Methodenartikel

Synthese von Wavelength-Verschiebung DNA Hybridisierungssonden durch Verwendung von Photostabile Cyaninfarbstoffe

DOI:

10.3791/54121

⸱

6. Juli 2016

 ,  , 
1Institute of Organic Chemistry, Karlsruhe Institute of Technology

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Photostabile Cyaninfarbstoffe werden an Oligonukleotide gebunden, um die Hybridisierung durch Energietransfer zu überwachen.

Zusammenfassung

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In diesem Protokoll zeigen wir ein Verfahren für die Synthese von 2'-Alkin-Desoxyribonukleinsäure (DNA) Stränge durch automatisierte Festphasensynthese unter Verwendung von Standard-Phosphoramidit-Chemie modifiziert. Oligonukleotide werden nach der Synthese durch zwei neue photo Cyaninfarbstoffen markiert unter Verwendung von Kupfer-katalysierte Klick-Chemie. Die Synthese von Spender und Akzeptor-Farbstoff ist, beschrieben und wird in drei aufeinanderfolgenden Schritten durchgeführt. Mit der DNA wie die umgebende Architektur, diese beiden Farbstoffe laufen einen Energietransfer, wenn sie in die Nähe von Hybridisierung gebracht werden. Daher Annealing von zwei einzelsträngigen DNA-Stränge wird durch eine Veränderung der Fluoreszenzfarbe visualisiert. Diese Farbänderung wird durch Fluoreszenz-Spektroskopie charakterisiert, sondern auch durch die Verwendung eines Hand ultraviolette (UV) Lampe direkt beobachtet werden kann. Das Konzept einer Doppelfluoreszenzfarbe Auslese macht diese Oligonukleotidsonden hervorragende Werkzeuge für die molekulare Bildgebung vor allem, wenn die beschriebene photostable Farbstoffe verwendet. Dadurch Photobleaching der Abbildungssonden verhindert und biologische Prozesse in Echtzeit für einen längeren Zeitraum beobachtet werden.

Einleitung

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Die molekulare Bildgebung stellt eine grundlegende Technik für die in lebenden Zellen biologischen Prozesse verstehen. 1-3 Die Entwicklung von fluoreszierenden Nukleinsäure-basierte Sonden für solche chemisch-biologische Anwendungen ein expandierendes Forschungsgebiet geworden ist. Diese Fluoreszenzsonden müssen einige Anforderungen erfüllen die geeigneten Werkzeuge für Cell Imaging zu werden. Erstens sollten die eingesetzten Farbstoffe Fluoreszenz mit hoher Quantenausbeute aufweisen, große Stokes-Verschiebungen und, was am wichtigsten ist , hohe Photostabilitäten Langzeit - in vivo - Bildgebung zu ermöglichen. Und zweitens sollten sie eine zuverl....

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Protokoll

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Achtung: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Einige der Chemikalien in diesen Synthesen verwendet werden, sind giftig und krebserregend. Bitte verwenden Sie alle geeigneten Sicherheitspraktiken, die typischerweise in der organischen Chemie Laboratorien erforderlich sind, wie zum Beispiel ein Laborkittel, Schutzbrille und Handschuhe zu tragen.

1. Synthese der Farbstoffe

Anmerkung: Beide Farbstoffe können durch die gleichen Reaktionstypen synthetisiert werden , Figur 2 einen Überblick über diese Reaktionen zeigt..

  1. Synthese vo....

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Ergebnisse

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Absorptions- und Fluoreszenzspektren des Einzel- und Doppelstrang - DNA, wie in Figur 4 gezeigt aufgezeichnet.

Die aufgezeichneten Absorptionsspektren (Abbildung 4 rechts) zeigen Absorptionsmaxima λ max bei 465 nm für einsträngige DNA1 (Farbstoff 1) und 546 nm für einsträngige DNA2 (Farbstoff 2). Das angelagerte DNA1_2 (Farbstoff 1 Farbstoff 2) zeigt Maxima bei sowohl 469 nm und 567.......

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Diskussion

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Dieses Protokoll zeigt die komplette Prozedur DNA post-synthetisch über CuAAC durch Azid-modifizierte fluoreszierende Farbstoffe zu kennzeichnen. Dies schließt die Synthese der Farbstoffe und Alkin-modifizierte DNA als auch die Markierungsverfahren.

Die Synthese der Farbstoffe folgende vier Schritte. Alle Produkte können durch eine recht einfache Fällung erhalten werden aufgrund ihrer positiven Ladung und nicht zeitaufwendig Säulenchromatographie benötigt. Die Einführung der Azid-Funktionali.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Die finanzielle Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), das Graduiertenkolleg GRK 2039 (gefördert von der DFG) und KIT gedankt.

....

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Materialien

workupKonzentrationsbestimmung

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
synthesis
4-PicolineSigma Aldrich239615
1,3-DiiodpropanSigma Aldrich238414
AcetonitrilFisher Scientific10660131HPLC-Qualität
EthylacetatFisher Scientific10456870technische
Qualität NatriumazidSigma Aldrich71290Dichlormethan in p.a. Qualität
Fisher Scientific10626642technische
Qualität Indol-3-Carboxaldehyd; 98%ABCRAB112969
Kaliumcarbonat, 99+%Acros424081000
DimethylcarbonatSigma Aldrich517127
N,N-Dimethylformamid, 99,8%, extra trockenes Sieb Acros348435000
NatriumsulfatBernd Kraft12623.46
Ethanol, 99,5%Acros397690010
Piperidin, 99%Acros147181000
DiethyletherFisher Scientific10407830technische
Qualität 2-Phenylindol-3-carboxaldehyd; 97%ABCRAB125050
4-MethylchinolinABCRAB117222
DNA-Synthese
Expedite 8909 Nukleinsäure-SynthesizerAngewandte Biosysteme -
DMT-dA(bz) PhosphoramiditSigma AldrichA111081
DMT-dT PhosphoramiditSigma Aldrich
DMT-dG(dmf) PhosphoramiditSigma AldrichG11508
DMT-dC(bz) PhosphoramiditSigma AldrichC11108
Amidit Verdünnungsmittel für die DNA-SyntheseSigma AldrichL010010
Ultrareines Acetonitril für die DNA-SyntheseSigma AldrichL010400
Cap ASigma AldrichL840000
Kappe BSigma AldrichL850000
CPG dT Säule 1.0  &Mikro; molProligo ReagenzienT461010
CPG dA(bz) Spalte 1.0  &Mikro; molProligo ReagenzienA461010
CPG dG(ib) Spalte 1.0  &Mikro; molProligo ReagenzienG461010
CPG dC(bz) Spalte 1.0  &Mikro; molProligo ReagenzienC461010
Ammoniak (wässrige Lösung) Fluka Analytical318612
Zentrifugalgeräte nanosep 0,45  &Mikro; mPallODGHPC34
5-(Benzylthio)-1H-tetrazol (Aktivator)Sigma Aldrich75666
2'-O-propargyldeoxyuridinphosphoramiditeChem GeneANP-7754<
concentratorChrist
clicking
Tetrakis(acetonitril)kupfer(I)-hexafluorphosphatSigma Aldrich346276
NatriumacetatSigma AldrichS2889
(+)-Natrium-L-ascorbatSigma AldrichA7631
EDTA DinatriumsalzSigma AldrichE5134
TBTA-Ligand - -synthetisiert nach einem Literaturverfahren1
HPLC
HPLC-SystemShimadzu
MALDI-Biflex-IV-SpektrometerBruker Daltonics
LC-318 C18 SäuleSupelcosil via Sigma Aldrich58368<
ND 1000 Spektralphotometernanodrop
Probenvorbereitung und Spektroskopie
Cary 100 BioVarian
Fluoromax-3 FluorimeterJobin-Yvon
1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.
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Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
  2. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev.

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Schlagwörter

FestphasensyntheseClick ChemieEnergietransferFluoreszenzspektroskopieOligonukleotid MarkierungDNA Annealingmolekulare BildgebungAbsorptionsspektroskopie

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