neuartige therapeutische Strategie, Krebs zu heilen, durch ihren Rückfall zu verhindern.

Während des Prozesses der Anastasis haben wir festgestellt, dass einige wiederhergestellten Zellen erworben dauerhafte genetische Veränderungen und unterzog sich onkogenen Transformation, wahrscheinlich aufgrund von DNA-Schäden entstehen während der Apoptose18,20,21 . Umkehrung des Prozesses der Tod von DNA-beschädigte Zellen könnte ein Mechanismus der Tumorgenese, potenziell zugrunde liegt die Beobachtung, die Gewebeverletzung wiederholt erhöht das Risiko von Krebs in einer Vielzahl von Geweben, wie z. B. chronische thermische Schädigung in der Speiseröhre induziert durch den Verzehr von sehr heißen Getränken33,34,35, Leberschäden durch Alkoholismus36,37, Tumor-Evolution nach genotoxische Krebs Therapie38, 39,40und die Entwicklung von Neuerkrankungen von normalen Zellen, die in den Pausen zwischen den Zyklen der Anti-Krebs-Therapie41,42,43,44 entstehen . Wenn "true", könnte targeting Anastasis verhaften Krebsentstehung und Progression oder verhindern. Wir haben festgestellt, dass Hunger-induzierte sterbenden Keimzellen Anastasis erneut zugeführt werden, Drosophila19unterziehen.  Wenn Anastasis in Keimzellen mit DNA-Schädigung auftritt, könnte es sein, entfallen die Beobachtung, die Umweltbelastungen verlängert Entwicklung genetischer Erkrankungen fördert. Z. B. zur Hungersnöte Entwicklung der transgenerationalen vererbbare Krankheiten wie Diabetes und koronare Herzkrankheiten45. Daher könnten Verständnis Anastasis Strategien zur Prävention von vererbbaren Krankheiten, die durch diesen möglichen Mechanismus zu entwickeln.

Um die Entdeckung der Anastasis zu nutzen und zu lenken, innovative Therapien zu entwickeln, ist es wichtig, die Ursache und Folge der Anastasis mit lebenden Tieren zu studieren. Jedoch ist es technisch schwierig zu identifizieren und verfolgen Anastatic Zellen in Vivo, da die Zellen, die Zelle Todesprozess erholt morphologisch nicht zu unterscheiden von normalen gesunden Zellen erscheinen, und es keine Biomarker der Anastasis gibt identifiziert noch17,18,21. Um diese Probleme anzugehen, haben wir vor kurzem entwickelt eine neue in-Vivo Caspase Biosensor bezeichnet "CaspaseTracker"19, zu identifizieren und verfolgen von Zellen, die Apoptose nach Caspase Aktivierung19,46, überleben die Markenzeichen der Apoptose10,14. Unterscheidet sie von der "Echtzeit" Caspase-Biosensoren wie SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 und iCasper52 erkennen, dass andauernde Caspase-Aktivität, der CaspaseTracker-Biosensor zusätzlich bietet die Möglichkeit, dauerhaft Zellen diese ausdrückliche Caspase-Aktivität sogar vorübergehend beschriften. Der CaspaseTracker-Biosensor ermöglicht somit, langfristige Verfolgung von Anastasis nach Umkehr der Caspase-vermittelte Zelle Tod Prozess in Vivo.

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Protokoll

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(1) Vorbereitung der CaspaseTracker Biosensor fliegen

  1. Betäuben Sie fliegen mit CO2zu, und verwenden Sie einen Pinsel, 7-10 Caspase-Sensitive Gal4 (DQVD)19 jungfräulichen Weibchen und 7 bis 10 G-Spur53 Gal4 Reporter junge männliche fliegen (oder umgekehrt) in der gleichen Flasche mit fliegen Essen und frische Hefe Paste übertragen.
    Hinweis: Kreuz von Caspase-Sensitive (DQVD) Gal4 und G-Spur fliegen erzeugt CaspaseTracker Nachkommen fliegen. Kreuz des Caspase -insensiblen (DQVA)19 Gal4 und G-Spur fliegen, erhalten Negativkontrolle fliegt (siehe Diskussion). Frische Hefe Paste dient als Proteinquelle, Ei-Produktion, zu verbessern, so dass die Anzahl der Nachkommen erhöht. Wählen Sie jungfräuliche Weibchen und junge Männchen fliegt nach ihren Phänotypen54.
  2. 3 bis 7 Tagen inkubieren Sie fliegen bei 18 Grad Celsius (oC) während des Kreuzes und übertragen Sie dann die fliegen zu einem neuen Fläschchen zum Einrichten eines neuen Kreuzes bei 18 ° C. Weiterhin der Originalflasche bei 18 ° C inkubieren, bis Nachkommen Eclose fliegt.
    Hinweis: Übertragen Sie die Eltern fliegen auf neue Fläschchen zu vermeiden Überbelegung der Nachkommen in der Originalflasche. Elternteil fliegen Nachkommen mit frischen Lebensmitteln und Hefe Paste in den ersten 2 bis 3 Schaltern erzeugen können, und dann verringern die Produktivität deutlich mit der Zeit. Erhöhung der fliegen 18 ° C können unspezifische Signal des CaspaseTracker Biosensor reduzieren (siehe Diskussion).
  3. Wählen Sie Nachkommen fliegt mit richtigen Phänotypen54 für folgende Experimente.
    Hinweis: Transgene Caspase-Sensitive Gal4 und G-Spur hier befinden sich auf dem zweiten Chromosom mit CyO Balancer ausgeglichen. Wählen Sie die nicht lockig Flügel Nachkommen (ohne CyO), die beide transgene Caspase-Sensitive Gal4 und G-Spur hat.

(2) die Anwendung der Transienten Zelle Tod Induktion, CaspaseTracker-Biosensor fliegen

  1. Übertragen Sie 10 bis 20 neu geschlüpften Weibchen ein neues Fläschchen mit Fliege Frischwaren und frische Hefe Paste für 1 Tag auf 18 ° C fliegt um Ei-Kammer-Produktion durch Oogenese zu ermöglichen.
    Hinweis: Halten das Weibchen mit männlichen fliegen könnte Ei Kammer-Produktion erhöhen.
  2. Das Weibchen fliegt um Ei Kammern durch Kälteschock, Transfer Apoptose induzieren neue leere Fläschchen, die dann bei-7 ° C für 1 h platziert wird.
    Hinweis: Kälteschock verletzt Zellen durch Induktion Plasmamembran Bruch55,56.
  3. Um Ei Kammern durch Protein verhungern Apoptose induzieren, übertragen Sie die weiblichen fliegen zu einem neuen Fläschchen mit 8 % Saccharose und 1 % Agar Essen bei 18 ° C für 3 Tage.
    Hinweis: Protein-Hunger (nicht-Protein Lebensmittel) auslösen kann Ei Kammern um Apoptose57,58,59 und Autophagie60,61unterziehen. Schalter fliegt zu einem neuen Fläschchen mit 8 % Saccharose und 1 % Agar Essen jeden Tag um zu optimalen Zustand Saccharose fliegen Essen zu halten.
  4. Übertragen Sie die gestressten fliegen zurück zu einem neuen Fläschchen mit frischen fliegen Essen und frische Hefe Paste für 3 Tage bei 18 ° C, damit sie sich erholen. Sezieren Sie die hungrigen und die verhungert erholt fliegen Ei Kammern an Eierstöcken beschrieben62zu erhalten.
    Hinweis: Um Drosophila Eierstöcke zu sezieren, verwenden Sie 2 Paar Pinzette, um fliegen Kopf entfernen betäuben Sie fliegen mit CO2, zu und verwenden Sie die Zange, um die Basis des Bauches zu entfernen die Eierstöcke der fliegen zu ziehen.

(3) Fixierung und Färbung der seziert Ei Kammern für die Bildgebung

  1. Übertragen Sie die seziert Ei Kammern zusammen mit rund 0,5 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf 1 mL Zentrifuge Röhren. Lassen Sie die Eiern zu beruhigen.
    Hinweis: Beschichten von Kunststoff Pipettenspitzen mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) aufgelöst in Wasser oder PBS Ei Kammern zum Aufkleben auf die Kunststoffoberfläche der Tipps zu verhindern. Führen Sie die folgenden Verfahren in Dunkelheit, Immunofluoreszenz rot fluoreszierenden Proteins (RFP, auch bekannt als DsRed) zu vermeiden und grün fluoreszierendes Protein (GFP) in die Ei-Kammern.
  2. Entfernen Sie die PBS durch pipettieren, und wenden Sie dann 0,5 mL 4 % Paraformaldehyd in PBS, Ei Kammern bei Raumtemperatur in Dunkelheit für 20 bis 30 min. zu beheben.
    Hinweis: Sanfte Drehung in dieser und die folgenden Inkubationsschritte anwenden.
  3. Entfernen Sie die Paraformaldehyd durch pipettieren und dann gewaschen, die Ei-Kammer mit 0,5 mL PBST (PBS + 0,1 % Triton x-100) für 3 Mal.
    Hinweis: Verlängerte Fixierung könnte die RFP und GFP-Signale reduzieren.
  4. Die Ei-Kammern mit PBST für 1 bis 2 h bei Raumtemperatur inkubieren oder über Nacht bei 4 ° C mit sanften Drehung um das Ei Kammern permeabilize.
    Hinweis: PBST kann vermeiden, Ei Kammern, an die nicht-BSA beschichteten Kunststoff-Oberfläche.
  5. Entfernen Sie der PBST durch pipettieren und Ei Kammern für 1 bis 2 h bei Raumtemperatur für Kern Fleck dann zuweisen Sie 0,5 mL 10 μg/ml blauer nuklearen Hoechst Farbstoff in PBST.
    Hinweis1: Vermeiden Sie längeren Inkubation mit nuklearen Farbstoff, wie das unspezifische Signal zu erhöhen.
    Hinweis 2: Alternativer Ansatz zum Kern ohne Hoechst Fleck ist das Hinzufügen von 200 μl Anti-bleichen Montage Agent mit DAPI (siehe Material) und inkubieren Sie über Nacht63, vor der Montage das Gewebe auf Glas Deckglas, wie im Protokoll 3.8 beschrieben.
    NOTE3: führen Sie die Färbung und die folgenden Verfahren in Dunkelheit, Immunofluoreszenz zu vermeiden.
  6. Entfernen des nuklearen Farbstoffs durch pipettieren und dann gelten 0,5 mL PBST die Ei Kammern in die Zentrifuge Röhren 1 mL für 3 Mal mit 10 bis 20 min Inkubation mit sanften Drehung zwischen jedem Waschschritt zu waschen.
  7. Entfernen Sie alle PBST mit feinen Pipette, und wenden Sie dann 200 μL Anti-bleichen Montage Agent (siehe Material) Ei Kammern bei Raumtemperatur 3 Stunden oder über Nacht bei 4 ° C inkubieren, bis Ei Kammern auf der Unterseite des Rohres sinken.
    Hinweis: auf den Boden des Rohres sinken Gewebe, die vollständig den Montage-Agent aufgenommen haben.
  8. Montieren Sie die gefärbten Ei Kammern durch Übertragung mit 200 μl Anti-bleaching Montage-Agent auf einem vorgereinigten Objektträger für die Bildgebung durch pipettieren, Ei Kammern mit einem 20 x 20 mm vorgereinigten Glas Deckglas abdecken und verschließen das Deckglas auf Glasobjektträger indem man Nagellack am Rand des Deckglases.
    Hinweis1: Pre-reinigen Sie den Objektträger und Deckglas mit Wasser oder 70 % Ethanol.
    Hinweis 2: Gelten Sie Vaseline zwischen den Objektträger und Deckglas zu zerstören die Ei-Kammern durch Unterverdichtungen.
  9. Bild der Ei-Kammern mit Fluoreszenz oder confocal Mikroskop, mit einem 20 X, NA 0,8 Plan-Apochromat Objektive, mit Anregung Licht-Wellenlänge 405 nm für nukleare Färbung (Erkennung Emission ~ 461 nm), 561 nm für RFP (laufende oder kürzlich Caspase-Aktivität) Signal ( erkennen Emission ~ 590 nm), und 488 nm für GFP (vorbei an Caspase-Aktivität) Signal (Emission erkennen ~ 518nm).
    Hinweis: Sehen Sie unsere veröffentlichten Protokolle für Mikroskopie-20,-64.

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Ergebnisse

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Time-Lapse live Zelle Mikroskopie eine zuverlässige Methode, um Trakt Anastasis in kultivierten Zellen20ist, ist es schwierig zu identifizieren welche Zellen Anastasis bei Tieren, unterzogen wurden, da die wiederhergestellten Zellen morphologisch nicht zu unterscheiden scheinen aus normalen gesunden Zellen, die nicht Zelltod versucht haben. Z. B. anzeigen menschliche Gebärmutterhalskrebs HeLa-Zellen morphologische Kennzeichen der Apoptose1,2

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Diskussion

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Das CaspaseTracker dual Biosensor-System ist ein neuartiges und einzigartiges Werkzeug, das ermöglicht die Erkennung von den vergangenen oder laufenden Caspase-Aktivität und Verfolgung von Zellen, die Zelle Tod rückgängig gemacht haben verarbeiten und Überleben nach Caspase-Aktivität in Vivozu erleben. Während traditionell Caspase-Aktivität als ein Markenzeichen der Apoptose angenommen hat, zeigen wachsende Untersuchungen, dass-apoptotische Caspase-Aktivität mögliche Rollen in di...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Wir danken Darren Obbard für Drosophila Bild in Abbildung 3 und video Manuskript; J. Marie Hardwick, Wade Gibson und Heather M. Lamb für wertvolle Diskussion dieser Handschrift. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright gewähren 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation Fellowship (H.L.T.) und NCI K22 gewähren CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang war ein Shurl und Kay Curci Foundation Fellow der Life Sciences Research Foundation (2014-2017).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
VERBRAUCHSMATERIALIEN UND REAGENZIEN
Vectashield EindeckmittelVector ProductsH-1000Antifade Eindeckmittel
Vectashield Eindeckmittel (mit DAPI)Vector ProductsH-1200Eindeckmittel mit DAPI
PinzetteTed Pella#505 (110mm, #5)Dumont Pinzette Biologie Qualität, Edelstahl
Hängende ObjektträgerFisher Scientific12-565BObjektträger aus Glas
Hoechst 33342Molekulare SondenH1399DNA-Färbung
Mitotracker Rot CMXRos Molekulare SondenM-7512Mitochondrien-Färbung
Gespaltene Caspase-3 (Asp175) AntikörperCell Signaling Technology#9661Färbung für aktives Fragment von Caspase-3
Rinderserumalbumin (BAS)Sigma-AldrichA8806Blockierungsmittel zur Immunfärbung
phosphatgepufferter KochsalzlösungVWR114-056-101Medium zum Waschen und Immunfärben
Triton™ X-100Sigma-AldrichT8787Reinigungsmittel für die Zellpermeabilisierung
Name<>Company<>Katalognummer<>Kommentare
EQUIPMENT>
LSM780 KonfokalmikroskopCarl ZeissN/AImaging
Carl Zeiss Stereomikroskop Stemi 2000 Carl ZeissN/ADrosophila Dissektion
AmScope Fiber Optic Dual Schwanenhalsmikroskop Illuminator, 150WAmScopeWBM99316 Lichtquelle
von

Referenzen

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