In diesem Manuskript werden periodische Oxidations- und Glutaraldehyd-Vernetzungsmethoden für die kovalente Immobilisierung von Antikörpern auf Papierscheiben vorgestellt. Die Bindungsaktivität von immobilisierten Antikörpern wurde untersucht. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine Glutaraldehyd-Vernetzungsmethode verwendet, um einen neuartigen papierbasierten Immunoassay für den Immunglobulin G (IgG)-Nachweis zu entwickeln.
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Methodenartikel
Kovalente Bindung von Antikörpern an Cellulose Papierscheiben und ihre Anwendungen in der Naked-Augen Kolorimetrische Immunoassays
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dieser Bericht stellt zwei Methoden für die kovalente Immobilisierung von Fänger-Antikörper auf Zellulosefilterpapierqualität No. 1 (mittel-Flow-Filterpapier) Scheiben und Qualität Nr 113 (Fast-Flow-Filterpapier) Discs. Diese Cellulosepapierscheiben wurden gepfropft mit funktionellen Amingruppen durch eine Silan-Kopplungstechnik bevor die Antikörper auf ihnen immobilisiert wurden. Periodat-Oxidation und Glutaraldehyd-Vernetzungsverfahren wurden verwendet, Capture-Antikörper auf den Cellulosepapierscheiben zu pfropfen. Um die maximale Bindungskapazität der Einfang-Antikörper an ihre Ziele nach der Immobilisierung wurden die Wirkungen verschiedener Konzentrationen von Natriumperiodat, Glutaraldehyd und Capture-Antikörper auf der Oberfläche der Papierscheiben wurden, um sicherzustellen, untersucht. Die Antikörper, die an den Amin-funktionalisierte Cellulose-Papierscheiben durch eine Glutaraldehyd-Vernetzungsmittel beschichtet wurden, zeigten Bindungsaktivität an die Ziel verbessert, wenn an die Periodat-Oxidationsverfahren im Vergleich. IgG (in Maus-Referenzserum) wurde als Referenzziel in dieser Studie verwendet, um die Anwendung der kovalent immobilisierte Antikörper durch Glutaraldehyd zu testen. Eine neue Papierbasis, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) wurde für den Nachweis von IgG erfolgreich entwickelt und validiert. Dieses Verfahren erfordert keine Ausrüstung, und es kann 100 ng / ml IgG erkennen. Der Fast-Flow-Filterpapier war empfindlicher als die mittlere Stromfilterpapier. Die Inkubationszeit dieses Tests war kurz und benötigt kleine Probenvolumina. Diese mit bloßem Auge kann colorimetrischen Immunoassays erweitert werden, um andere Ziele zu erkennen, die mit konventionellen ELISA identifiziert werden.
Einleitung
Die Point-of-Care - Tests (POCT) diagnostische Studie ist wichtig für die Entwicklung neuer Strategien für die Therapie, personalisierte Medizin und Pflege zu Hause 1. Cellulose Papiere werden als Plattformen in Immunoassays weit verbreitet, da sie billig sind, zugänglich, und den Nutzern vertraut 2. Darüber hinaus besitzt die poröse Struktur von Cellulose-Papier die Leistung Flüssigkeitsstrom ohne zusätzliche Energieeinwirkung zu fahren. Aufzeichnungen von papierbasierten Bioanalytik kann bereits im 20. Jahrhundert gefunden werden, wenn das Papier Chromatographie zuerst im Jahr 1952. Die am weitesten verbreitete Beispiel ist immunchr....
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Protokoll
1. Verpflanzen funktionellen Amingruppen auf Cellulose Papierscheiben
- Bereiten Sie ein Stück Quadrat Papier mit einer Abmessung von 1 cm × 1 cm und 100 Papierscheiben aus Qualität Nr 1 Zellulosepapier mit einem Durchmesser von 6,0 mm (mittel-Flow-Filterpapier) mit einem Lochdurchschlag.
- Zur Ableitung NH2 - Gruppen auf den Papierscheiben, mischen Sie 1 ml APS und 10 ml Aceton in einem 50 ml - Glasflasche in der Abzugshaube. In Papierscheiben mit dem frisch APS Reagenz - Mischung hergestellt, und Inkubation für 5 Stunden mit Orbital Rühren (200 UpM) bei Raumtemperatur 32.
Vorsicht: Behandeln Sie APS und Aceton in der Ab....
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Ergebnisse
Abbildung 3. Fourier - Transformations - Infrarot (FTIR) Spektren von unbehandeltem und mittleren Stromfilter quadratischem Papier (A)-APS behandelt und schnelle Stromfilter quadratischem Papier (B). A. Die Spektren für unbehandeltes Medium-Flow-Filter quadratischem Papier war ähnlich dem von APS behandelte Medium-Flow-Filter quadrati.......
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Diskussion
Direktbeschichtung von affinitätsgereinigtem Ziege-anti-Maus-IgG-Fc-Capture-Antikörper auf unmodifizierten Cellulosepapierscheiben wurde durchgeführt, um IgG-Konzentrationen nachzuweisen. Die Ergebnisse zeigten, dass es zur weiteren Fixierung der Fänger-Antikörper ist für die Reproduzierbarkeit erforderlich. Das Silan - Technik wurde erfolgreich einzuführen Amin - funktionellen Gruppen zu den Cellulosepapierscheiben 34 eingesetzt. Die Konzentration der APS betrifft die Immobilisierung von Antikörpern. Daher w.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom Bildungsministerium in Singapur durch den Translational and Innovation Grant (MOE2012-TIF-2-G-009) finanziell unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Zellulose-Filterpapier, Klasse 1 (Filterpapier mit mittlerem Durchfluss) | GE Healthcare Pte Ltd Singapur | 1001 110 | |
| Zellulose-Filterpapier, Klasse 113 (Schnellfluss-Filterpapier) | Sigma-Aldrich, Singapur | 1113-320 | |
| Glutaraldehyd | Sigma-Aldrich, Singapur | G6257 | Klasse II, 25% in H2O |
| Tensid | Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapur | P2287 | |
| Rinderserumalbum | Sigma-Aldrich, Singapur | A2153 | |
| Magermilchpulver | Louis Françicedil; OIS | Verpackt von Kitchen Capers, Singapur | |
| Tris-Basis | Promega | H5135 | |
| Natriumperiodat | Merck | 106597 | |
| Na2HPO4 | Merck | 106585 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| NaCl | CALBIOCHEM | ||
| NaOH | Merck | 106462 | |
| HCl | Merck | 100317 | |
| Phosphatpuffersalzlösung (PBS) | N/A | N/A | PBS, mit 137 mmol/L NaCl, 2,7 mmol/L KCl, 8,0 mmol/ L Na2HPO4 und 1,5 mmol/L KH2PO4, wird mit Wasser aufbereitet und auf pH 7,4 mit 0,1 mol/L NaOH oder 0,1 mol/L HCl |
| Aceton | Tee Hai Chem Pte Ltd Singapur | 9005-68 | |
| Mischung aus TMB und Wasserstoffperoxid-Lösung | 1-Stufen-Ultra-TMB-ELISA-Lösung, Thermo Scientific Pierce | 34029 | 1 L |
| Kaninchen Anti-Human-IgG-FITC | TWC/Bio Pte Ltd Singapur | sc-2278 | |
| Peroxidase konjugiertes Kaninchen Anti-Kaninchen-IgG | TWC/Bio Pte Ltd Singapur | sc-2030 | |
| Affinitätsgereinigtes Kaninchen-Anti-Maus-IgG-Fc-Beschichtungsantikörper | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131A | |
| Maus-Referenz serum | Bethyl Laboratories, Inc | RS10-101-5 | 9,5 mg/ml |
| HRP konjugierter Ziegen-Anti-Maus-IgG-Fc-Nachweis-Antikörper | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131P | |
| Equipment | |||
| Shimadzu IR Prestige-21 | N/A | ||
| Fluoreszenz-Molekular-Imager | Pharos FXTM plus Molekular-Imager, Bio-Rad, Singapur | N/A | |
| Ofen | NUVE FN500 | N/A | |
| Turbo-Mischer VM-2000 | MYC LTD | N/A | |
| ImageJ | RGB, kostenloser Download | N/A |
Referenzen
- Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). J. Virol. Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M.
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Nachdrucke und Genehmigungen
