Abstract
이 프로토콜에서는 2'- 알킨의 합성 방법은 포스 표준 화학을 사용하여 자동화 고상 합성에 의해 디옥시리보 핵산 (DNA) 가닥을 변성 보여준다. 올리고 뉴클레오티드 후 합성 구리 촉매 클릭 화학 제를 사용하여 두 개의 새로운 광 안정성 시아닌 염료로 표시되어 있습니다. 모두 도너와 억 셉터 염료의 합성을 설명하고, 세 개의 연속 단계로 수행된다. 이들은 혼성화에 접할 때 주변 구조와 같은 DNA,이 두 염료의 에너지 전달을 겪는다. 따라서, 두 개의 단일 가닥의 DNA 가닥의 어닐링 형광 색의 변화에 의해 가시화된다. 이 색상 변화는 형광 분광 특징뿐만 아니라, 직접적으로 휴대용 자외선 (UV) 램프를 이용하여 관찰 할 수있다. 이중 색상 형광 판독 값의 개념은 이러한 올리고 뉴클레오티드 프로브를 분자 이미징 특히 기재된 포위한 우수한 툴을 만든다tostable 염료가 사용된다. 이에 따라, 이미징 프로브 광표백은 방지되고, 생물학적 과정은 긴 시간주기 동안 실시간으로 관찰 할 수있다.
Introduction
분자 이미징은 살아있는 세포 내에서 생물학적 과정을 이해하기위한 기본적인 기술을 나타냅니다. 1-3 화학적 생물학적 응용 프로그램에 대한 형광 핵산 기반 프로브의 개발이 확대 연구 분야가되고있다. 이 형광 프로브는 세포 이미징에 적합한 도구가 될 몇 가지 요구 사항을 충족해야합니다. 첫째, 적용 염료가 높은 양자 수율과 형광을 전시한다, 큰 스톡스 '변화는, 그리고 가장 중요한 것은, 높은 photostabilities는 생체 내 이미징의 장기를 허용합니다. 그리고 둘째로, 그들은 신뢰할 수있는 형광 판독을 표시해야합니다. 종래 발색단 소광-시스템은 형광 농도의 간단한 변경에 의해 하나의 형광 색의 판독에 기초한다. (4)이 접근법으로 인해 세포 내 성분 또는 낮은 신호대 잡음비의 형광도에 위양성 혹은 위음성 결과의 위험을 부담 때문에 다른 COM에 의해 원치 않는 담금질에ponents. 4
최근 개의 상이한 발색단을 사용하여 이중 형광 색 판독을 표시 "DNA 신호등"의 개념을보고 하였다. 5-6 개념은 형광 변화 셉터 염료 도너 염료의 에너지 전달 (ET)에 기초 컬러 (도 1 참조). 이는보다 안정적인 판독이 가능하여 형광 이미징 프로브를위한 강력한 도구를 제공합니다. 형광 염료를 가진 올리고 뉴클레오티드 라벨링 두 가지 방법에 의해 달성 될 수있다. 염료는 상응하는 개질 된 포스 빌딩 블록을 사용하여 고상에서 화학적 DNA 합성 동안 혼입 될 수있다. (7)이 메소드는 표준 포스 탈 보호 조건 하에서 안정한 염료로 제한된다. 대안으로, 사후 합성 수정 방법은 올리고 뉴클레오티드 화학에 설립되었다. 여기, 우리는 우리의 새로운 사진 중 하나의 합성을 보여테이블 에너지 전달 쌍 8,9 및 아 지드와 알킨 (CuAAC) 사이의 구리 촉매 1,3- 사이클로을 사용하여 DNA의 후 합성 라벨. (10)
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Protocol
주의 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 이 합성에 사용 된 화학 물질 중 일부는 독성 및 발암 성이다. 일반적으로, 실험실 코트를 입고 안전 안경, 장갑 등의 유기 화학 실험실에 필요한 모든 적절한 안전 방법을 사용하십시오.
염료의 1. 합성
. 두 염료가 반응 동일한 유형으로 합성 할 수있다 (2) 이러한 반응의 개요를 보여줍니다 :합니다.
- 1- (3- 아지도 프로필)의 합성 -4- (2- (1- 메틸 -1H- 인돌 -3- 일) 비닐) 피리딘 -1- 윰 아이오다 이드 (염료 1)
- 1- (3- 아이오도 프로필) -4- 메틸 -1- 윰 아이오다 이드의 합성 (도 2a는, 단계 a)
- 녹여 466 mg의 4- 피 콜린 및 5.91 g 20 ML의 헤드 스페이스 바이알에 아세토 니트릴 10 ㎖에 1,3- diiodopropane 및 격벽 캡으로 단단히 밀봉.
- 16 시간 동안 85 ° C까지 가열한다.
- 그 후, RT로 냉각 회전 증발기를 사용하여 감압하에 용매를 제거 할 수있다.
- 잔류 오일을 에틸 아세테이트 20 ㎖를 첨가하고 3 분 동안 120 W의 초음파 욕에서 혼합물을 처리한다.
- 여과하여 형성된 침전물을 수집하고, 에틸 아세테이트로 5 회 세척 하였다. 진공 O의 /의 N에서 고체 제품을 건조시킵니다.
- 1- (3- 아지도 프로필) -4- 메틸 -1- 이움의 합성 (도 2a, b) 단계
- 900 mg의 1- (3- 아이오도 프로필)을 20 ㎖ 헤드 스페이스 바이알에서 아세토 니트릴 12 ㎖ 중의 -4- 메틸 -1- 윰 아이오다 이드를 용해 나트륨 아 지드 376 ㎎을 추가하고, 격벽 캡으로 밀봉한다.
- 16 시간 동안 85 ° C까지 가열한다.
- 그 후, RT로 냉각 감압하에 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거 할 수있다.
- 잔류 물에 디클로로 메탄 15 ML을 추가합니다.
- 여과 제거하고, 생성 된 침전물을 버린다.
- 썩어을 사용하여 감압하에 용매를 제거진 증발기 갈색 오일로서 생성물을 얻었다.
- 1- 메틸 -1H- 인돌 -3- 카르 브 알데히드의 합성 (도 2a를 참조하면, 단계 c)
- 불활성 기체 (아르곤) 하에서, 환류 응축기가 장착 된 플라스크 둥근 바닥 50 ml를 10 ml의 절대 디메틸 포름 아미드 1.45 g 인돌 -3- 카르 브 알데히드, 1.52 g의 탄산 칼륨 및 2.70 g의 디메틸 카보네이트를 녹인다.
- 19 시간 동안 130 ℃에서 혼합물을 교반한다.
- 다음, 실온으로 냉각 얼음의 혼합물을 부어 할 수 있습니다.
- 수성 층을 150 ㎖의 에틸 아세테이트로 3 회 추출한다.
- 유기 층을 합하여 물로 세척하고 황산나트륨상에서 건조하고이를 감압하에 회전 증발기를 사용하여 50 ℃에서 용매를 제거한다.
- 커플 링 1- (3- 아지도 프로필) -4- (2- (1- 메틸 -1H- 인돌 -3- 일) 비닐) 피리딘 -1- 윰 아이오다 이드 (염료 1) (도 2a, 단계 d)
- 아르곤 하에서 수분의 배제에 따라 작업 할 수 있습니다. Dissol환류 응축기를 갖춘 플라스크 둥근 바닥 20 ㎖에 4 ㎖의 에탄올 중의 90 mg의 1- (3- 아지도 프로필) -4- 메틸 -1- 이움 및 48 mg의 1- 메틸 -1H- 인돌 -3- 카르 브 알데히드를했습니다.
- 4 시간 동안 80 ° C로 0.07 ㎖의 피 페리 딘과 열을 추가합니다.
- RT로 냉각 할 수 있습니다.
- 여과하여 생성 된 침전물을 수집하고, 디 에틸 에테르로 3 회 세척 하였다.
- 상층 액에 디 에틸 에테르를 추가하고 여과에 의해 생성 된 침전물을 수집합니다. 디 에틸 에테르로 3 회 씻는다.
- 침전물을 결합합니다.
- 1- (3- 아이오도 프로필) -4- 메틸 -1- 윰 아이오다 이드의 합성 (도 2a는, 단계 a)
- 1- (3- 아지도 프로필)의 합성 -4- (2- (1- 메틸 -2- 페닐 -1H- 인돌 -3- 일) 비닐) 퀴놀린 -1- 윰 아이오다 이드 (염료 2)
- 1- (3- 아이오도 프로필) -4- 메틸 퀴놀린 -1- 윰 아이오다 이드의 합성 (도 2b는, 단계 a)
- 녹여 715 mg의 4- 메틸 퀴놀린 및 5.91 g 20 ML의 헤드 스페이스 바이알에 아세토 니트릴 10 ㎖에 1,3- diiodopropane 및 격벽 캡으로 단단히 밀봉.
- 열16 시간 동안 85 ° C이다.
- 그 후, RT로 냉각 감압하에 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거 할 수있다.
- 남은 오일을 에틸 아세테이트 20 ㎖를 첨가하고 3 분 동안 120 W의 초음파 욕에서 혼합물을 처리한다.
- 여과하여 형성된 침전물을 수집하고, 에틸 아세테이트로 5 회 세척 하였다. 진공 O의 /의 N에서 고체 제품을 건조시킵니다.
- 1- (3- 아지도 프로필) -4- 메틸 퀴놀린 -1- 이움의 합성 (도 2b를 참조하면, 단계 b)
- 900 mg의 1- (3- 아이오도 프로필)을 20 ㎖ 헤드 스페이스 바이알에서 아세토 니트릴 12 ㎖ 중의 -4- 메틸 퀴놀린 -1- 윰 아이오다 이드를 용해 나트륨 아 지드 333 ㎎을 추가하고, 격벽 캡으로 밀봉한다.
- 16 시간 동안 85 ° C까지 가열한다.
- 그 후, RT로 냉각 감압하에 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거 할 수있다.
- 잔류 물에 디클로로 메탄 15 ML을 추가합니다.
- 여과 제거하고, 생성 된 침전물을 버린다.
- 용매 유를 제거파인더 갈색 오일로서 생성물을 수득하는 회전 증발기를 사용하여 압력을 감소시켰다.
- 1- 메틸 -2- 페닐 -1H- 인돌 -3- 카르 브 알데히드의 합성 (도 2b를 참조하면, 단계 c)
- 불활성 기체 (아르곤) 하에서, 환류 응축기가 장착 된 플라스크 둥근 바닥 50 ml를 10 ml의 절대 디메틸 포름 아미드 1.45 g -2- 페닐 -1H- 인돌 -3- 카르 브 알데히드, 0.996 g의 탄산 칼륨 및 1.77 g의 디메틸 카보네이트를 녹인다.
- 19 시간 동안 130 ℃에서 혼합물을 교반한다.
- 다음, 실온으로 냉각 얼음의 혼합물을 부어 할 수 있습니다.
- 수성 층을 150 ㎖의 에틸 아세테이트로 3 회 추출한다.
- 유기 층을 합하여 물로 세척하고 황산나트륨상에서 건조하고이를 회전 증발기를 사용하여 감압하에 용매를 제거한다.
- 1- (3- 아지도 프로필)에 커플 링 -4- (2- (1- 메틸 -2- 프 피닐 -1H- 인돌 -3- 일) 비닐) 퀴놀린 -1- 윰 아이오다 이드 (도 2b를 참조하면, 단계 d)
- 인수에서 작업에 수분의 배제 아래. 플라스크 둥근 바닥 구비 한 20ml에 90 mg의 1- (3- 아지도 프로필) -4- 메틸 퀴놀린 -1- 이움 및 59.7 mg을 1- 메틸 -2- 페닐 -1H- 인돌 -3- 카브 알데하이드 4 ml의 에탄올에 녹여 환류 응축기.
- 4 시간 동안 80 ° C로 0.06 ㎖의 피 페리 딘과 열을 추가합니다.
- RT로 냉각 할 수 있습니다.
- 여과에 의해 생성 된 침전물을 수집하고 디 에틸 에테르로 3 회 세척한다.
- 상층 액에 디 에틸 에테르를 추가하고 여과에 의해 생성 된 침전물을 수집합니다. 디 에틸 에테르로 3 회 씻는다.
- 침전물을 결합합니다.
- 1- (3- 아이오도 프로필) -4- 메틸 퀴놀린 -1- 윰 아이오다 이드의 합성 (도 2b는, 단계 a)
DNA의 가닥 2. 합성
주 : DNA 합성기에서 M. Caruthers (11)에 의해 설명 된 것처럼 DNA 가닥의 합성은 고체상에서 포스 방법을 사용하여 수행된다. 신디사이저의 기능은 합성 절차 전에 테스트하고, 시약 경우 갱신됩니다필요한.
- Prearrangements
- amidite 희석제 (추가 건조 아세토 니트릴) 1.2 ㎖에 시판되는 2'-O-프로 파르 길 - deoxyuridinephosphoramidite (CU)를 녹인다. 신디사이저의 유리 병에 유리 병에 솔루션을 이동 신디사이저로 조입니다.
- 더 아르곤 가스 누출이 없음을 확인 (제조업체의 지침에 따라)는 "누설 테스트"를 수행합니다. 은 "누설 테스트가"실패하면 더 단단히 유리 병에 나사.
- 고상 합성 챔버에 연결 튜브를 작성하여 프라임 구리 용액.
- 아세토 니트릴로 모든 라인을 씻으십시오.
- DNA 가닥의 합성
- 제조 업체의 프로토콜의 지시에 따라 DNA 서열과 결합 방법을 입력 연결된 컴퓨터를 사용합니다. CU를 빌딩 블록의 커플 링 공정은 통상 7 펄스를 40 초에 비해 (각 펄스가 16 μL 임) (7) 펄스 168 초 소요빌딩 블록으로서 포스.
- 제 1베이스 1 μmol으로 수정 고상과 CPG (제어 세공 유리)를 포함하는 열을 탑재 신디사이저로 (DNA 합성은 '5'3에서 수행된다).
- DNA의 합성 (11)의 합성을 시작합니다.
- 합성 된 DNA 가닥의 정밀 검사
- 진공 O의 /의 N에서 합성 된 DNA 가닥과 열을 건조시킵니다.
- 열을 열고 반응 유리 병에 CPG를 해제하기 위해 협공을 사용합니다. 올리고 뉴클레오티드를 탈 보호 및 CPG에서 DNA 가닥을 해제 농축 암모니아 수용액의 700 μl를 추가합니다.
- 18 시간 동안 50 ° C까지 바이알을 닫고 붕괴되는 것을 방지하기 위해, 반응 용기에 보안 덮개를 적용하고, 가열.
- 30 분 동안 30 ° C에서 감압 (100 밀리바)에서 원심 분리하여 암모니아를 제거합니다.
- CPG에서 여과를 시작 원심 분리기 용기를 11,000 XG FO에R 3 분. 상등액을 취하여 0.45 ㎛의 세공 크기를 갖는 원심 분리 장치로 옮긴다. 4 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기.
- 한편 3 분 동안 11,000 XG에 20 초 원심 분리기의 CPG, 소용돌이에 두 번 증류수 300 μl를 추가합니다. 4 분 동안 1,000 XG에서 원심 장치와 원심 분리기에 뜨는을 전송합니다. 두 번이 세척 절차를 반복합니다.
- 0.1 밀리바 25 ° CO / N에서 원심 분리하여 결합 된 수용액에서 물을 제거합니다.
3. "클릭"절차
- (0.1 [(1- 벤질 -1H- 1,2,3- 트리아 졸 -4- 일) 메틸] 아민 - 50 μL 이중 증류수, 나트륨 아스 코르 베이트 용액을 25 μL (물 중 0.4 M), 34 ㎕의 트리스 추가 DMSO의 M /을 tBuOH 3 : 아 지드의 1) 114 μL (0.01 DMSO에서 M /을 tBuOH 3 : 1) 및 테트라 키스 17 μL (아세토 니트릴), 구리 (I) 헥사 플루오로 포스페이트 용액 (0.1 DMSO에서 M /을 tBuOH 3 : 1) 동결 건조 된 알킨 변성 DNA 샘플이다. 1.5 시간 동안 60 ℃에서 샘플을 인큐베이션.
- 실온으로 냉각.
- 150 μL 나 2 EDTA (물에 0.05 M) 및 10 ML 튜브에 DNA 샘플 및 전송에 450 ㎕의 아세트산 나트륨 (물에 0.3 M)를 추가합니다.
- 10 ml의 에탄올 (100 %)를 추가하고 16 시간 동안 -32 ℃에서 보관하십시오.
- (15) 1000 XG에 분, 상층 액을 제거하기위한 원심 분리기 용기.
- 2 ml의 차가운 에탄올 (80 %)와 DNA-펠렛을 씻으십시오.
- 감압 건조 펠렛.
4. HPLC 정제
참고 : 분리하기 전에 DNA 가닥이 HPLC가 제대로 작동하는지 확인, 충분한 용매를 사용할 수 있으며 열은 깨끗합니다. 버퍼 / 아세토 니트릴의 시작 농도 열을 씻어.
- HPLC 바이알에 이중 증류수 및 전송의 250 μL의 원유 DNA-펠렛을 녹인다.
- 염료 1 및 GRADI 대한 아세토 니트릴의 15 % 0 % 아세토 니트릴 구배로 45 분 HPLC 실행 시작 염료 2의 아세토 니트릴 17 % 0 % 아세토 니트릴의 엔트는 260 나노 미터 (DNA 흡수) 및 459 nm의 (염료 1) 또는 542 nm의 (염료 2)를 확인하여 실행을 모니터링합니다. 두 파장 채널에서 흡수를 보여 그 분수를 수집합니다.
- 3- 하이드 록시피 콜린 산 (3HPA) 및 diammoniumhydrogencitrate로 구성된 행렬을 이용하여 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI) 질량 분석에 의해 오른쪽 대량의 수집 분수를 확인합니다.
- 물에 diammoniumhydrogencitrate 용액 (100g / L)를 100 ㎕의 아세토 니트릴과 물의 혼합물을 1 : 1 포화 3-HPA 용액 900 μL를 혼합하여 매트릭스를 준비한다.
- 대상의 DNA 프로브의 1-2 μl를 피펫 공기에 건조 할 수 있습니다.
- 샘플로 3 HPA는 / diammoniumhydrogencitrate 행렬의 0.2 μl를 추가하고 결정화 될 때까지 섞는다.
- MALDI 질량 분석을 수행합니다.
- 오른쪽 질량을 전시하는 HPLC의 분수를 결합합니다.
주 : 농도는 DNA 염기와 염료의 흡광 계수 (ε 260)에 근거하여 UV / 비스 분광하여 260 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정된다.
- 이중 증류수 200 μL - 100의 DNA를 녹여.
- 자외선은 / 마주 분광 광도계에 DNA 용액 1 μL를 적용합니다.
- 260 nm에서 흡광도를 측정한다. 세 번 반복합니다.
- 용액의 농도를 계산하는 평균값을 가지고. 흡광 계수의 계산, 전체 DNA 가닥의 ε의 260 나노 미터를 얻기 위해 네 천연베이스 (12)의 ε 260 나노 미터 및 (천연 딘으로 간주) 구입 빌딩 블록 CU의 ε의 260 나노 미터 (12)를 사용한다. 염료 1, 사용 ε의 260 나노 미터 = 10,200 L를 들어 * 몰 -1 * cm -1 염료 2를 사용 ε의 260 나노 미터 = 13,100 L의 * 몰 <SUP> -1 * cm -1. 흡광 계수 측정 한 흡광도에 기초 램버트 - 맥주의 법칙 다음, 용액의 농도를 계산한다. 13
6. 샘플 준비 및 분광학
- 단일 가닥 샘플의 제조
- 200 mM의 염화나트륨, 50 mM의 낮잠 내가 버퍼에서 수정 된 DNA1 및 DNA2 각각 2.5 μm의 솔루션을 개별적으로 1 ml의 pH는 7을 준비합니다.
- 이중 가닥 샘플의 제조
- 반응 용기에 200 mM의 염화나트륨, 50 mM의 NAP 나 버퍼, pH가 7 DNA2 2.5 DNA1의 μM 2.5 μM을 함유 한 용액 1 ㎖를 준비한다.
- 10 분 동안 90 ° C에 안전 캡과 열로 뚜껑을 고정합니다. 그리고 난방을 끄고 RT O / N로 냉각 할 수 있습니다.
- 흡광
주 : 형광 스펙 대 여기 파장을 결정하려면troscopy 흡수 스펙트럼이 기록됩니다.- 단일 가닥 측정
- 200 mM의 염화나트륨, 50 mM의 낮잠 내가 버퍼, pH는 7이 포함 된 빈 측정을 기록합니다.
- 1cm 석영 유리 큐벳에 DNA1 준비된 용액을 전송하고 흡수를 기록한다. 빈 데이터에 대한 측정을 수정합니다. 염료의 흡수 최대 값을 결정한다.
- DNA2에 대해 반복합니다.
- 단일 가닥 측정
- 형광 분광법
- 단일 가닥 측정
- 200 mM의 NaCl을, 내가 버퍼 50 mM의 낮잠을 포함하는 빈 측정을 기록, 산도 = 7; 염료 (1)의 여기 파장을 사용.
- 1cm 석영 유리 큐벳에 DNA1 용액을 전송.
- 형광 스펙트럼을 기록합니다.
- 두 가닥 측정
- 석영 유리 큐벳에 이중 가닥 용액을 전송. 염료 (1)의 여기 파장을 이용한 형광 스펙트럼을 기록한다.
- 단일 가닥 측정
- 시각화 실험
주의 : 적절한 눈 보호는 눈에 자외선 손상을 방지하기 위해 착용한다!- , 기록 된 스펙트럼이 표시 무엇의 더 나은 이해를 얻을 휴대용 자외선 램프 (그림 5)와 큐벳을 조사합니다. 이중 가닥 DNA에 하나의 형광 색상의 변화를 관찰한다.
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Representative Results
도 4에 도시 된 바와 같이, 단일 및 이중 가닥 DNA의 흡수 및 형광 스펙트럼을 기록한다.
기록 된 흡수 스펙트럼 (그림 4 오른쪽) 단일 가닥 DNA1 (염료 1) 및 단일 가닥 DNA2 (염료 2)에 대한 546 nm의 465 nm에서 쇼 흡수 최대의 λ 최대. 어닐링 DNA1_2 (염료 1 염료 2) 469 nm 내지 567 nm의 모두에서 최대 값을 보여줍니다. 모두 최대 흡수는 장파장 이동, 염료 1 4 nm의 이러한 작은 분광 변화가 이중 나선 DNA 구조 내에서 염료 사이의 엑시톤 상호 작용의 결과 염료 2에 대한 21 나노을 보여줍니다.
하나를위한 607 nm에서 해당 형광 스펙트럼 단일 가닥 DNA1 (염료 1, 435 nm에서 여기)에 대한 537 nm에서 (왼쪽 그림 4) 전시 최대 λ 최대,-stranded DNA2 (염료 2, 535 nm에서 여기) 소둔 DNA1_2에 대한 615 nm에서 (염료 1 및 435 nm에서 2, 여기 염료). 염료 1 에너지 전송이 1시 57분의 발광 콘트라스트 비를 제공한다 2. 염색 염료 (1)로부터 효과적으로 발생하는 보이지 않고 선택적으로 여기되어 있지만 DNA1_2 단독 염료 2의 발광 최대 값을 나타낸다.
도 5에 도시 된 바와 같이, 단일 및 이중 가닥의 차이는 표준 UV 램프로 여기시 큐벳의 발광 색을 비교하여 명백하다.
DNA의 에너지 전달도 1 기본 개념. 도너 변성 DNA 가닥 (녹색) 435 nm에서의 조사에 의해 535 nm에서 형광을 나타낸다. 그것은 수용체 수정 카운터 가닥 (빨간색) 결과 이중 가닥의 혼성화 된 경우610 nm에서의 수용체 염료의 붉은 형광을 가죠. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2는 합성 염료 1 염료 2 개의 시아닌 염료 1 (A)의 합성 2 (B)의 개요는 세 개의 연속적인 단계에서 수행된다.도 9의 (A) a) 1,3- diiodopropane을 CH 3 CN, 85 ° C, 16 시간, 94 %; b)는 NaN의 3, CH 3 CN, 85 ° C, 16 시간, 87 %; c) K 2 CO 3, 디메틸 카보네이트, DMF, 130 ℃, 19 시간, 89 %; d) 피 페리 딘을 EtOH, 80 ℃, 4 시간, 80 %. (B)가) 1,3- diiodopropane, CH 3 CN, 85 ° C, 16 시간, 49 %; b)는 NaN의 3, CH 3 CN, 85 ° C, 16 시간, 93 %; 기음) K 2 CO 3, 디메틸 카보네이트, DMF, 130 ℃, 19 시간, 98 %; 라) 피 페리 딘, EtOH로, 80 ° C는 4 시간, 44 %. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
CU 빌딩 블록도 3의 구조, 염료 1 및 2와 DNA1 및 DNA2 시퀀스. 1 및 2 DNA1 및 DNA2 주어진 시퀀스 내 트리아 링커 리보스의 2 '위치에 결합하는 염료. 9 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. FLUO단일 및 이중 가닥 DNA 가닥 (왼쪽)와 단일 및 이중 가닥 DNA 가닥 (오른쪽). DNA1의 방출 스펙트럼을 535 nm에서 435 nm에서 464 nm의 DNA2 (적색)에서 흥분 (검정), 흥분 (핑크 흡수 rescence ) 및 435 nm에서 여기 DNA1_DNA2 하이브리드 (파란색) 표시됩니다. 단일 가닥 DNA1 (검정), DNA2 (빨간색) 및 혼성화 된 이중 가닥 DNA1_DNA2 (파란색)의 흡수 스펙트럼은 오른쪽 쇼에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
자외선 램프에 의해 여기 동안 기증자 염료 (왼쪽)와 기증자 및 수용체 염료 (오른쪽)와 이중 가닥 DNA와 단일 가닥 DNA의 그림 5. 배출 색상. 단일 가닥 DNA1를 포함하는 큐벳의 이미지 (LEFt 측이) 밝은 녹색 형광을 나타내며, 이중 가닥 DNA1_DNA2 (오른쪽)의 이미지가 366 nm의 휴대용 자외선 램프로 여기시 붉은 형광을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 아 지드 수정 형광 염료에 의해 CuAAC 통해 DNA 후 합성 레이블의 전체 과정을 보여줍니다. 이 염료 및 알킨 변성 DNA의 합성뿐만 아니라, 표시 순서를 포함한다.
염료의 합성은 네 단계를 따른다. 모든 제품은 그들의 양전하로 비교적 간단 침전에 의해 수득 할 수 있고 시간 소모적 컬럼 크로마토 그래피는 필요하지 않다. 중앙 커플 링 단계 이전에 아 지드 기능의 도입은 네 대신 5 개의 연속 반응 단계에 염료의 합성을 단축. 1,3- diiodopropane 대신 알킬화 공정은 아펠 반응 및 요오 작용기로 수산기 함수 변환 다음 Finkelstein 반응을위한 3 iodopropanol의 적용을 회피 하였다. 게시 된 절차에 비해 이러한 변화는 우리가 더 큰 규모와 시간의 짧은 기간에 염료를 합성 할 수 있습니다.
DNA1 염료는 2 셉터 염료로 염색 한 도너 염료 및 DNA2별로 표시된다. DNA1 및 DNA2는 열처리하면 모두 염료는 가까이에 얻을. 염료가 여기 한 때 효율적인 에너지 전달이 관찰된다. 원칙적으로, 모두 염료 사이의 엑시톤 상호 작용은 후자의 프로세스가 비 결합을 필요로하기 때문에 효율적인 에너지 전달을 방해하고 여기있다결합 된 염료의 D 염료 1 비결 염료 2 여기는 다른 광 물리 경로를 개시한다. 14 우리의 이전 연구 9,15 염료의 도포 3'-5'- 대각선 배열 사이에만 작은 엑시톤의 상호 작용에 대한 구조 기준을 제공하는 것이 밝혀 염료 및 효율적인 에너지 전달.
입증 된 에너지 전달의 높은 효율 시험 관내 및 생체 내 실험에서 정확한 형광 판독 할 수 있습니다. 이 균체 내에 핵산 계 앱 타머뿐만 아니라, 작은 간섭 RNA (siRNA와)의 무결성의 시각화 표적 분자의 결합은 분자 표지의 DNA 혼성화의 시각화를 포함한 다양한 애플리케이션을 제공한다. 주요 제한은 모두 DNA 가닥 레이블을 할 수있는 요구 사항입니다. 앞으로 우리는 한 가닥 모두 염료가 부착 된 이중 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브의 개발에 우리의 일을 집중하는 것을 목표로하고 있습니다.
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Acknowledgments
독일 연구 협회 (DFG, 1386 / 17-1 워싱턴)에 의해 재정 지원 연구 교육 그룹 (DFG에 의해 자금) GRK 2039 및 KIT는 기꺼이 인정한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
| Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
| Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
| Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
| 2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
| ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
| centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure1 |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determination of concentration | |||
| ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
| sample preparation and spectroscopy | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| 1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. | |||
References
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