Methodenartikel

Eine Phänotypisierung Regimen für genetisch modifizierte Mäuse verwendet, um Gene in menschlichen Krankheiten des Alterns Beteiligt Study

DOI:

10.3791/54136

⸱

14. Juli 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental Health Sciences, Yale University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Ein reverse-genetischer Ansatz zum Verständnis von Genfamilien, die mit menschlichen Krankheiten assoziiert sind, wird vorgestellt, wobei die Maus als Modellsystem verwendet wird, und der anschließende Maus-Phänotypisierungsplan wird beschrieben. Da Mäuse, die an einem interessierenden Gen, HtrA2, defekt waren, Parkinson-Symptome zeigten, konzentriert sich das Phänotypisierungsschema auf die Identifizierung neurologischer Defekte.

Zusammenfassung

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Altersbedingte Krankheiten werden immer häufiger und die Belastung nimmt mit zunehmendem Alter unserer Bevölkerung weiter zu. Wirksame Behandlungen sind notwendig, um die Auswirkungen von schwächenden Erkrankungen zu verringern, bleiben aber in vielen Fällen schwer fassbar. Nur durch das Verständnis der Ursachen und der Pathologie von Krankheiten, die mit dem Altern verbunden sind, können Wissenschaftler beginnen, potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren und Interventionsstrategien zu entwickeln. Die häufigsten altersbedingten Erkrankungen sind neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson und Blindheit. Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist die häufigste Ursache für Erblindung bei älteren Menschen. Genomweite Assoziationsstudien haben zuvor Loci identifiziert, die mit einer erhöhten Anfälligkeit für diese Krankheit assoziiert sind, und zwei interessante Regionen identifiziert: den Komplementfaktor H (CFH) und den 10q26-Locus, in dem sich die Gene für die altersbedingte Makulopathie-Anfälligkeit 2 (ARMS2) und den Hochtemperatur-Bedarfsfaktor A1 (HtrA1) befinden. CFH fungiert als negativer Regulator des alternativen Signalwegs (AP) des Komplementsystems, während HtrA1 eine extrazelluläre Serinprotease ist. ARMS2 befindet sich im Primatengenom stromaufwärts von HtrA1, obwohl das Gen bei Mäusen nicht vorhanden ist. Um die Auswirkungen dieser Gene zu untersuchen, wurden humanisierte Knock-in-Mauslinien von Cfh und ARMS2, Knockouts von Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 und HtrA4 sowie eine bedingte neuronale Deletion von HtrA2 generiert. Von allen gentechnisch veränderten Mäusen, die produziert wurden, zeigten nur Mäuse, denen HtrA2 entweder systemisch oder im Nervengewebe fehlte, klare Phänotypen. Um diese Mäuse gründlich und systematisch zu untersuchen, wurde ein anfänglicher Phänotypisierungsplan erstellt, der aus einer Reihe von Tests bestand, die sich auf zwei Hauptkrankheiten von Interesse bezogen: AMD und Parkinson. Genetisch veränderte Mäuse können geeigneten Experimenten unterzogen werden, um Phänotypen zu identifizieren, die mit den damit verbundenen Krankheiten beim Menschen in Verbindung stehen können. Hier wird ein Phänotypisierungsschema mit mitochondrialem Fokus neben repräsentativen Ergebnissen der interessierenden Tests vorgestellt.

Einleitung

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Altersassoziierten Erkrankungen werden immer häufiger in der modernen Gesellschaft. Da die medizinische Wissenschaft und die Lebenserwartung steigt verbessert, wächst die Bevölkerung nach Alter und die Last dieser Krankheiten wächst. Effektive Behandlungen sind notwendig, um die Auswirkungen der lähmenden Bedingungen zu verringern, bleiben aber schwer in vielen Fällen. Nur wenn wir die Ursachen zu verstehen und Pathologie der Zusammenhang mit der Alterung Krankheiten können die Wissenschaftler beginnen potentielle therapeutische Targets zu identifizieren und zu entwickeln Strategien für die Intervention. Gemeinsame altersbedingten Bedingungen umfassen neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson-Krankheit (PD) und altersbedingte Makuladegeneration (AMD). PD ist die häufigste durch Neurodegeneration verursacht Bewegungsstörung beim Menschen. Die meisten Parkinson-Patienten zeigen Symptome wie Ruhetremor, Bradykinesie und Steifigkeit nach 50 Jahren. Frühem Beginn wurde auch in etwa 10% der Fälle beobachtet.

AMD ist die häufigste Ursache für Erblindung beiältere Menschen, progressiv und Photorezeptoren der retinalen Pigmentepithel (RPE) im Auge zu beschädigen. Zentrale Vision beeinträchtigt aber die periphere Sicht ist in der Regel nicht betroffen. Es gibt zwei Formen von AMD. In der "trockenen" Form, extrazelluläre Proteinablagerungen als Drusen Form zwischen dem RPE und Bruch-Membran (BM) bekannt, was zu einer geographischen Atrophie und Unschärfe des zentralen Sehens. Die schwereren "nasse" Form ergibt sich aus Neovaskularisation aus der Chorioidea über BM in die RPE und Photorezeptorschichten und kann unter der Netzhaut führen zu hamorrhaging, die zu dauerhaften Schäden an Netzhautgewebe verursacht. Genomweite Assoziationsstudien haben zuvor identifizierten Loci, die mit einer erhöhten Anfälligkeit für diese Krankheit und identifiziert zwei Bereiche von Interesse verbunden sind: Komplement-Faktor H (CFH) auf dem Chromosom 1 und dem 10q26-Locus, wo die altersbedingte Makulopathie Anfälligkeit 2 (ARMS2) und Hochtemperatur - Anforderung Faktor A1 (HtrA1) Gene befinden sich 1-5 . Kombinationen dieser Allele erhöhen die Wahrscheinlichkeit von AMD in einer dosisabhängigen Weise und spezifischer SNPs können vorzugsweise entweder mit den nassen oder trockenen Formen von AMD 3-6 verbunden sein.

CFH wirkt als negativer Regulator des alternativen Wegs (AP) des Komplementsystems durch die Aktivierung von C3 zu hemmen. A single nucleotide polymorphism (SNP) wurde zu einem erhöhten Risiko von AMD verbunden, was den Austausch von Tyrosin 402 in Exon 9 mit Histidin durch eine T nach C Substitution 1. In AMD wird angenommen, dass der AP wegen einer Funktionsverlust von CFH falsch reguliert ist aber, ob das SNP spielt eine kausale Rolle ist unklar. Eine Hypothese ist , dass die positiv geladene Histidin gedacht , ist die Fähigkeit von CFH zu negieren , um interagierende Proteine ​​C-reaktives Protein und Heparinsulfat 1,7 zu binden. In - vitro - Studien von CFH Y402H liefern widersprüchliche Ergebnisse über funktionelle Unterschiede zwischen den Varianten und in vivo Arbeit in Cfh - / - Mäusen, die humanisierte CFH 8 ist noch nicht abgeschlossen. ARMS2 stromauf HtrA1 im Primatengenom befindet, wobei das Gen in Mäusen fehlt. HtrA1 ist eine Serinprotease, aber ARMS2 ist schlecht charakterisiert. Das Kopplungsungleichgewicht zwischen SNPs in der AMD-assoziierten Locus hat es schwierig gemacht, die Beiträge zu Risiko einzelner Mutationen der Gene in dieser Region zu bestimmen, aber die jüngsten Arbeiten haben vorgeschlagen, dass es eine Überexpression von HtrA1 anstatt ARMS2, die Neovaskularisation führt und subretinalen Proteinablagerungen 9-11. Allerdings kann die große Nähe der Gene in diesem Locus für Interaktionen ermöglichen, der nicht zufällig eingefügt Transgene unter Verwendung untersucht werden können.

Neben AMD hat die HtrA- Familie von Serin-Proteasen wurden mit vielen menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Alle HtrA-Proteine ​​enthalten eine Serin-Protease-Domäne durch mindestens einen C-terminalen PDZ-Domäne folgt. HtrA1, HtrA3 und HtrA4 teilen sich die grissest Homologie, bestehend aus einem Signalpeptid, insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-Bindungsdomäne, einer Kazal-Protease-Inhibitor-Domäne der Serinprotease-Domäne und eine PDZ-Domäne. HtrA2 hat eine andere N-Terminus, der aus einem Mitochondrienlokalisierungssequenz, Transmembrandomäne und Inhibitor der Apoptose - Bindungsdomäne durch die Protease und PDZ - Domänen 12-16 folgte. Mammalian HtrA1 wird durch substratinduzierte Remodeling in der aktiven Stelle der Protease - Domäne 17-20 reguliert und HtrA2 kann auch durch Wechselwirkung zwischen der Serin - Protease und PDZ - Domänen moduliert werden , die Proteaseaktivität 21 unterdrückt. Interessanterweise scheint die PDZ - Domäne nicht ähnliche Regelung zu HtrA3 16 verleihen scheinen. Die HtrA Proteasen können auch durch extrinsische Faktoren reguliert werden: Es wurde vor kurzem gezeigt , dass es eine regulatorische Interaktion zwischen HtrA1 existiert und Protoporphyrine 22 und HtrA2 können durch Phosphorylierung bei Aktivierung der p38 - MAP - Kinase reguliert werdenWeg in einem PINK1 abhängig 23. Die Löschung der einzelnen Mitglieder der Familie HtrA in Mäusen wurde dokumentiert, aber mechanistisch Effekte sind meist unklar, teilweise aufgrund des Fehlens von sichtbaren Phänotypen.

HtrA1 spielt eine wichtige Funktion bei der Proteinqualitätskontrolle und deren Fehlregulation oder Mutation hat mit vielen verschiedenen menschlichen Krankheiten wie Arthritis, Krebs und ein erhöhtes Risiko für AMD 3,4,24-32 in Verbindung gebracht worden. Der Verlust der HtrA2 Funktion in Nervengewebe wurde mit PD - Phänotypen in Menschen und Mäusen, während der Verlust aus nicht-neuronalen Gewebe führt zu einer beschleunigten Alterung 33-37 in Verbindung gebracht worden. HtrA3 Dysregulation hat mit Krankheiten wie Präeklampsie und bestimmte Arten von Krebs 38,39 in Verbindung gebracht worden. Hochregulierung von HtrA4 hat in den Plazenten von Präeklampsie - Patienten aber knockout Mäuse zeigen keine offensichtlichen Phänotyp 40,41 beobachtet. Der Mangel an Phänotypen in einigen knockout-Mäusen beobachtet wurde,postulierten ein Ergebnis der Kompensation zwischen dem HtrA Familienmitglied zu sein: es wird angenommen , dass sowohl HtrA4 und HtrA1 mit der TGF-B - Familie von Proteinen in Wechselwirkung treten, was eine Kompensation durch HtrA1 beim Löschen von HtrA4 41. In ähnlicher Weise wird angenommen , dass seit HtrA1 und HtrA3 ein hohes Maß an Domäne Homologien aufweisen könnten sie 42 ergänzende Funktionen haben. Aber es wurde vorgeschlagen , dass HtrA- Proteine ​​teilweise antagonistische Rollen haben können, gemeinsame Ziele 43 zu regulieren , zu konkurrieren.

Um diese Gefahr zu untersuchen Faktoren drei humanisierten Knock-in-Mauslinien generiert wurden. In Cfh tm1 (CFH * 9) jhoh und Cfh tm2 (CFH * 9) jhoh, Exon 9 des Cfh Gens mit Exon 9 des menschlichen Homolog ersetzt wird. Cfh tm1 (CFH * 9) jhoh codiert die nicht Krankheit assoziiert Tyrosin Rest an Position 402, während Cfh tm2 (CFH * 9) jhoh die Y402H, Risiko-assoziierten SNP trägt. ImARMS2 tm1jhoh menschlichen ARMS2 Sequenz wurde an eine Region stromaufwärts von HtrA1 abgezielt. Eine loxP-flankierte STOP - Sequenz der Gensequenz , aber stromabwärts von dem Promotor enthalten UBIC wurde OzCre Mäusen durch Kreuzung exzidiert angeordnet stromaufwärts , die Cre - Rekombinase unter der Kontrolle des Promotors exprimieren Rosa26, wie zuvor beschrieben 34. Zusätzlich zu diesen Knock-in - Linien, Knockout - Allele für Cfh und HtrA1 (CFH tm1jhoh und HtrA1 tm1jhoh) sowie die anderen Mitglieder HtrA- Familie bekannt wurden erzeugt: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) und HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). Die Keimbahn Vorprägungen wurden konstruiert durch Kreuzung OzCre Mäuse Tiere erstellt spezifische Exons mit loxP - Stellen zu flankieren, so dass das Löschen bewirkt eine Rahmenverschiebung und / oder Löschung der aktiven Domäne (CFH; Exon 3, HtrA1; Exons 2-3, HtrA2: Exons 2-4, HtrA3; Exon 3, HtrA4; Exons 4-6) 34,41. Ein neuronales Deletion HtrA2, deletiert unter Verwendung von Cre - Rekombinase unter der Kontrolle des Nestin - Promotor (HtrA2 flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J), wurde ebenfalls 34 beschrieben. Nur Mäuse HtrA2, entweder systemisch oder in Nervengewebe, zeigte klare Phänotypen fehlt, mit Parkinson- Phänotypen zu präsentieren.

Da einige dieser Gene von Interesse gesetzt zu Mitochondrien 11,44-47 lokalisiert werden, und Löschen von HtrA2 erzeugt Parkinsonian Phänotypen, eine Phänotypisierung Regime mit einer mitochondrialen und neurologischen Fokus wird hier beschrieben und repräsentative Ergebnisse aus den Tests von Interesse zur Verfügung gestellt werden . Um gentechnisch veränderten Mäusen zu untersuchen, erzeugt ein Mensch zu untersuchen, gründlich altersbedingte Krankheiten und systematisch eine anfängliche Phänotypisierung Zeitplan festgelegt wurde, die aus einer Reihe von Tests an den beiden HauptbezogenenKrankheiten von Interesse: AMD und Parkinson.

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Protokoll

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Ethik Aussage: Studien Tiere wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Yale University durchgeführt.

1. Verhaltenstest von genetisch veränderten Mäuse

Hinweis: Alle Mäuse sollten auf den gleichen Testprozeduren unterzogen werden, um Unterschiede in Gewöhnung zu begrenzen Handhabung. Tests sollte jedes Mal an der gleichen Tageszeit durchgeführt werden.

  1. Neonatal Hind Gliedmaßen-Test
    Hinweis: Die hinteren Gliedmaßen Test durchgeführt täglich von postnatalen Tag (P) 4 bis P10 proximalen hinteren Gliedmaßen Muskelkraft, Schwäche und Müdigkeit zu bewerten.
    1. Transport Mäuse Testbereich und lassen Sie es 30 Minuten vor dem Test zur Ruhe.
    2. Bereiten Sie Testgerät durch eine 50 ml konischen Röhrchen mit 70% Ethanol Reinigung, Drücken von zwei (P4-P8) oder ein (P9-P10) Wattebällchen auf dem Boden des tube und in einer vertikalen Position zu sichern.
    3. Entfernen Sie einen Welpen aus dem Käfig und Rekordgewicht. Halten Sie pup Tablett auf Heizkissen in halten, wenn nicht zu testen.
    4. Sanft suspendieren die Hinterbeine des Neugeborenen über den Rand des konischen Rohrs, so dass es in Richtung der Wattebäusche nach unten zeigt. Zählen Sie die Anzahl der Ziehversuche gemacht und messen die Latenz zu fallen, um eine Stoppuhr.
    5. Wiederholen Sie einmal dann mit der Markierung den Welpen beschriften. Danach P6 Welpen durch Zehen Clipping identifizieren. Reiben Sie Welpen sanft mit Bettwäsche von zu Hause Käfig vor dem Austausch.
    6. Wisch konisches Rohr mit 70% Ethanol.
    7. Wiederholen Sie Prüfung auf der nächsten Welpen, bis die ganze Wurf wurde getestet.
    8. Entsorgen Wattebausch und konischen Röhrchen. Reinigen Sie alle Geräte mit 70% Ethanol.
  2. Weanling Observation-Test
    Hinweis: Der Absetzer Beobachtungstest verabreicht wird täglich von P19 bis P21 Bewegung und allgemeine Aktivitätsniveau zu erzielen.
    1. Transport Mäuse Testbereich einnd lassen Sie es 30 Minuten vor dem Test zur Ruhe.
    2. Vorbereitung Testfeld Plexiglas markiert mit einem 6x6-Raster von 2 inch Quadrate auf der Basis von mit 70% Ethanol gereinigt wird. Richten Sie Videogerät an der Seite, so dass das ganze Feld im Blickfeld ist. Halten Sie die Einrichtung und Umgebung jeden Tag das gleiche zu vermeiden Neuheit einzuführen.
    3. Entfernen Sie einen Absetzer aus dem Käfig und in einem sauberen Betrieb Tasse. Nehmen Sie Gewicht.
    4. Beginnen Videoaufzeichnung durch die Testidentifikationskarte filmt, mit Maus-Identifikationsnummer, Alter und Datum der Prüfung. Übertragen Sie die Maus aus dem Becher zu der Mitte Platz zu halten. Zeit für drei Minuten die Anzahl der Zeilen von beiden Vorderpfoten der Maus während des Tests durchlaufen zu zählen.
    5. Rück Maus in einen sauberen Käfig und End-Videoaufzeichnung.
    6. Reinigen der Testvorrichtung mit 70% Ethanol.
    7. Wiederholen, bis alle Wurf getestet wird, dann wieder alle Welpen an den Käfig.
    8. Reinigen Sie alle Prüfgeräte mit 70% Ethanol.
    9. Die Videos verwenden, Quantifizieren durch Auszählung nach der visuellen Beobachtung der Anzahl Ereignisse der Aufzucht, wo eine Maus mit beiden Vorderpfoten klare Unterstützung steht und Pflege Veranstaltungen, bei denen die beiden Vorderpfoten in der Reinigung tätig sind.
  3. Wire Mesh Grip Festigkeitstest
    Hinweis: Die Grifffestigkeit Test an abwechselnden Tagen zwischen P22 und P26 durchgeführt wird, um die neuromuskuläre Stärke beurteilen.
    1. Transport Mäuse Testbereich und lassen Sie es 30 Minuten vor dem Test in Heimkäfig zur Ruhe.
    2. Bereiten Sie Gerät durch ein Plexiglas-Box und Maschengitter mit 70% Ethanol reinigen. Setzen Sie Luftpolsterfolie im Boden der Schachtel und Deckel mit Papier.
    3. Getrennte Mäuse in Gruppen von drei, in einzelnen Haltebecher platzieren.
    4. Platzieren erste Maus auf die Mitte des Drahtgeflecht und invertieren langsam 10-20 cm über die weiche Oberfläche in den Boden des Plexiglas-Box. Messen Sie die Latenzzeit zu fallen, um eine Stoppuhr. Beenden Tests nach 60 sec verstrichen sind, wenn die Maus nicht tutFall.
    5. Rück Maus zu halten Tasse, Abwischen mit 70% Ethanol Netz und ersetzen Papier über die Luftpolsterfolie. Führen Sie den Test auf den verbleibenden zwei Mäuse in der Gruppe, bevor mit dem ersten zurückkehrt. Wiederholen, bis jede Maus insgesamt dreimal getestet wurde.
    6. Bringen Sie die Gruppe in einen sauberen Käfig und weiter mit anderen Gruppen. Bei weniger als drei Mäuse in jeder Gruppe sind, stellen Sie sicher, dass ein 5 min zu interProbeErholungsIntervall erlaubt ist.
    7. Gibt alle Mäuse an den Käfig, entsorgen Papier und saubere Prüfgeräte mit 70% Ethanol.

2. Die Prüfung der Retinal Struktur

  1. Anästhesieren Tiere an P30-35 durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). Beurteilen Tiefe der Anästhesie durch den Fußballen Quetschung und nur in Abwesenheit einer Antwort, in Übereinstimmung mit IACUC Richtlinien erfolgen. Perfuse mit 4% PFA / PBS 48.
  2. Um die Augen zu entfernen, reinigen Sie die Haut an der Einschnitt site mit 70% Ethanol, bevor an der Basis des Schädels durch die Haut zu schneiden. Ziehen Sie die Haut wieder auf den Schädel und sauber mit 70% Ethanol aus. Mit sauberen Instrumente, schneiden Sie vorsichtig durch den Schädel, die Augenhöhlen zu erreichen und die Augen aus. Sever den Sehnerv, sanft entfernen Sie das Auge aus der Steckdose und spülen in PBS.
  3. Fix Augen in 4% PFA / PBS für 10 min bei Raumtemperatur.
  4. Zeigen die Augen in eine kleine Petrischale mit PBS. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Mitte der Hornhaut unter Verwendung von Stichentfernung Schere. Entfernen Sie die Hornhaut durch die Kante zwischen der Hornhaut und Lederhaut zu schneiden. Verwenden einer Pinzette, die Iris zu entfernen. Schließlich schälen die RPE Schichten, so dass die Netzhaut intakt und die Linse an Ort und Stelle aus.
    Hinweis: Die 4% PFA / PBS Fixierung bewirkt RPE Ablösung so dass für die RPE leicht von der Außenseite der Netzhaut abgeschält werden.
  5. Re-fix in 4% PFA / 30% Saccharose / PBS für 15 min bei Raumtemperatur vor dem Auge auf eine Petrischale mit PBS zurückkehrt. Ziehen Sie die lens Zange, womit sich die Glaskörper zusammen mit ihm mit.
  6. Cryoprotect in 30% Saccharose über Nacht bei 4 ° C.
  7. Mantel Augen in eine optimale Schnitt Temperatur Verbindung (OCT) und Übertragung auf eine Einbettform mit frischem Oktober Orientieren des Auges, so dass der Sagittalebene ist parallel mit der Schneidfläche, indem so wenig wie möglich Bewegungen und die Vermeidung der Einführung von Luftblasen. Blitzeis, indem die Form in einem Trockeneis / Ethanol-Bad eingetaucht wird. Store Blöcke bei -80 ° C.
  8. Mit Hilfe eines Kryostaten geschnitten 20 um Sagittalschnitte und sammeln sich auf vorgereinigte Dias.
  9. Stain Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin nach Standardprotokollen 49. Bild mit einem Lichtmikroskop für Hellfeldmikroskopie ausgestattet.

3. histochemische Färbung

  1. Probenvorbereitung
    1. Euthanize Tiere bei P30-35 mit Isofluran Überdosierung (30% in Propylenglykol) über offene Tropfen Einatmen. Beurteilen Sie die Euthanasie durch das Aufhörender Atmung, Herzschlag und der Mangel an Reaktion auf die Fußballen Kneifen. Bestätigen Tod durch Genickbruch und Organentnahme mit IACUC Richtlinien im Einklang.
    2. Um das Gehirn zu entfernen, reinigen Sie die Haut an der Einschnittstelle mit 70% Ethanol, bevor an der Basis des Schädels durch die Haut zu schneiden. Ziehen Sie die Haut wieder auf den Schädel und sauber mit 70% Ethanol aus. Mit sauberen Instrumente, sorgfältig durch den Schädel schneiden und entfernen Sie das Gehirn zu belichten. Entfernen Sie die Membranen und sanft das Gehirn aus dem Schädelhöhle zu entfernen. Spülen in PBS.
    3. Coat das Gehirn in OCT und Übertragung auf eine Einbettform mit frischem Oktober Orientieren das Gehirn, so dass der sagittalen Ebene ist parallel zu der Schnittfläche unter Verwendung von möglichst wenigen Bewegungen wie möglich und der Vermeidung der Einführung von Luftblasen. Blitzeis, indem die Form in einem Trockeneis / Ethanol-Bad und bei -80 ° C eingetaucht wird.
    4. Mit Hilfe eines Kryostaten geschnitten 10 um Sagittalschnitte und sammeln sich auf vorgereinigte Dias.
  2. NADH Diaphorase-Färbung
    1. Bereiten 0,05 M Tris-Puffer, pH 7,6 durch Auflösen von 5,72 g Tris-HCl und 1,66 g Tris-Base in 1L-VE-Wasser. Lagerung bei 4 ° C für bis zu sechs Wochen.
    2. Bereiten NADH-Lösung (2,25 mM NADH in 0,05 M Tris-Puffer). Aliquotieren und bei -20 ° C.
    3. Bereiten NBT-Lösung (2,5 mM Nitro-Blue-Tetrazolium in 0,05 M Tris-Puffer). Lagerung bei 4 ° C für bis zu sechs Wochen in einer Glasflasche.
    4. Kombinieren Sie gleiche Volumina von NADH-Lösung und NBT-Lösung Färbelösung machen und 1 ml zu jeder Folie. in einer befeuchteten Kammer für 30 min bei 37 ° C inkubieren.
    5. Absaugen Färbelösung und waschen dreimal mit dH 2 O.
    6. Waschen dreimal jeweils in aufsteigender und absteigenden Konzentrationen von Aceton / dH 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) für 2 min bei Raumtemperatur.
    7. Spülen Sie dreimal in dH 2 O und montieren Abschnitte mit wässrigem Medium. Bild mit einem Lichtmikroskop ausgestattet für helle field Mikroskopie. Blau-Färbung entspricht der enzymatischen Aktivität.
  3. Succinatdehydrogenase histochemische Färbung
    1. Bereiten 0,2 M Natrium monobasischen Phosphat / dH 2 O und 0,2 M Natriumhydrogenphosphat / dH 2 O.
    2. Machen 0,2 M Phosphatpuffer, pH 7,6 durch die Kombination von 3 Teilen einbasischen Phosphat mit 20 Teilen Natriumhydrogenphosphat.
    3. Bereiten Sie Färbungslösung (0,1 M Natriumsuccinat, 1,25 M NBT in 0,2 M Phosphatpuffer) und 1 ml zu jeder Folie. in einer befeuchteten Kammer für 60 min bei 37 ° C inkubieren.
    4. Absaugen Färbelösung und waschen dreimal in dH 2 O.
    5. Waschen dreimal jeweils in aufsteigender und Konzentrationen von Aceton / dH 2 O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) für 2 min bei Raumtemperatur absteigend.
    6. Spülen Sie dreimal in dH 2 O und montieren Abschnitte mit wässrigem Medium. Bild mit einem Lichtmikroskop für Hellfeldmikroskopie ausgestattet. Blau-Färbung entspricht enzymatic Aktivität.

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Ergebnisse

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In diesem Abschnitt werden Beispiele für die Ergebnisse, erhältlich unter Verwendung dieser Verfahren. Im Hinterschenkel-Test hat die Anzahl der Ziehversuche und die Latenzzeit für jeden Tag summiert werden in zwei aufeinander folgenden Tests zu fallen. Dieser Test kann verwendet werden , genetisch verschiedenen Gruppen zu vergleichen Mäuse mit reduzierter Stärke neuromuskulären HtrA2 tm1jhoh (HtrA2 KO) -Mäusen in 1A zu unterscheiden -. B

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Diskussion

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Robust Behandlungen notwendig, um die Auswirkungen der lähmenden Bedingungen menschlichen Alterungs Bezug zu begrenzen, aber sie bleiben schwer für viele Bedingungen. Um potentielle therapeutische Targets zu identifizieren und zu entwickeln Strategien für die Intervention, die Ursachen und die Pathologie der Zusammenhang mit der Alterung Krankheiten müssen zuerst verstanden werden. Nicht alle genetisch veränderten Mäusen unmittelbar gegenwärtig mit klaren Phänotypen, die für die Krankheit von Interesse verbunden sind, a...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen offenzulegen.

Danksagungen

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Die Finanzierung für diese Forschung kam von Rosebay Medical Foundation und Yale Medical School Deans Research Fund (JH). Wir danken Dr. Claire Koenig für die Hilfe bei Verhaltensexperimenten. Gentechnisch veränderte Mauslinien wurden bei Ozgene (Perth, Australien) erzeugt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
EthanolDecon (Fisher Scientific)435541
50 ml konisches RohrFisher Scientific1443222
WattebällchenWalmart
HeizmatteSunbeam0000756-500-000
Halteschale (Eiswürfelschale)Walmart
Elektronische StoppuhrGOGOPC396
Plexiglaskastenaus Werkstatt12" x 12"  
Vixia HF R400 CamcorderCanon8155B004
9 oz Clear CupsWalmart
1/4 Zoll DrahtgeflechtHome Depot204331884 (online) / 554219 (im Geschäft)12" x 12"  
LuftpolsterfolieVWR470092-416
Zange für gerade ProbenVWR82027-438
Präparierzange mit feiner SpitzeVWR82027-408
Feine SchereVWR82027-578
Paraformaldehyd 16%ige LösungElektronenmikroskopie Sciences15710
10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,4American BioanalyticalAB11072-04000
SaccharoseJT Baker4072-01
Superfrost-ObjektträgerFisher Scientific12-550-15
Hämatoxylin-FleckenlösungFisher Scientific (Ricca)353016
Eosin Y FleckenlösungFisher Scientific (Ricca)2845-32
TrishydrochloridSigmaT3253
TrisAmerican BioanalyticalAB02000-01000
Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid, reduziertes DinatriumsalzhydratSigmaN8129
NitrotetrazoliumblauchloridSigmaN6876
AcetonJT Baker9006-05
Monobasisches Natriumphosphat-MonohydratSigmaS9638
Natriumphosphat zweibasisches HeptahydratSigmaS9390
Natriumsuccinat zweibasisches HexahydratSigmaS2378
VectaMount wässriges EindeckmediumVector LabsH-5501-60
DeckglasFisher Scientific12-545-M60 mm x 24 mm
AxioImager A1 MikroskopZeiss
Videokamera-StativAmazon
Optimale Schnitttemperatur (OCT)Fischer Scientific23730571
Kryostat-Schnitte  MaschineLeica  CM1900Abgekündigt, aber inzwischen durch CM1950 ersetzt

Referenzen

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  1. Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308, 385-389 (2005).
  2. Zareparsi, S., et al. Strong association of the Y402H variant in complement factor H at 1q32 with susceptibility to age-related macular degeneration. Am J Hum Genet. 77, 149-153 (2005).
  3. Yang, Z., et al. A variant of the HTRA1 gene increases susceptibility to age-related macular degeneration. Science. 314, 992-993 (2006).
  4. Dewan, A., et al. HTRA1 promoter polymorphism in wet age-related macular degeneration. Science. 314, 989-992 (2006).
  5. Francis, P. J., Zhang, H., Dewan, A., Hoh, J., Klein, M. L. Joint effects of polymorphisms in the HTRA1, LOC387715/ARMS2, and CFH genes on AMD in a Caucasian population. Mol Vis. 14, 1395-1400 (2008).
  6. Cameron, D. J., et al. HTRA1 variant confers similar risks to geographic atrophy and neovascular age-related macular degeneration. Cell Cycle. 6, 1122-1125 (2007).
  7. Herbert, A. P., et al. Structure shows that a glycosaminoglycan and protein recognition site in factor H is perturbed by age-related macular degeneration-linked single nucleotide polymorphism. J Biol Chem. 282, 18960-18968 (2007).
  8. Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor h prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged cfh knockout mice. Am J Pathol. 185, 29-42 (2015).
  9. Nakayama, M., et al. Overexpression of HtrA1 and exposure to mainstream cigarette smoke leads to choroidal neovascularization and subretinal deposits in aged mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 6514-6523 (2014).
  10. Liu, J., Hoh, J. Postnatal overexpression of the human ARMS2 gene does not induce abnormalities in retina and choroid in transgenic mouse models. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, 1387-1388 (2015).
  11. Kanda, A., et al. A variant of mitochondrial protein LOC387715/ARMS2, not HTRA1, is strongly associated with age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16227-16232 (2007).
  12. Zumbrunn, J., Trueb, B. Primary structure of a putative serine protease specific for IGF-binding proteins. FEBS Lett. 398, 187-192 (1996).
  13. Clausen, T., Southan, C., Ehrmann, M. The HtrA family of proteases: implications for protein composition and cell fate. Mol Cell. 10, 443-455 (2002).
  14. Nie, G. Y., Hampton, A., Li, Y., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Identification and cloning of two isoforms of human high-temperature requirement factor A3 (HtrA3), characterization of its genomic structure and comparison of its tissue distribution with HtrA1 and HtrA2. Biochem J. 371, 39-48 (2003).
  15. Runyon, S. T., et al. Structural and functional analysis of the PDZ domains of human HtrA1 and HtrA3. Protein Sci. 16, 2454-2471 (2007).
  16. Glaza, P., et al. Structural and Functional Analysis of Human HtrA3 Protease and Its Subdomains. PLoS One. 10, e0131142. 10, e0131142(2015).
  17. Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3, 380-387 (2003).
  18. Grau, S., et al. Implications of the serine protease HtrA1 in amyloid precursor protein processing. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6021-6026 (2005).
  19. Lecha, M., Puy, H., Deybach, J. C. Erythropoietic protoporphyria. Orphanet J Rare Dis. 4, 19(2009).
  20. Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chem Soc Rev. 40, 340-362 (2011).
  21. Li, W., et al. Structural insights into the pro-apoptotic function of mitochondrial serine protease HtrA2/Omi. Nat Struct Biol. 9, 436-441 (2002).
  22. Jo, H., Patterson, V., Stoessel, S., Kuan, C. Y., Hoh, J. Protoporphyrins enhance oligomerization and enzymatic activity of HtrA1 serine protease. PLoS One. 9, 115362(2014).
  23. Bogaerts, V., et al. Genetic variability in the mitochondrial serine protease HTRA2 contributes to risk for Parkinson disease. Hum Mutat. 29, 832-840 (2008).
  24. Baldi, A., et al. The HtrA1 serine protease is down-regulated during human melanoma progression and represses growth of metastatic melanoma cells. Oncogene. 21, 6684-6688 (2002).
  25. Oka, C., et al. HtrA1 serine protease inhibits signaling mediated by Tgfbeta family proteins. Development. 131, 1041-1053 (2004).
  26. Chien, J., et al. A candidate tumor suppressor HtrA1 is downregulated in ovarian cancer. Oncogene. 23, 1636-1644 (2004).
  27. Grau, S., et al. The role of human HtrA1 in arthritic disease. J Biol Chem. 281, 6124-6129 (2006).
  28. Chien, J., et al. Serine protease HtrA1 modulates chemotherapy-induced cytotoxicity. J Clin Invest. 116, 1994-2004 (2006).
  29. Chien, J., Campioni, M., Shridhar, V., Baldi, A. HtrA serine proteases as potential therapeutic targets in cancer. Curr Cancer Drug Targets. 9, 451-468 (2009).
  30. Hara, K., et al. Association of HTRA1 mutations and familial ischemic cerebral small-vessel disease. N Engl J Med. 360, 1729-1739 (2009).
  31. Jones, A., et al. Increased expression of multifunctional serine protease, HTRA1, in retinal pigment epithelium induces polypoidal choroidal vasculopathy in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14578-14583 (2011).
  32. Vierkotten, S., Muether, P. S., Fauser, S. Overexpression of HTRA1 leads to ultrastructural changes in the elastic layer of Bruch's membrane via cleavage of extracellular matrix components. PLoS One. 6, e22959(2011).
  33. Strauss, K. M., et al. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson's disease. Hum Mol Genet. 14, 2099-2111 (2005).
  34. Patterson, V. L., et al. Neural-specific deletion of Htra2 causes cerebellar neurodegeneration and defective processing of mitochondrial OPA1. PLoS One. 9, 115789(2014).
  35. Jones, J. M., et al. Loss of Omi mitochondrial protease activity causes the neuromuscular disorder of mnd2 mutant mice. Nature. 425, 721-727 (2003).
  36. Martins, L. M., et al. Neuroprotective role of the Reaper-related serine protease HtrA2/Omi revealed by targeted deletion in mice. Mol Cell Biol. 24, 9848-9862 (2004).
  37. Kang, S., et al. Loss of HtrA2/Omi activity in non-neuronal tissues of adult mice causes premature aging. Cell Death Differ. 20, 259-269 (2013).
  38. Dynon, K., et al. HtrA3 as an early marker for preeclampsia: specific monoclonal antibodies and sensitive high-throughput assays for serum screening. PLoS One. 7, e45956(2012).
  39. Singh, H., et al. HtrA3 Is Downregulated in Cancer Cell Lines and Significantly Reduced in Primary Serous and Granulosa Cell Ovarian Tumors. J Cancer. 4, 152-164 (2013).
  40. Inagaki, A., et al. Upregulation of HtrA4 in the placentas of patients with severe pre-eclampsia. Placenta. 33, 919-926 (2012).
  41. Liu, J., Li, Y., Hoh, J. Generation and characterization of mice with a conditional null allele of the HtrA4 gene. Mol Med Rep. , (2015).
  42. Bowden, M. A., Di Nezza-Cossens, L. A., Jobling, T., Salamonsen, L. A., Nie, G. Serine proteases HTRA1 and HTRA3 are down-regulated with increasing grades of human endometrial cancer. Gynecol Oncol. 103, 253-260 (2006).
  43. Chen, Y. Y., et al. Functional antagonism between high temperature requirement protein A (HtrA) family members regulates trophoblast invasion. J Biol Chem. 289, 22958-22968 (2014).
  44. Fritsche, L. G., et al. Age-related macular degeneration is associated with an unstable ARMS2 (LOC387715) mRNA. Nat Genet. 40, 892-896 (2008).
  45. Beleford, D., Rattan, R., Chien, J., Shridhar, V. High temperature requirement A3 (HtrA3) promotes etoposide- and cisplatin-induced cytotoxicity in lung cancer cell lines. J Biol Chem. 285, 12011-12027 (2010).
  46. Hegde, R., et al. Identification of Omi/HtrA2 as a mitochondrial apoptotic serine protease that disrupts inhibitor of apoptosis protein-caspase interaction. J Biol Chem. 277, 432-438 (2002).
  47. Martins, L. M., et al. The serine protease Omi/HtrA2 regulates apoptosis by binding XIAP through a reaper-like motif. J Biol Chem. 277, 439-444 (2002).
  48. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
  49. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008. 2008, pdb prot4986 (2008).
  50. Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72, 251-264 (1974).
  51. El-Khodor, B. F., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212, 29-43 (2008).
  52. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
  53. Chance, B., Williams, G. R., Holmes, W. F., Higgins, J. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. V. A mechanism for oxidative phosphorylation. J Biol Chem. 217, 439-451 (1955).
  54. Kamo, N., Muratsugu, M., Hongoh, R., Kobatake, Y. Membrane potential of mitochondria measured with an electrode sensitive to tetraphenyl phosphonium and relationship between proton electrochemical potential and phosphorylation potential in steady state. J Membr Biol. 49, 105-121 (1979).
  55. Brown, G. C., Brand, M. D. Proton/electron stoichiometry of mitochondrial complex I estimated from the equilibrium thermodynamic force ratio. Biochem J. 252, 473-479 (1988).

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