Abstract
Ce rapport présente deux méthodes pour l'immobilisation covalente des anticorps de capture sur le filtre de cellulose de qualité de papier n ° 1 (papier filtre à moyen débit) disques et de grade n ° 113 (papier filtre à écoulement rapide) disques. Ces disques de papier de cellulose ont été greffées avec des groupes fonctionnels amine par l'intermédiaire d'une technique de couplage du type silane avant que les anticorps sont immobilisés sur eux. les méthodes de reticulation glutaraldéhyde oxydation et de periodate ont été utilisés pour greffer les anticorps de capture sur les disques de papier de cellulose. Afin de garantir la capacité maximale de liaison des anticorps de capture à leurs cibles après l'immobilisation, les effets de diverses concentrations de périodate de sodium, le glutaraldéhyde, et des anticorps de capture sur la surface des disques de papier ont été étudiés. Les anticorps qui ont été revêtus sur des disques de papier cellulosique à fonction amine par un agent de réticulation glutaraldéhyde ont montré une activité accrue de liaison à la cible par rapport au procédé d'oxydation du periodate. IgG (dans le sérum de référence de la souris) a été utilisé comme une cible de référence dans cette étude pour tester l'application des anticorps immobilisés de manière covalente par le glutaraldéhyde. Un nouveau papier, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) a été développé et validé avec succès pour la détection des IgG. Cette méthode ne nécessite pas d'équipements, et il peut détecter 100 ng / ml d'IgG. Le papier filtre à écoulement rapide était plus sensible que le papier filtre à moyen débit. La période d'incubation de ce test était courte et nécessaire de petits volumes d'échantillons. Cet oeil nu, immuno-essai colorimétrique peut être étendu pour détecter d'autres cibles qui sont identifiés par la méthode ELISA classique.
Introduction
L'étude des tests de point de soins (POCT) de diagnostic est important pour le développement de nouvelles stratégies pour la thérapeutique, la médecine personnalisée, et soins à domicile 1. Papiers de cellulose sont largement utilisés comme plates - formes dans les immunoessais, car ils ne coûtent pas cher, accessible et familier aux utilisateurs 2. En outre, la structure poreuse du papier cellulosique possède la puissance pour entraîner l'écoulement du liquide sans impact énergétique supplémentaire. Actes de la bioanalyse sur papier peuvent être trouvés dès le 20 e siècle, quand la chromatographie sur papier a été inventé en 1952. L'exemple le plus répandu est des tests immunochromatographiques 3, tels que la grossesse et de test du diabète bandes. Ces tests fournissent des temps d'analyse relativement rapide et peu coûteuse analyse 4. En raison de leur simplicité, ces tests de bandes de papier classiques ont été largement utilisés dans le diagnostic ADBD 5.
Les méthodes de détection , y compris colorimétriques 6, électrochimiques 7 et 8 électrochimiluminescence méthodes ont été rapportées pour mesurer des cibles dans des échantillons biologiques. En plus de ces méthodes quantitatives, une méthode fiable pour immobiliser des anticorps sur du papier de cellulose est également importante pour le développement de dispositifs de diagnostic. Adsorption non spécifique est la principale stratégie pour la modification des anticorps sur la surface des dispositifs à base de papier 9, 10 pour garantir une capacité de liaison maximale à leurs cibles après l' immobilisation. Cependant, une étude précédente ont montré que les anticorps qui sont adsorbés sur du papier de cellulose peuvent désorber des fibres 11 de 40%. Ainsi, l' adsorption directe d'anticorps sur la cellulose ne peut pas fournir des résultats reproductibles 12. Covalent immobilisation des anticorps qui sont greffés sur les surfaces de papier est une méthode alternative de développement bioessais sur papier efficaces 13. Divers procédés ont été rapportés pour la modification de la cellulose 14, 15 12. Carbonyldiimidazole combiné avec du 1-cyano-4-diméthylaminopyridinium tétrafluoroborate 16; 1-fluoro-2-nitro-4-azidobenzene grâce à une stratégie d'activation à base d'UV 17, 18; une stratégie chimioenzymatique basé sur 19 modification xyloglucane; un 1,4-phenylenediisothiocyanate agent de liaison 20; hétéropolysaccharide oxydation 21 click chemistry 22; et 23 porphyrines cationiques ont été utilisés pour immobiliser de manière covalente de biomolécules sur du papier de cellulose. Chitosan papier modifié a été utilisé pour développer immunodevices à base de papier 24-26 car elle est abondante et biocompatible 27. Le chitosane est cationique et adhère fortement à la cellulose anionique 27. Les anticorps de capture sont immobilisés sur le papier par revêtement de chitosane et de reticulation par le glutaraldéhyde. oxydation periodate est un autre procédé de greffage de la captanticorps ure sur le papier de cellulose 28. Dans ce procédé, le periodate de sodium est repéré sur le papier pour convertir le 1,2-dihydroxylé (glycol), les groupes de cellulose directement à des groupes aldéhyde. Les groupes aldéhyde sont ensuite utilisés pour former des liaisons covalentes entre les polysaccharides et les anticorps 28. Bien que la fabrication est simple, il est difficile de se laver complètement periodate de sodium. Le periodate de sodium non lavé peut provoquer une oxydation supplémentaire des anticorps qui sont immobilisés sur le papier de cellulose, ce qui affecte l'activité et la stabilité des anticorps N -. (3-diméthylaminopropyl) - N chlorhydrate -ethylcarbodiimide et N linkers croisées hydroxysuccinimide sont également utilisés pour immobiliser de façon covalente à des anticorps électrofilage d' acide et d' acétate de cellulose , des nanofibres de poly-l-lactique pour le développement de dosages à base de nanofibres-29.
Dans cette étude, une technique de couplage de type silane a été utilisé pour greffer des groupes fonctionnels amine sur cellulose des disques de papier. Cette technique permet de conserver la taille d'origine des pores, mèche, et le taux des papiers filtres de cellulose de filtration, ce qui permet un maximum vertical immunoessais accréditives dans. La technique de couplage à base de silane a été largement utilisé dans des biocapteurs pour fonctionnaliser des surfaces de substrats avec des groupes amine secondaire, suivie d'une modification supplémentaire à l'aide de biomolécules. Le greffage de groupes amine sur la surface de la matrice comprend une réaction de condensation entre des groupes -OH des agents de silane organofonctionnel et d'une matrice 30 substrat. Les disques de papier de cellulose ont été fonctionnalisés par des groupes amine par couplage à base de silane par le 3-aminopropyltriméthoxysilane (APS) 31. Ceci a été suivi par l'anticorps de capture de manière covalente immobilisant à l'aide de deux méthodes différentes. Le premier procédé implique la liaison des anticorps de capture oxydé au periodate des disques de papier de cellulose à fonctionnalité amine. La deuxième méthode utilise le glutaraldéhyde comme agent de reticulation pour fixer la capture Antibodies aux disques de papier de cellulose fonctionnalisée groupe-amine. La présence d'anticorps de capture a été confirmée par une IgG de lapin isothiocyanate de fluorescéine anti-humain (FITC), en utilisant un système d'imagerie moléculaire par fluorescence. L'activité de liaison des anticorps de lapin anti-IgG humaine-FITC de chèvre à l'IgG anti-lapin a également été évaluée par le substrat de la peroxydase. Les effets de diverses concentrations de périodate de sodium, le glutaraldéhyde, et des anticorps de capture ont été étudiés. Le test de l'anticorps de capture immobilisé d'application a été réalisée avec succès grâce à la détection de sérum IgG.
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Protocol
1. Intensification groupes fonctionnels amine sur cellulose de papier Disques
- Préparer un morceau de papier carré avec une dimension de 1 cm x 1 cm, et 100 disques de papier fabriqués à partir de la catégorie no 1 papier de cellulose avec un diamètre de 6,0 mm (papier filtre à moyen débit) à l'aide d'un poinçon.
- Pour tirer -NH 2 groupes sur les disques de papier, mélanger 1 ml APS et 10 ml d' acétone dans un flacon en verre de 50 ml dans la hotte. Ajouter des disques de papier au mélange réactif APS fraîchement préparé, et on incube pendant 5 heures sous agitation orbitale (200 rpm) à température ambiante 32.
Attention: Manipuler APS et de l'acétone dans la hotte. - Décanter excès de solution de la bouteille de 50 ml en verre dans un récipient de déchets organiques.
- Ajouter 10 ml d'acétone à la bouteille en verre, bien mélanger et décanter complètement pour éliminer toutes les APS pas réagi et d'autres impuretés. Répétez cette étape deux fois.
- Répartir les disques de papier sur la serviette en papier et le placer dans un four à 110 ° pendant 3 heures. Laisser ledes disques de papier pour refroidir. Stocker les disques dans un tube de centrifugation de 50 ml à la température ambiante.
- Utilisez Fourier spectroscopie infrarouge à transformée (FTIR) pour vérifier le greffage de groupes amine sur le papier carré de cellulose, comme décrit ci - dessous (figure 3A).
- Allumez l'ordinateur et ouvrez l'instrument de spectroscopie FTIR.
- Ouvrez le logiciel pour la spectroscopie FTIR.
- Aller à 'Measurement → Initialize'. Les rectangles pour 'BS: KBr', 'Lampe: Infrarouge »et« Laser »devient vert lorsque l'initialisation est terminée.
- Choisissez «Données» ci-dessous les rectangles, et sélectionnez '% Transmittance', 'Happ-Genzel', '45', '4.0', et 'min: 400, Max: 4000' pour 'Mode de mesure', 'apodisation', ' Non. des Scans »,« Résolution »et« Range (cm-1).
- Cliquez sur "Mesure".
- Sélectionnez 'Fichier de données »pour les données de base. Écrirebas les commentaires.
- Cliquez sur 'BKG' pour obtenir la ligne de base pour le fond.
- Fixer le papier carré sur le porte-échantillon de film.
- Sélectionnez 'Fichier de données' pour les données de l'échantillon. Notez les commentaires.
- Cliquez sur 'échantillon' pour obtenir les spectres de l'échantillon.
- Fermez l'application de la spectroscopie FTIR et éteindre l'ordinateur.
- Répétez les étapes ci - dessus (étapes 1.1 à 1.6) pour préparer la catégorie no 113 cellulose du papier et des disques (papier de filtre à écoulement rapide) carré amine-fonctionnalisés, et d' obtenir les spectres FTIR pour le grade n ° 113 papier carré (figure 3B).
2. Covalent Immobilisation d'anticorps sur Amine-fonctionnalisés Cellulose Papier Disques
Figure 1. immobilisation covalente d'anticorps par deux méthodes différentes.Un. Les anticorps immobilisés sur des disques de papier de cellulose amine fonctionnalisée par oxydation au periodate. Les résidus d'hydrates de carbone ont été oxydés par le periodate de sodium pour produire des groupes fonctionnels aldéhyde. Ensuite, les anticorps oxydés ont été chargés sur des disques de papier cellulose à fonction amine. B. Les anticorps ont ensuite été immobilisés sur des disques de papier cellulosique à fonction amine par l'intermédiaire du glutaraldéhyde. Les disques de papier de cellulose à fonctionnalité amine ont été immergées dans une solution de glutaraldéhyde à 0,05% pour introduire des groupes aldéhydes aux disques de papier. Après le lavage, les anticorps ont été chargés sur les disques de papier d'aldéhydes fonctionnalisés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Immobiliser des anticorps sur la cellulose des disques de papier à fonction amine par oxydation au periodate (figure 1A).
- Mélanger 1 pi de perioda de sodium à 2,5 mMte avec 2 ul de 0,1 mg / ml d'anticorps de lapin anti-IgG humaine-FITC et 7 ul de 100 mM, pH 5,5 tampon acétate dans un tube de 1,5 ml, et on incube le mélange dans l'obscurité pendant 30 min.
REMARQUE: Suivez ce rapport en volume pour préparer des anticorps plus oxydés si nécessaire. Changer le rapport de volume afin d'optimiser la concentration de periodate de sodium et de l'IgG de lapin-FITC anti-humaine. - Diluer la solution d'anticorps ci-dessus avec 30 pl de 50 mM de solution saline tamponnée au phosphate (PBS; pH 7,4) jusqu'à un volume final de 40 ul.
- Préparer trois disques de papier filtre à moyen débit amine-fonctionnalisés et trois disques de papier rapide flux à fonction amine (comme décrit à la section 1).
- Charge 5 ul du periodate de sodium oxydé lapin IgG anti-humain-FITC une sur l'disque de papier filtre à moyen débit et 8 ul de chaque disque ONTO papier filtre à écoulement rapide. Gardez ces disques de papier dans l'obscurité pendant une heure à température ambiante.
- Laver chacun des disques de papier avec 0,2 ml de lavage chamoiser (tampon Tris 50 mM avec 0,15 M de NaCl et 0,05% d'agent tensioactif, pH 7,4). Répétez le lavage trois fois.
- Photographier les images de fluorescence grâce à un système d' imagerie moléculaire par fluorescence pour identifier la présence d'anticorps sur la cellulose chaque disque de papier 32. Utiliser des disques de papier vierges (traités avec la même concentration d'anticorps en l'absence de periodate de sodium) en tant que témoin (figure S1 à la figure S3).
NOTE: Pour l'optimisation expérimentale, modifier la concentration d'un paramètre qui doit être optimisé et fixer les concentrations de tous les autres paramètres. Une intensité de fluorescence élevée augmente la quantité d'anticorps de capture qui sont immobilisés sur des disques en papier de cellulose.
- Mélanger 1 pi de perioda de sodium à 2,5 mMte avec 2 ul de 0,1 mg / ml d'anticorps de lapin anti-IgG humaine-FITC et 7 ul de 100 mM, pH 5,5 tampon acétate dans un tube de 1,5 ml, et on incube le mélange dans l'obscurité pendant 30 min.
- Immobiliser anticorps sur des disques de papier de cellulose fonctionnalisés amine par glutaraldéhyde (figure 1B).
- Ajouter les trois APS moyen débit traité disques de papier filtre et les trois disques de papier filtre rapide débit (described dans la section 1) à 2 ml de PBS à 50 mM (pH 7,4) contenant 0,05% de glutaraldéhyde pendant 1 heure, sous agitation orbitale à température ambiante.
Attention: Manipuler glutaraldéhyde dans la hotte. - Placez trois disques chacun dans deux tubes de 1,5 ml de centrifugeuse. Ajouter 1 ml de désionisée (DI) à chaque tube et agiter les tubes pendant 10 secondes. Éliminer l'eau par aspiration avec une pipette. Répétez deux fois pour éliminer toute glutaraldéhyde qui n'a pas réagi.
- Charge 5 ul de 25 ug d'IgG-FITC (anticorps de capture) anti-humain / lapin ml sur chaque support d'écoulement disque de papier filtre aldéhyde fonctionnalisé, et ajouter 8 pi sur chaque flux rapide disque de papier filtre aldéhyde fonctionnalisé. Laisser incuber dans l'obscurité pendant environ 20 min à température ambiante. Ensuite, ajouter 10 pi de PBS à 50 mM (pH 7,4) à chaque disque de papier sans enlever les anticorps et on incube pendant 40 minutes pour la réaction de l'aminé aldéhyde.
- Laver les disques de papier avec 0,2 ml de tampon de lavage sur le dessus d'une serviette en papier. Répétez lalaver deux fois.
- Photographier les images de fluorescence grâce à un imageur moléculaire de fluorescence pour vérifier la présence d'anticorps sur chaque disque de papier cellulose 33. Utilisez des disques de papier blanc comme témoin.
REMARQUE: Dans la figure 4, «0» représente le disque de papier vierge qui a été traité avec la même concentration de FITC-anticorps en l'absence de glutaraldéhyde; sur la figure 5A, les disques de papier vierges ont été traités avec du glutaraldéhyde, mais sans FITC-anticorps ont été chargés sur des disques de papier.
- Ajouter les trois APS moyen débit traité disques de papier filtre et les trois disques de papier filtre rapide débit (described dans la section 1) à 2 ml de PBS à 50 mM (pH 7,4) contenant 0,05% de glutaraldéhyde pendant 1 heure, sous agitation orbitale à température ambiante.
- Sécher les disques de papier (de sections 2.1 et 2.2) à 37 ° C pendant 10 min.
- Bloquer les disques en papier avec 15 pi de tampon de blocage (10% de lait écrémé en poudre dans du tampon Tris 50 mM, pH 7,4, avec 0,15 M de NaCl) pendant 10 min à température ambiante.
- Charge 5 pi et 8 pi de conjugué à la peroxydase de chèvre anti-IgG de lapin dans du PBS (1: 10000) sur un milieu d'écoulement et des disques de papier filtre à écoulement rapide, respectivement. Incuber30 min dans l'obscurité à la température ambiante.
- Laver les disques de papier avec 0,2 ml de tampon de lavage sur le dessus d'une serviette en papier. Répétez le lavage trois fois.
NOTE: Il est nécessaire de retirer le tampon de lavage que les résultats ne sont pas affectés par le tampon. - Charger un mélange de 10 ul de 3,3 ', 5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) et d'une solution de peroxyde d'hydrogène sur chaque disque.
- Prenez des images des disques de papier avec un appareil photo numérique ou un téléphone intelligent après 5 min d'incubation.
REMARQUE: Dans la figure 5B, «0» représente les disques de papier qui ont été traités avec du glutaraldéhyde, puis en chargeant un anticorps HRP (peroxydase de raifort) conjugué en l'absence de FITC-anticorps.
3. Papier à base ELISA pour la détection des IgG
Figure 2. Représentation schématique de l'ELISA à base de papier-foles anticorps de détection. capture r IgG ont été immobilisés de manière covalente sur les disques de papier de cellulose fonctionnalisée par le biais de l' aldéhyde du glutaraldéhyde. Les disques de papier de cellulose ont été bloquées avec un tampon de blocage. Cible d'IgG a ensuite été ajouté aux disques, suivi par le chargement d'anticorps de signal HRP-conjugué. Enfin, la solution TMB et le mélange de peroxyde d'hydrogène a été chargé sur chaque disque de papier pour la lecture de la couleur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Ajouter 5 ml de solution de glutaraldéhyde à 0,05% (préparé dans un tampon de 50 mM de PBS, pH 7,4) dans un flacon en verre de 20 ml. Immergez 15 moyen d'écoulement des disques de papier filtre à fonction amine dans cette solution et maintenir pendant 1 heure en agitant à la température ambiante.
- En même temps, répétez l'étape 3.1 pour préparer un autre 15 aldéhyde disques de papier filtre rapide flux fonctionnalisés.
Attention: Manipuler glutaraldéhyde dans les fuméescapuche.
- En même temps, répétez l'étape 3.1 pour préparer un autre 15 aldéhyde disques de papier filtre rapide flux fonctionnalisés.
- Pour supprimer glutaraldéhyde n'a pas réagi à partir des disques de papier, placez les 15 moyen d'écoulement des disques de papier filtre dans un tube de 15 ml de centrifugation, et les disques de papier filtre 15 fast-flux dans un autre tube de 15 ml de centrifugeuse. Ajouter 5 ml d'eau DI à chaque tube et agiter les tubes pendant 10 secondes. Éliminer l'eau par aspiration avec une pipette. Répétez deux fois pour éliminer toute glutaraldéhyde qui n'a pas réagi.
- Sécher les disques de papier dans un four à 37 °.
- Ajouter 5 pi et 8 pi de ml d'anticorps de fragments de 0,025 mg / souris IgG-Fc à chacun des moyens d'écoulement et de papier filtre à écoulement rapide des disques, respectivement, et incuber pendant 20 min.
- Ajouter 10 pi de PBS à 50 mM (pH 7,4) à chaque disque de papier sans enlever les anticorps et on incube pendant 40 minutes pour la réaction de l'aminé aldéhyde.
- Laver les disques de papier avec 0,2 ml de tampon de lavage sur le dessus d'une serviette en papier. Répétez le lavage trois fois.
- Sécher les disques de papier dans un four à 37 ° C.
- Bloquer les disques de papier wvec 15 pi de tampon de blocage pendant 10 min à température ambiante.
- Laver chaque disque de papier avec 0,2 ml de tampon de lavage sur le dessus d'une serviette en papier. Répétez le lavage trois fois.
- Exécutez les normes IgG.
- Charge 10 ul de diverses concentrations d' IgG (par exemple, 0, 10, 125, 250 et 500 ng / ml dans le PBS) sur chaque disque en trois exemplaires. Incuber pendant 1 heure à température ambiante.
- Laver les disques de papier avec 0,2 ml de tampon de lavage sur le dessus d'une serviette en papier. Répétez le lavage trois fois.
- Charge 10 pi d'anticorps de souris conjugué à HRP d'IgG fragment Fc (1: 10 000, 10 mM de PBS, pH 7,4) et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
- Laver les disques de papier avec 0,2 ml de tampon de lavage sur le dessus d'une serviette en papier. Répétez le lavage trois fois.
NOTE: Il est nécessaire de retirer le tampon de lavage que les résultats ne sont pas affectés par la présence de tampon. - Charger un mélange de 10 pi de TMB et du peroxyde d'hydrogène sur chaque disque.
- Timages ake de tous les disques de papier avec un appareil photo numérique ou un téléphone intelligent après 5 min d'incubation.
REMARQUE: Dans la figure 6A, «0» représente des disques en papier traités avec des anticorps de capture immobilisation et la solution d' anticorps-HRP / TMB sans sérum IgG. - Analyser l'intensité de chaque disque de papier dans l'image par J. Image
- Convertir les images prises à l'étape 3.15 au format «.tif».
- Ouvrez le logiciel «Image J».
- Aller à 'Fichier → Ouvrir', choisir l'image à analyser.
- Cliquez sur le bouton de forme 'Oval'.
- Aller à 'image → Type → 32 bits.
- Allez sur 'Modifier → Invert'.
- Allez sur 'Analyser → Mesure.
- Copier et analyser les données dans un tableur.
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Representative Results
Transformer Figure 3. Fourier infrarouge (FTIR) de papier filtre à moyen débit non traité et APS-traité carré (A) et le filtre à écoulement rapide papier carré (B). A. Les spectres pour le filtre à moyen écoulement brut papier carré était similaire à celle de l'APS filtre à moyen débit traité papier carré. L'augmentation des intensités à des bandes de 902-1,170 cm -1 et 1,210-1,500 cm -1 pour le papier carré APS-traité appartenait à Si-O-cellulose et déformations CH des groupes SiOC-H, respectivement. L'accroissement des bandes à 1650 cm -1 et 2885 cm - 1 appartient à la flexion de 2 -NH et CH 2 vibrations de la fraction saline de propyle, respectivement. B. Les pics caractéristiques dans les 972 à 1180 cm -1 gamme ont été attribués à Si-O-Si et SO-ceobligations llulose. Le pic à 1003 cm -1 a été causé par le chevauchement de la liaison Si-O-Si et CO étirement de cellulose. Tous les résultats montrent que l' APS a été greffé avec succès sur les papiers carrés de cellulose. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La présence de groupes fonctionnels amine sur les papiers carrés de cellulose a été déterminée par FTIR. La figure 3 montre les spectres FTIR non traitée, la modification, l' écoulement moyen et rapide flux papiers carrés de filtre. Il y avait trois étapes impliquées dans la modification chimique des groupes aminoalkyle, en utilisant APS sur les surfaces de cellulose. La première étape implique l'hydrolyse de l'APS pour obtenir le dérivé de silanol de l'APS. La deuxième étape implique l'adsorption du dérivé de l'APS hydrolyse sur les fibres de cellulose par des liaisons hydrogène des groupes OH du hydrolyzed APS dérivé et des fibres de cellulose. La troisième étape implique la condensation du dérivé APS adsorbé, ce qui a conduit au greffage du dérivé de l' APS sur la surface de la fibre de cellulose par des liaisons Si-OC et la formation de liaisons Si-O-Si des ponts siloxane 34. Comme on le voit sur la figure 3A, l'augmentation de la bande à 1650 cm -1 a été attribué à la flexion de groupes NH 2 et d' un incrément de la bande à 2885 cm - 1 correspondant à des vibrations CH 2 du groupement propyle silane. Pour le filtre à moyen débit papier carré original, les bandes à 902-1,170 cm -1 et 1,210-1,500 cm -1 correspondent aux vibrations des liaisons COC des ponts glycosidiques et CH vibrations d' étirement. Après traitement du papier carré avec APS, l'augmentation de l'intensité de ces deux largeurs de bande indique qu'ils appartiennent à Si-O-cellulose et déformations CH des groupes SiOC-H, respectivement. Semblable à moyen flow papier filtre carré, les spectres de papier filtre rapide débit modifié carré également augmenté en intensité à 1.650 cm -1 pour -NH 2, en raison de la modification chimique avec APS (figure 3B). Les forts pics caractéristiques dans les 972 à 1180 cm -1 gamme ont été attribués à Si-O-Si et les obligations SO-cellulose; le plus haut sommet était à 1,003 cm -1 en raison du chevauchement de la liaison Si-O-Si et le CO étirement de la cellulose 34. Les obligations caractéristiques de la gamme de longueur d' onde entre 1188 et 1510 cm -1 pour APS traités papier carré sont causées par les vibrations des liaisons COC des ponts glycosidiques et CH vibrations d' étirement. Les CH 2 liaisons de vibration d' étirement ont été présentés à 2,800-2,980 cm -1 et le plus haut sommet est à 2932 cm -1 pour l'APS traité papier carré. En conclusion, l'APS peut être covalente greffée no 1 et no 113 papiers carrés de filtre.
Figure 4. Fluorescence réponses à différentes concentrations de glutaraldéhyde dans l'immobilisation des IgG-FITC sur les disques de papier (Méthode B) Réglages pour la fluorescence d' imagerie moléculaire:. Excitation, 488 nm, émission, 530 nm, la résolution 100 micromètres A:. Fluorescence réaction à 0, 0,001%, 0,005%, 0,01% et 0,050% de glutaraldéhyde . B: réponse de fluorescence à 0, 0,050%, 0,100%, 0,250% et 0,500% de glutaraldéhyde. La concentration en IgG-FITC sur chaque disque était de 0,01 mg / ml. Une augmentation de la concentration de glutaraldéhyde à un maximum de 0,05% a donné lieu à une plus grande quantité de charge d'une IgG-FITC. Les concentrations de glutaraldéhyde supérieure à 0,05% ont diminué la quantité de chargement d'IgG-FITC. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cettefigure.
Figure 5. Réponse de Fluorescence (A) et le résultat colorimétriques (B) de différentes concentrations d'IgG-FITC sur le moyen-débit IgG-FITC-immobilisé et disques rapide flux papier filtre (Méthode B) Réglages pour imageur moléculaire de fluorescence:. Excitation , 488 nm, émission, 530 nm, la résolution 100 micromètres. # 1 représente la catégorie no 1, moyen-débit disque de papier filtre, et n ° 113 représente la catégorie no 113 fast-flux disque de papier filtre. des disques de papier APS modifiés ont été traités avec 0,05% de glutaraldéhyde en premier. Ensuite, différentes concentrations d'IgG-FITC ont été chargées sur les disques de papier de glutaraldéhyde modifié. Augmentation de la concentration de charge de l'IgG-FITC a augmenté la quantité de l'IgG-FITC immobilisés sur des disques de papier. Cependant, l'augmentation des concentrations d'IgG-FITC immobilisé n'a pas amélioré la capacité de liaison à l'antigène. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Le flux de travail de base pour l'immobilisation covalente d'anticorps sur des disques de papier de cellulose à fonctionnalité amine est représentée sur la figure 1. Le lapin anti-IgG humaine-FITC a été immobilisé de manière covalente sur les disques de papier de cellulose. La fluorescence à partir des disques de papier indique l'immobilisation des anticorps dirigés contre les disques de papier et l'intensité de la fluorescence est directement proportionnelle à la concentration d'anticorps immobilisés. Peroxydase de chèvre conjugué IgG anti-lapin a ensuite été appliqué pour déterminer la capacité de liaison des anticorps immobilisés. Des groupes amine secondaire et des groupes aldéhyde peuvent réagir les uns avec les autres pour former une base de Schiff, qui a été utilisé dans 35 bioconjugaison. Ils ont également été utilisés ici pour l'immobilisation covalente de capturedes anticorps. Dans le procédé A (figure 1A), -NH 2 a été introduit dans les disques de papier et de la cellulose -CHO est dérivée de l'anticorps de lapin anti-IgG humaine-FITC par oxydation de la région Fc des anticorps avec du periodate de sodium. De la même manière, les effets de diverses concentrations de périodate de sodium, et des anticorps IgG-FITC ont également été analysées. Comme on le voit sur la figure S1 et la figure S2, le periodate de sodium à partir des concentrations de 0 à 1 mM et de lapin anti-IgG humaine-FITC 0,016 à 0,16 mg / ml avait peu d' effet sur l'oxydation de l' IgG 0,08 mg / ml de lapin anti-humain FITC. La quantité d'anticorps qui sont liés de manière covalente aux disques de papier a augmenté avec une concentration croissante d'anticorps de capture de 0 à 0,075 mg / ml (figure S3A).
Un changement de couleur faible a été observé lorsque la capacité de liaison a été déterminée par le dosage de la peroxydase. Cela peut être dû à l'utilisation depériodate de sodium en excès, qui réagit avec les anticorps de capture et entraîne une perte d'activité de liaison. Il est probable que le periodate de sodium ne peut pas être complètement éliminé par lavage des disques de papier. Cela a été confirmé par le principe simple que la solution de periodate de sodium fournit une couleur jaune lorsqu'il est mélangé avec une solution de purpald. Par conséquent, les anticorps periodate oxydé ont été chargés sur des disques de papier et mis à incuber pendant 1 heure. Les disques de papier ont été lavés trois fois avec du PBS (contenant 0,05% de tween-20), puis une solution purpald ont été ajoutés à ces disques. Les disques de papier ont montré une coloration pourpre immédiatement, ce qui indique la présence de groupes aldéhyde à partir d'anticorps de periodate oxydé. Cette couleur pourpre à jaune changé en 10 minutes, ce qui a confirmé la présence de periodate de sodium sur les disques de papier.
En variante, on a utilisé une reticulation par le glutaraldéhyde méthode (méthode B, figure 1B) pour relier le grou amineps à partir des disques et des anticorps papier APS-traité. Les concentrations de glutaraldéhyde (figure 4) et de lapin anti-IgG humaine-FITC (figure 5A) qui ont été chargés sur des disques de papier de cellulose ont été optimisés. Comme on le voit sur la figure 4, l'intensité de fluorescence atteint un maximum de 0,05% de glutaraldéhyde, ce qui signifie que le chargement de lapin anti-IgG humaine-FITC est saturé sur le disque de papier de cellulose à cette concentration; une augmentation de la concentration en glutaraldéhyde à 2,5% n'a pas montré une augmentation de la quantité de lapin anti-IgG humaine-FITC sur les disques de papier de cellulose (figure S4). L'intensité de fluorescence augmentait également avec des concentrations croissantes de l' IgG de lapin-FITC anti-humain qui ont été chargés sur des disques de papier (figure 5A). Une couleur bleue développée immédiatement après l'addition de la solution du mélange du substrat et du peroxyde d'hydrogène TMB dans les disques de papier qui contenait les peroxidase anticorps conjugués de détection (figure 5B). En outre, le tampon de blocage qui contenait 10% de lait écrémé en poudre a été montré pour conserver l'efficacité de blocage après 15 lavages (Figure S5). La méthode B a été choisie pour tester l'application des anticorps immobilisés, comme il a démontré une activité accrue de liaison à sa cible. Par conséquent, une concentration de 0,025 mg / ml d'anticorps de capture a été utilisé pour la détection des IgG.
Figure 6. Les courbes d'étalonnage pour la détermination des IgG par ELISA à base de papier. # 1 représente la catégorie no 1, moyen-débit disque de papier filtre, et n ° 113 représente la catégorie no 113 fast-flux disque de papier filtre. Le panneau supérieur A présente l'affichage de la couleur pour moyen débit (# 1) et fast-flux (# 113) des disques de papier de cellulose avec différentes concentrations d'IgG. Le panneau inférieurB présente les résultats ELISA pour différentes concentrations en IgG. Triplicats ont été utilisés pour déterminer l'écart - type (SD). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
De chèvre anti-IgG de souris-Fc fragment d'anticorps de capture, le sérum IgG et anticorps de chèvre anti-IgG de souris-Fc fragment d'anticorps conjugué à la HRP ont été utilisés pour l'essai en sandwich. Comme on le voit sur la figure 6 et la figure S6, la concentration de sérum d' IgG de 0 à 500 ng / ml a une relation linéaire avec l' intensité colorimétrique lorsque chaque étape a été mis en incubation pendant 1 heure. Sur la figure S6, la variation de couleur avec différentes concentrations d'IgG était évidente pendant 1 heure d'incubation. Or, les résultats de 10 minutes d'incubation n'a pas montré une altération évidente de l'intensité des couleurs avec différentes concentrations d'IgG. Ainsi, les sensibilité de cette ELISA sur papier était approprié pour le développement des essais pratiques au point de soins.
La figure S1. Réponses de fluorescence à différentes concentrations de periodate de sodium (méthode A). Des concentrations variables de périodate de sodium ont été mélangés avec des anticorps de lapin anti-IgG humaine-FITC à une concentration de 0,016 mg / ml et utilisé pour l'étude de l' activité d'oxydation de l' anticorps. En augmentant la concentration de périodate de sodium, la quantité de chargement d'une IgG-FITC a augmenté et a atteint un maximum à 0,25 mm. On a observé que les concentrations de périodate de sodium qui étaient plus élevés que celui-ci n'a pas augmenté la quantité d'IgG-FITC immobilisée. Triplicats ont été utilisés pour déterminer l'écart - type (SD). S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.
La figure S2. Réponse de fluorescences à différentes concentrations de lapin anti-IgG humaine-FITC (méthode A). La concentration de périodate de sodium était de 0,25 mM dans la solution pour l'étude de l' activité d'oxydation de l' anticorps, et la concentration finale de lapin anti-IgG humaine-FITC sur chaque disque était de 0,016 mg / ml. Lorsque la concentration de periodate de sodium a été fixée, la concentration en IgG-FITC a eu peu d'effet sur l'oxydation des IgG-FITC. Triplicats ont été utilisés pour déterminer l'écart - type (SD). S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.
La figure S3. Réponse de fluorescence et le résultat colorimétrique de chargement différentes concentrations de lapin oxydé IgG anti-humain-FITC sur les disques de papier (méthode A). Pour l' oxydation du périodate de sodium, 0,08 mg / ml de periodate de sodium IgG-FITC et 0,25 mM ont été utilisées. La dilution du conjugué à la Peroxydase IgG anti-lapin était1: 50.000. L' augmentation de la concentration de chargement des IgG-FITC sur les disques de papier de cellulose a augmenté la quantité d'IgG immobilisée-FITC, mais n'a pas eu d'effet sur la liaison cible. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure S4. Réponse de fluorescence aux concentrations élevées de glutaraldéhyde dans l'immobilisation d' une IgG-FITC sur les disques de papier de cellulose (Méthode B). La concentration en IgG-FITC sur chaque disque était de 0,01 mg / ml. Les concentrations de glutaraldéhyde qui étaient supérieurs à 0,25% n'a pas augmenté la quantité d'IgG immobilisée-FITC sur les disques de papier de cellulose. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.
La figure S5. Effet du nombre de fois de lavage. A: a. hing trois fois B: lave 15 fois. Anticorps de capture immobilisés sur le papier carré de cellulose avaient encore une bonne capacité de liaison à leurs cibles, même si le papier carré a été tourbillonné 15 fois. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure S6. Résultat ELISA pour IgG à base de papier. Pour les concentrations d'IgG de 0 à 500 ng / ml, les résultats d'une heure d'incubation sont meilleurs que les résultats de 10 minutes d'incubation. Pour des concentrations élevées d'IgG, 10 minutes est assez de temps pour l'incubation. Triplicats ont été utilisés pour déterminer l'écart - type (SD). S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure S7. La microscopie électronique à balayage (SEM) images de papier filtre à moyen débit à différents grossissements. A: 85X et B: 20,000X. La microscopie électronique à balayage à émission de champ (FE-SEM) fonctionnant à 5 kV a été utilisé pour déterminer la morphologie des particules. Les fibres de cellulose sont aléatoirement réticulé. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure S8. Images MEB de papier filtre à écoulement rapide à différents grossissements. A: 100X et B: 20,000X. La microscopie électronique à balayage à émission de champ (FE-SEM) fonctionnant à 5 kV a été utilisé pour déterminer la morphologie des particules. Les fibres de cellulose sont aléatoirement réticulé. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
le revêtement direct de chèvre purifié par affinité anti-Souris IgG-Fc de l'anticorps de capture sur des disques de papier de cellulose non modifié a été réalisée pour détecter les concentrations d'IgG. Les résultats indiquent que, outre la fixation des anticorps de capture est nécessaire pour la reproductibilité. La technique de silane a été utilisé avec succès pour introduire des groupes fonctionnels amine sur les disques de papier de cellulose 34. La concentration de l'APS affecte l'immobilisation d'anticorps. Par conséquent, la quantité d'APS dans de l'acétone a également été optimisé. 1 ml d'APS dans 10 ml d'acétone a été une concentration optimale pour le greffage du groupe amine pour l'immobilisation d'anticorps par un agent de réticulation glutaraldéhyde. Les anticorps ont été greffées sur des disques de papier de cellulose par oxydation periodate et de glutaraldéhyde procédés de reticulation. Nos résultats ont montré que la capacité de liaison des anticorps immobilisés par l'intermédiaire du procédé de réticulation au glutaraldéhyde est meilleur que le procédé d'oxydation au périodate pour medium-débit et des disques de papier-filtre débit rapide. En outre, des anticorps de capture, qui ont été immobilisés sur des disques de papier de cellulose par un procédé de reticulation par le glutaraldéhyde, ont conservé leur fonction et sont immobilisés de manière stable même si le document est soumis à la contrainte mécanique de 15 lavages par tourbillonnement. Dix pour cent du tampon de blocage du lait écrémé en poudre a été trouvée pour conserver son efficacité de blocage après 15 lavages (figure S5).
Les anticorps immobilisés de façon covalente ont été utilisés pour effectuer une analyse ELISA en sandwich avec la détection des IgG. IgG à une concentration de 100 ng / ml a été détectée à l'oeil nu en utilisant ce dosage à base d'un disque de papier. La concentration d'IgG de sérum de 0 à 500 ng / ml a montré une relation linéaire avec l'intensité colorimétrique, lors de chaque étape a été mis en incubation pendant une heure. Les tests de dosage immunologique pour ce disque de papier à base ELISA nécessaire moins réactif de l' échantillon et semble être plus efficace que des immunoessais classiques 36 figure S7 et S8 figure, respectivement. Comme cela est illustré sur ces figures, les fibres sont de manière aléatoire réticulé pour les deux types de disques de papier filtre 25. La raison de cette sensibilité élevée peut être l'épaisseur du disque de papier. Pour les disques de papier filtre rapide écoulement de l'épaisseur est de 420 um par rapport à 180 um pour papier filtre à moyen débit. Ainsi, plusieurs anticorps de capture étaient susceptibles d'être immobilisé sur des flux rapide des disques de papier filtre, ce qui augmenterait encore la sensibilité du dosage. Dans le même temps, la taille des pores pour les disques de papier filtre à écoulement rapide (30 pm) était plus grande que celle des disques de papier filtre moyen d'écoulement (11 & #181; m). Après blocage de la surface du papier, la taille des pores de la première est encore assez grande pour entraîner un écoulement de liquide sans un système d'alimentation d'appoint. Cependant, la vitesse d'écoulement pour le tampon dans celui-ci a été plus lente. Par conséquent, le papier filtre à écoulement rapide était mieux que du papier filtre à moyen débit dans l'application des immunoessais.
La reproductibilité des anticorps sur les disques de papier filtre immobilisés a été évaluée par une incubation des disques de papier avec un conjugué à la peroxydase de chèvre anti-IgG de lapin et la détection du résultat colorimétrie après le chargement de la solution du mélange du substrat et du peroxyde d'hydrogène TMB. L'écart type était inférieur à 10% pour ce dispositif à base de papier. La stabilité de lapin anti-IgG humaine-FITC sur les -NH2 disques en papier de cellulose modifiée a été testée pendant deux mois. Les disques de papier qui ont été stockés à 4 ° C ont conservé leur activité de liaison à la peroxydase de chèvre conjugué IgG anti-lapin avec une légère diminution de leur binding activité. Cependant, lorsque les disques de papier d'anticorps immobilisés ont été stockés à température ambiante ou à 60 ° C, ils ont perdu leur activité de liaison en raison de la sécheresse et une température élevée. Les anticorps capturés auraient déstabilisé et dénaturé dans ces conditions.
Il y a certaines étapes critiques dans l'immobilisation d'anticorps de capture sur les disques de papier de cellulose à l'aide de glutaraldéhyde comme agent de réticulation. Etape 1.2 à greffer des groupes amines sur les disques de papier est une étape critique dans l'immobilisation covalente avec succès des anticorps de capture. Si cette étape échoue, le processus d'immobilisation entière échouera. FTIR a été utilisé pour déterminer si des groupes amine ont été immobilisées avec succès sur les disques de papier (étape 1.6). D'autre part, le greffage de groupes aldéhyde sur les disques de papier de cellulose est une étape critique (étape 2.2.1 et à l'étape 3.1). Les anticorps ont été immobilisés de manière covalente sur des disques de papier de cellulose par la formation d'une base de Schiff. finalement, L'étape d'immobiliser des anticorps de capture sur les disques de papier filtre est important (étape 2.2.3, étape 3.4, et l'étape 3.5). Les groupes amines des anticorps de capture ayant réagi avec les groupes aldéhydes à partir des disques en papier de cellulose pour fixer les anticorps sur des disques de papier. Si cette étape a échoué, des anticorps de capture ne seraient pas immobiliser sur les disques de papier et tous les tests d'application ELISA serait négatif. Nous pouvons utiliser un imageur moléculaire de fluorescence pour déterminer la présence d'anticorps de capture. Conjugué à la Peroxydase de chèvre anti-IgG de lapin et les réactions colorimétriques à la peroxydase peut être utilisé pour confirmer la capacité de liaison des anticorps immobilisés.
Ce protocole peut rencontrer certains problèmes, comme un bruit de fond élevé au signal, aucun signal ou un signal faible, et une lecture de couleur inégale. Les causes possibles de ces problèmes et méthodes de dépannage pour surmonter ces problèmes sont discutés ci-dessous. signaux de fond élevés se produisent habituellement due à un temps de blocage court. Ceci peut être résolu en augmentant le temps d'incubation de blocage, le lavage des disques de papier à fond, et en évitant l'addition d'un excès de détection conjugué anticorps enzyme pour éliminer les bruits de fond élevés. Les causes possibles incluent l'absence de l'antigène cible, au-dessus de blocage insuffisant temps d'incubation, et un anticorps de détection conjugué enzyme non fonctionnelle. Pour surmonter ces problèmes, les antigènes cibles doivent être ajoutés et mis à incuber pendant une période de temps convenable en utilisant un nouveau conjugué d'anticorps et de son stockage comme suggéré par le fabricant. Il est souhaitable d'inclure un témoin positif pour la détection. affichages de couleur non uniforme sont dues à l'empilement des disques de papier au cours du procédé de greffage. Pour éviter ce problème, les disques de papier doivent être séparés pendant le procédé de greffage APS, et l'antigène et la détection de l'anticorps conjugué de l'enzyme doivent être répartis de manière uniforme sur le disque de papier à chaque étape.
Bien que le test à base de papier est un simpleet méthode rentable, il y a des limites. L'orientation des anticorps sur la surface du substrat est critique pour la performance de l'analyse immunologique, comme agent de réticulation glutaraldéhyde réagit avec les groupes aminés de la région Fab et de la région Fc des anticorps de capture. Ainsi, les anticorps immobilisés ne se produisent pas d'une manière hautement orienté. Etant donné qu'il existe plusieurs groupes amine de la région Fab que de la région Fc des anticorps IgG, l'activité de liaison des anticorps immobilisés est encore assez élevé pour leur application.
Différentes méthodes de fonctionnalisation de surface pour le papier de cellulose ont été résumées dans un rapport récent 37. Des réactifs tels que le divinylsulfone; 1,4-phenylenediisothiocyanate; 4-azido-benzènediazonium; épichlorhydrine; 4-azido-a-fluoro-2-nitrocyclohexane; et le 4-mercapto- benzènediazonium, pourrait être utilisée pour immobiliser de manière covalente de biomolécules sur du papier de cellulose. Adsorption et de piégeage ont également été utiliséspour enduire le papier de cellulose avec des biomolécules. Par rapport aux autres procédés, la combinaison de la technique à base de silane et l'agent de reticulation par le glutaraldéhyde pour l'immobilisation covalente d'anticorps sur du papier de cellulose est une méthode simple. En outre, cette combinaison peut avoir peu d'effet sur la performance thermique et mécanique du papier de cellulose, ce qui permet l'écoulement vertical maximum dans les immunoessais. Cette stratégie pourrait être étendue à d'autres biomolécules immobiliser sur le papier de cellulose.
La méthodologie démontrée ici pourrait être étendue à la détection d'un analyte quelconque, aussi longtemps que des anticorps directs contre elle sont disponibles. Cette méthode peut également être utilisée pour développer une détection multiplex. Par exemple, sur un carré de papier, différentes zones peuvent être distinguées pour diverses cibles. Les anticorps de capture pour les cibles peuvent être immobilisées par un glutaraldéhyde agent de reticulation sur leur surface spécifique. Ceci peut être suivi par les ELISUne méthode pour détecter différentes cibles. Ainsi, la méthode proposée permet le dosage ELISA d' un outil polyvalent à base de papier pour la détection d'autres cibles en utilisant l'œil nu.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellulose filter paper, Grade 1 (medium flow filter paper) | GE Healthcare Pte Ltd Singapore | 1001 110 | |
| Cellulose filter paper, Grade 113 (Fast flow filter paper) | Sigma-Aldrich, Singapore | 1113-320 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Singapore | G6257 | Grade II, 25% in H2O |
| Surfactant | Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore | P2287 | |
| Bovine serum album | Sigma-Aldrich, Singapore | A2153 | |
| Skimmed milk powder | Louis François | Packed by Kitchen Capers, Singapore | |
| Tris base | Promega | H5135 | |
| Sodium periodate | Merck | 106597 | |
| Na2HPO4 | Merck | 106585 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| NaCl | CALBIOCHEM | 567441 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| HCl | Merck | 100317 | |
| phosphate buffer saline (PBS) | N/A | N/A | PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol/L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl |
| Acetone | Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore | 9005-68 | |
| Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution | 1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce | 34029 | 1 L |
| Rabbit anti-human IgG-FITC | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2278 | |
| Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2030 | |
| Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131A | |
| Mouse reference serum | Bethyl Laboratories, Inc | RS10-101-5 | 9.5 mg/ml |
| HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131P | |
| Equipment | |||
| Fourier transform infrared spectrophotometer | Shimadzu IR Prestige-21 | N/A | |
| Fluorescence molecular imager | Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore | N/A | |
| Oven | NUVE FN500 | N/A | |
| Turbo mixer VM-2000 | MYC LTD | N/A | |
| ImageJ | RGB, free download | N/A |
References
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