Nagetier Arbeits Herz Modell für die Untersuchung der myokardialen Leistung und Sauerstoffverbrauch

Zusammenfassung

Isolierte Arbeitsherzmodelle können verwendet werden, um die Wirkung von Belastungsbedingungen, Herzfrequenz und Medikamenten auf die myokardiale Leistung und den Sauerstoffverbrauch zu messen. Wir beschreiben Methoden zur Erstellung eines Arbeitsmodells für das linke Herz von Nagetieren, das die Untersuchung der systolischen und diastolischen Leistung und des Sauerstoffverbrauchs unter verschiedenen Bedingungen ermöglicht.

Zusammenfassung

Isolierte Arbeitsherzmodelle wurden verwendet, um die Auswirkungen von Belastungsbedingungen, Herzfrequenz und Medikamenten auf die myokardiale Leistung auf eine Weise zu verstehen, die in vivo nicht erreicht werden kann. Zum Beispiel beeinflussen inotrope Medikamente häufig auch die Vor- und Nachlast, was eine belastungsunabhängige Bewertung ihrer myokardialen Wirkungen in vivo ausschließt. Darüber hinaus ermöglicht dieses Modell die Probenahme von Abwässern des Koronarsinus ohne Kontamination durch den systemischen venösen Rückfluss, was eine Beurteilung des myokardialen Sauerstoffverbrauchs ermöglicht. Darüber hinaus hat das Aufkommen miniaturisierter Druck-Volumen-Katheter die präzise Quantifizierung von Markern sowohl für die systolische als auch für die diastolische Leistung ermöglicht. Wir beschreiben ein Modell, in dem der linke Ventrikel untersucht werden kann, während er unter kontrollierten Bedingungen sowohl Volumen- als auch Druckarbeit ausführt.

Bei dieser Technik werden Herz und Lunge einer Sprague-Dawley-Ratte (Gewicht 300-500 g) en bloc unter Vollnarkose entfernt. Die Aorta wird präpariert und für die retrograde Perfusion mit oxygeniertem Krebspuffer kanüliert. Die Lungenarterien und Venen werden ligiert und die Lunge aus dem Präparat entfernt. Anschließend wird der linke Vorhof mit einer separaten Venenkanüle, die an einem Vorspannblock befestigt ist, eingeschnitten und kanüliert. Sobald festgestellt wurde, dass dieses leckagefrei ist, wird das linke Herz belastet und die retrograde Perfusion gestoppt, wodurch das funktionierende Herzmodell entsteht. Die Lungenarterie wird eingeschnitten und kanüliert, um den Koronarabfluss zu sammeln und den Sauerstoffverbrauch des Myokards zu bestimmen. Ein Druckvolumenkatheter wird entweder retrograd oder durch apikale Punktion in den linken Ventrikel eingeführt. Falls gewünscht, können atriale Stimulationsdrähte platziert werden, um die Herzfrequenz präziser zu steuern. Dieses Modell ermöglicht eine präzise Steuerung der Vorspannung (mit einem linken Vorhofdruckblock), der Nachlast (mit einem Nachlastblock), der Herzfrequenz (mit Stimulationsdrähten) und der Sauerstoffspannung (mit Sauerstoffgemischen innerhalb des Perfusats).

Einleitung

Die Untersuchung von isolierten Organen erlaubt die Kontrolle von physiologischen Bedingungen über das, was in vivo möglich ist. Ex - vivo - Herzpräparate wurden zuerst von Otto Langendorff beschrieben, ^1, der ein isoliertes Modell mit retrograder Perfusion beschrieben. Anschließend anderen beschrieben , das Modell "working heart", in dem das Myokard sowohl Druck- und Volumenarbeit ausführt. ² Solche Präparate instrumental wurden Mechanismen der myokardialen Wirkung in Aufklären, ³ myokardialen Metabolismus, ^4-6 und Wirkungen von kardiotonischen Medikamente. ^{7- 9}

Der Einsatz von Medikamenten, die Kontraktilität verbessern, ist bei kritisch kranken Patienten häufig. Jedoch sind nur wenige Daten verfügbar, um die relativen Wirkungen dieser Medikamente auf die Kontraktilität und den myokardialen Sauerstoffverbrauch, Daten zu vergleichen, die in der Behandlung von Patienten mit klinischen Anzeichen einer Herzinsuffizienz in der postoperativen Einstellung nützlich sein können,^10. Da jedoch die meisten kardiotonische Medikamente beeinflussen nicht nur das Myokard, sondern auch arteriolar Widerstand, venöse Kapazität ¹¹ und eine Stoffwechselrate des Patienten ¹² ex vivo isolierten Herzmodell bleiben die optimalen Mittel , mit denen die Auswirkungen solcher Arzneimittel auf den zu studieren Myokard richtig.

Wir beschreiben die Verwendung eines ex vivo - Modell für die lastunabhängige Studie inotropen Medikamenten auf die myokardiale Funktion und Sauerstoffverbrauch. Herzen von Sprague Dawley-Ratten wurden unter Verwendung eines linksventrikulären Herzmodell Arbeits kanüliert und perfundiert eine modifizierte Krebs Henseleit Perfusat verwendet. Aortic und links wurden Vorhofdruck gesteuert. Druck-Volumen-Impedanz Katheter wurden für die kontinuierliche Überwachung der systolischen und diastolischen Funktion in den linken Ventrikel über apikalen Einstich platziert. Der Sauerstoffverbrauch wurde als der indexierten Differenz des Sauerstoffgehalts zwischen den linken atrialen perfus kontinuierlich gemessenaß und die Lungenarterie Abwasser. Medikamente werden sollten, wurden in den linken Vorhof Block infundiert getestet, und Veränderungen in der Herzleistung und Sauerstoffmetabolismus wurden mit einer unmittelbar vorhergehenden Basislinie gemessen und verglichen.

Protokoll

Dieses Protokoll wird unter einem aktuellen Protokoll im Rahmen der Tierpflege Institution und Verwendung Ausschuss durchgeführt.

1. Vorbereitung für das Studium

1. Schalten Sie das Wasserbad das Krebs-Henseleit-Puffer (KHB) Reservoir (auf 42 ° C) zu erwärmen.
2. Vorbereitung 16 L von KHB enthaltend (in mM) 128 NaCl, 5,7 KCl, 1,3 MgSO _4, 25 NaHCO _3, 2,7 CaCl _2, 0,53 EDTA, 0,54 NaC ₃ H ₃ O ₃ und 10,8 Dextrose. ¹³ Die Substratmassen sind wie folgt : 27,584 g NaCl, 1,58 g KCl, 0,578 g MgSO _4, 8,401 g NaHCO _3, 1,47 g CaCl _2, 0,744 g EDTA, 0,22 g NaC ₃ H ₃ O ₃ und 7,208 g Dextrose.
   Anmerkung: Diese Komponenten in konische Röhrchen in Pulverform gelagert werden kann zur Rekonstitution am Tag der Experimente.
   1. Filter 4 l deionisiertem Wasser durch einen 0,22 Mikron-Filter.
   2. In 3,7 L dieses Wassers in einen 4 LBecherglas. Fügen Sie alle Komponenten mit Ausnahme von CaCl ₂ zum Wasser.
   3. Man löst das CaCl ₂ in den verbleibenden 300 ml Wasser über einen separaten Becherglas verwendet wird .
   4. Oxydieren , die Lösung mit 95% O _2/5% CO ₂ in 1 L / min (LPM) für 5 min. Dies korrigiert den pH - Wert auf 7,40 erhöht und die Auflösung von CaCl _2.
   5. Fügen Sie die CaCl ₂ zu dem Rest des KHB.
   6. Fügen Sie den fertig KHB zu einem Reservoir und zirkulieren durch alle Schläuche für 30 min. Stellen Sie sicher, dass das System frei von makroskopischen Blasen ist. Oxygenat mit 95% O _2/5% CO ₂ bei 0,5 LPM.
      HINWEIS: KHB über Nacht im Kühlschrank können für nicht mehr als 1 gespeichert - vor 2 Tagen, brachte wieder auf Raumtemperatur und wieder gefiltert für den Einsatz. Nicht wiederverwenden KHB nicht zwischen den Experimenten.
   7. Bereiten Sie 2 x 50 ml sauberen Becher mit eiskaltem KHB und legen Sie sie in einen Eimer mit Eis in der Nähe der Dissektion Station. Stellen Sie sicher, dass der KHB ist eiskalt (und nicht gekühlt) vor Ex Begrünung des Herzens.
   8. Setzen Sie den Mikro Druck-Volumen (PV) Katheter in einem 10-ml-Spritze mit gefiltertem KHB gefüllt für 30 Minuten vor der Kalibrierung, den Anweisungen des Herstellers.
      HINWEIS: Die Temperatur des KHB verwendete PV Katheter bis 37 ° C so nahe wie möglich zu tränken sollte.
3. Bereiten Sie die Anästhesie und Sezieren Station für das Tier.
   1. Für ausreichende Isofluran in dem Reservoir. Zeichne bis 500 U Heparin in einer 1 ml-Spritze; legen Sie eine 26 Gauge (1/2 ") Nadel auf dieser Spritze. eine Maske Bereiten Sie das Tier für betäuben.
4. Stellen Sie die Aorten-Block Perfusionsdruck auf 80 mmHg und den linken Vorhof (LA) Block Perfusionsdruck auf 10 mmHg. Öffnen Sie sowohl die Aorten-Block und LA-Block zu ermöglichen, warme KHB zu tropfen. Wenn Sie bereit sind, das Tier zu sezieren, öffnen Sie die Aorten-Block heraus eine stetige langsame Tropf der KHB zu ermöglichen.
5. Kalibrieren Sie den PV-Katheter nach den Anweisungen des Herstellers.

"> 2. Vorbereitung der Tiere und Dissection

HINWEIS: Für beste Ergebnisse sorgen Tier zwischen 300 und 500 g; wir haben, dass ein Tier Gewicht zwischen 425 bis 450 g ist ideal für unser System nicht gefunden.

1. Anesthetize das Tier in einer Kammer mit Isofluran (1 - 2%), bis das Tier bewusstlos ist. Übertragen Sie das Tier auf die Dissektion Station und legen Sie die Narkosemaske mit Isofluran und Sauerstoff auf das Tier. Führen Sie Zehe Prise Niveau der Sedierung zu beurteilen. Bewerben Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
2. Injizieren Heparin, 500 Einheiten intraperitoneale in der Bauchhöhle. Erlauben 10 min für das Heparin absorbiert werden. Sichern Sie sich die Gliedmaßen des Tieres mit Klebeband Visualisierung des Thorax zu verbessern.
3. Dissection des Herzens.
   1. Sobald sichergestellt wird, dass es keine Antwort auf eine Zehe Prise ist, heben Sie die Haut weg von der Bauchhöhle mit einer Pinzette und dann mit einer Schere die Bauchhöhle einzuschneiden, nach der Kurve von ter Membran mit dem hinteren Winkel der Rippen zurück.
   2. Sobald die Membran sichtbar ist, unter Verwendung einer kleinen Schere entlang der vorderen Fläche der Membran nach der Richtung der vorherigen Schnitte geschnitten für den Eintritt in den Brustkorb zu ermöglichen. Erweitern Sie jeden Schnitt entlang der Axillarlinie bilateral nach der Achselhöhle.
      HINWEIS: Die nächsten Schritte effizient durchgeführt werden sollte, da Belüftung beeinträchtigt wird, sobald die Membran eingeschnitten wird.
   3. Ziehen Sie den Brustkorb nach vorne aus dem Xiphoidbasis mit einer Pinzette. Inzision das Perikard und Pleura.
   4. Identifizieren Sie die untere Hohlvene (IVC) und Aorta nur oberhalb des Zwerchfells und einfahren sie en bloc nach vorne stumpfen Pinzette verwenden.
   5. Mit großen, gebogenen Schere, machen schnell einen Einschnitt in der IVC und der Aorta, zieht das Herz und die Lunge aus der Brust en bloc. Geschnitten, um die Speiseröhre, die Luftröhre, brachiocephalic Arterien und Venen kranial das Herz und die Lungen aus dem Thorax zu entfernen. Excise die deinmic Gewebe mit diesem Block von Gewebe. Achten Sie darauf, nicht den proximalen Abschnitt der Aorta ascendens zu schneiden.
   6. Sofort tauchen Sie das Herz und die Lunge in eiskaltem KHB und bewegen auf die Langendorff-Apparatur, stellen jedoch zuvor als in Schritt 1 beschrieben.

3. Aortic Kanülierung

1. Legen Sie die Herz-Lungen-Komplex in einer flachen Schale und orientieren das Herz mit der Thymusdrüse und der großen Gefäße der Experimentator zugewandt und den hinteren Teil der Lunge in der Tabelle gegenüber. Ziehen Sie die beiden Lappen des Thymus auseinander und den Start der brachiocephalic Arterien aus der Aorta zu identifizieren.
   1. Drapieren die Aorta über den Rand der Schale und transect die Aorta unter Verwendung einer kleinen Schere etwa 5 mm oberhalb der Aortenklappe, gerade proximal zu dem Start des rechten Arteria subclavia.
      HINWEIS: Der Schnitt sollte eine saubere Runde Kreis ergeben - die Aorta im Querschnitt. Wenn es sich um Off-Winkel (dh ein breites oval)oder unvollständig sind, wiederholen Sie den Schnitt um das gewünschte Ergebnis zu erzielen. Dadurch wird eine effiziente Aorten-Kanülierung erleichtern.
2. Verwendung von 2 Paaren von gebogenen Pinzette auf beiden Seiten der Aorta, führen die Aorta über die Aortenkanüle (die langsam mit KHB tropft werden sollte). 2 mm unterhalb der Spitze der Kanüle - Die Aortenklappe sollte 1 sitzen.
   1. Nach Aorta Kanülierung neu positionieren die Zange senkrecht über der Aorta die Aorta in Position zu halten. Alternativ legen Sie eine kleine Klammer über die Aorta, die Herz-Lungen-Komplex in Position zu halten, eine einzige Experimentator ermöglicht dieses Modell zu vervollständigen.
3. Haben Sie ein Assistent eine Seiden 4-0 Naht passieren knapp unter der Zange und binden an ihren Platz, Looping um die Kanüle und binden mehrere Male sowohl vor als auch hinter dem Herzen. Öffnen Sie die Kanüle vollständig voll retrograden Aortenfluß zu beginnen. Beachten Sie das Herz kräftig schlagen.
   HINWEIS: Wenn das Herz nicht schnell zu schlagen beginnt (~ 200 BPM) und kräftig, diebinden oder Kanüle sein kann, eine oder beide der Koronararterien-Okklusionsbauteil. Wenn dies vermutet wird, entfernen Sie die Krawatte und setzen Sie sie von den Koronararterien entfernt. Wenn das Herz bläht und schlägt nicht, kann die Kanüle über die Aortenklappe sein. Wenn die Koronararterie Lecks (KHB Sprays aus der Aortenwurzel), die Kanüle näher an der Aortenklappe vorzurücken (dieses Phänomen kann auftreten, wenn eine Arterie brachiocephalica kanülieren anstelle der aufsteigenden Aorta).

4. Pulmonary Vein Occlusion und Vorbereitung der Lungenarterie für Kanülierung

HINWEIS: Der Zweck dieses Schrittes ist es, eine geschlossene linke atriale System zu schaffen, um sicherzustellen, daß alle Volumen und Druck von der linken Herzblock zu den linken Herzstrukturen übertragen wird. Nicht vollständig die Lungenvenen verstopfen könnte in Preload-Mangel und können die Ergebnisse verfälschen oder eine instabile Arbeits Herz Vorbereitung schaffen.

1. Entfernen Sie die Thymusdrüse Exposition von th zu verbesserne Lungenarterie (PA).
2. Manuell drehen, um die Aortenkanüle, so dass die hintere Seite des Herzens dem Bediener zugewandt ist. Präparieren aus die Schiffe auf der rechten Lunge führt. Hängen Sie die rechte Lungengewebe einer Pinzette auf, diese Schiffe umreißen. Mit mittelgroßen chirurgischen Clips (oder Naht), verschließen die rechte Lungenarterie und Vene und Bronchus mit einem einzigen Clip. Resezieren der rechten Lunge distal zu dem Clip.
   HINWEIS: Aufgrund der Schwierigkeiten in der Lungenarterie frei seziert, unsere Praxis ist, die Lungenvenen zu verschließen, die Lungenarterie zu blähen, es einfacher zu machen, ohne die in der Nähe Strukturen in einem Herzschlag-Modell zu verletzen einzuschneiden.
3. Wiederholen Sie Schritt 4.2 auf der linken Lunge.
   HINWEIS: Mögliche Gefahren und Problemlösung: Wenn beide Lungenarterien verschlossen sind, werden sichtbar den rechten Vorhof aufblähen und das Herz kann bradykardischen werden. Dies ist, weil der rechte Ventrikel wird unter Druck gesetzt. Wenn dies nicht geschieht, ist es wahrscheinlich, dass die pulmonary Venen sind nicht vollständig verschlossen, und die Vorspannung für Arbeits Herz Modus unzureichend sein. Wenn das Herz nicht in der Lage die Herzleistung nach links Vorhof (LA) Kanülierung und versuchte, den Übergang ins Berufs Herz (siehe unten) zu halten, sollten Sie zusätzliche Clips platzieren oder eine Krawatte um den Stümpfen Pulmonalvene restliche Leck zu verschließen. Sobald die PAs verschlossen sind jedoch Schritt 5 sollte sofort durchgeführt werden, myokardiale Ischämie zu minimieren. Beachten Sie, dass einige Forscher die Lungenarterie vor der Ligation der Pulmonalvenen einzuschneiden Druckbeaufschlagung des rechten Ventrikels zu vermeiden.
4. Pulmonale arterielle Einschnitt
   1. Drehen Sie die Aortenkanüle, so dass die Vorderseite des Herzens ist der Betreiber gegenüber. Identifizieren Sie die Lungenarterie. Wiederum kann diese Arterie aufgetrieben werden. Mit einer kleinen Schere machen einen Querinzision etwa 3 mm über der Pulmonalklappe.
      Hinweis: das wird sofort den Druck zu entlasten und die Herzfrequenz erhöhen. Seinverursachen diese Kanüle leicht zu lösen, kanülieren die Lungenarterie nach linksatrialen Kanülierung abgeschlossen ist.

5. Links Atrial Kanülierung

1. Drehen Sie die Aortenkanüle, so dass der linke Vorhof dem Bediener zugewandt ist. Mit Hilfe der kleinen Schere, machen Sie eine 2 - 3 mm Einschnitt in den Oberkörper des linken Vorhofs, ca. 3 mm über der atrioventricular Nut.
   1. Positionieren Sie den linken Vorhof Kanüle senkrecht zur Ebene der Mitralklappe und wies auf die atriale Septum.
   2. Öffnen Sie die LA Kanüle bis KHB fließt. Stellen Sie sicher, dass der KHB sich warm anfühlen, ist (es schnell kalt wird, wenn in jedem nicht-ummantelten Schlauch sitzend) um Myokarddysfunktion zu vermeiden wegen Hypothermie folgende Übergangsmodus zu arbeiten. Übergang zu einer Tropfrate während der Kanülierung.
2. Mit einer Pinzette Gegen Traktion, legen Sie die atriale Kanüle in den Körper des linken Vorhofs zu halten, dabei nicht excessi zu verwendenve Kraft, die das Atrium reißen kann.
   HINWEIS: Die sollten LA Kanüle positioniert werden, so dass sie ohne jede Spannung an der Vorhofwand in der Mitte des Atriums liegt.
3. Übergeben Sie eine 4-0-Seidenfaden um den Körper des linken Vorhofs und verknoten eine Abdichtung des Atriums um die Kanüle zu schaffen. Achten Sie darauf, um sicherzustellen, dass die hintere Seite des linken Vorhof in die Naht enthalten ist. Fügen Sie zusätzliche Nähte wie nötig. Einmal versiegelt, ziehen Sie die Kanüle zurück 1 - 2 mm, so dass es in der Mitte des Atriums sitzt und nicht gegen die Vorhofseptums.
   HINWEIS: Der häufigste Grund, dass das Herz beim Übergang Modus zu arbeiten Herz malperfused wird ist, dass die LA Kanüle die Vorhofseptums anstößt, das linke Vorhof Zufluss verschliesst. Die LA - Tracing ändert sich oft eine richtige eine Welle und v Welle zu zeigen , wenn die Kanüle in der richtigen Position ist (siehe Abbildung 2E).
4. Öffnen des Kanülenventil LA vollständig die volle Vorspannung zum linken Atrium zu verabreichen. Überwachen Sie dieTropfgeschwindigkeit aus dem Herzen (die von koronaren Abwasser kommt). Stellen Sie sicher, dass die Tropfgeschwindigkeit ändert sich nicht, wenn die LA Kanüle geöffnet ist. Ist dies der Fall, retie das Atrium um die Kanüle herum, wie in Schritt 6.4 beschrieben, da dies ein Leck in dem System darstellt.

6. Pulmonalarterieller Kanülierung und Übergang in den Arbeits Herz-Modus

1. Wenn myokardialen Sauerstoffverbrauch (oder anderen Substanzen in koronaren Ausflusses, wie Arzneimittelspiegel oder Cytokine) Messen, legen 1/32 "flexible Schlauch in dem Stand der Einschnitt in der Lungenarterie.
   HINWEIS: Der Sauerstoffverbrauch wird als die Differenz des Sauerstoffgehalts zwischen linksatrialen Perfusat und Pulmonalarterie Abstrom ² gemessen.
   1. Für die kontinuierliche Messung des myokardialen Sauerstoffverbrauchs, verwenden Sie eine in-line Sauerstoffelektrode des linken Atriums und Koronarsinus Abwasser zu vergleichen.
   2. Sammeln Sie Koronarsinus Abwasser (sowohl aus der Lungenarterie und tropft aus dem Herzen) in einem graduierten Zylinderinder für zeitlich Quantifizierung der koronaren Fluss.
   3. Berechnen myokardialen Sauerstoffverbrauch , wie vorstehend beschrieben. ²
2. Übergang in das Berufs Herz-Modus mit der retrograden Aorten-Pumpe abgeschaltet wird.
   HINWEIS: Wenn dies geschehen ist, wird der LA Druck die Vorbelastungsdruck und der Widerstand, die zuvor Widerstand jetzt Widerstand gegen Herzleistung liefert zur retrograden Pumpe in Langendorff-Modus Bereitstellen wurde, einen mittleren arteriellen Druck erzeugt wird. Wenn der mittlere arterielle Druck sinkt unter ~ 80 mmHg, ist die Ursache wahrscheinlich entweder Vorbelastung oder myokardiale Funktion verwandt. Das wahrscheinlichste Problem ist die linke Vorhof Kanüle, die nach dem Neustart des rückläufigen Pumpe eingestellt werden sollte.

7. Einsetzen des linksventrikulären Druck Volumen Catheter

HINWEIS: Der PV Katheter angeordnet werden kann entweder retrograden (durch die Aortenklappe) oder über apikalen Einstich. Der Vorteil der retrograden ist, dass position ist konsequenter und es entfällt die Notwendigkeit für apikal Stich- und den damit verbundenen Risiken der koronaren Verletzung oder Verlust der Vorspannung. Allerdings kann rückläufige Platzierung manchmal sehr schwierig sein, so dass wir beschreiben beide Techniken hier.

1. Bringen Sie einen 1.4 Französisch Druck-Volumen-Katheter mit dem Druckvolumen-Loop-System. Kalibrieren des Systems in warmem KHB nach den Anweisungen des Herstellers. Sicherstellen, dass die Wellenform in Echtzeit sichtbar ist. Bringen Sie den Katheter und Leitungen dicht an der Oberfläche des LV, um ihn nicht zu lösen nach der Platzierung.
2. Zur retrograden Platzierung, öffnen Sie das einstellbare Ventil und führen Sie den PV-Katheter sanft über die Aortenklappe, bis ein stabiler Druck und Volumenwellenform identifiziert werden. Vermeiden Sie übermäßige Anwendung von Gewalt, die die Aortenklappe beschädigen oder die Herzspitze durchstechen.
   HINWEIS: Es wird festgestellt, dass es wichtig ist, die Länge der Rohrleitung und die Anzahl der Windungen zu minimieren, die die PV-Katheter navigieren müssen die AV zu nähern. Eskann hilfreich sein, um den Schlauch, der mit dem System kommt zu senken.
3. Für apikal Platzierung, eine 24 G Angio-Katheter mit einem apikal Einstich in der LV zu schaffen. Achten Sie darauf, den linken vorderen absteigenden Koronararterie zu vermeiden. Richten Sie die Nadel in Richtung der Aortenklappe von der Herzspitze. Voraus, um den Druck-Volumen-Katheter in den Körper des LV. Beenden Sie die Katheters sobald der LV Druck und Volumenwellenform identifiziert wird.
4. Sobald der Druck-Volumen-Katheter an Ort und Stelle ist, bewegen Sie den Wassermantel in die richtige Position um das Herz. Befestigen Sie den Katheter an der Wand des Wassermantels mit einem kleinen Stück Klebeband.
5. Stellen Sie sicher, mindestens einen Zeitraum von 30 Minuten von Stabilität vor irgendwelche Messungen oder Eingriffe zu beginnen.

8. Die Infusion von Medikamenten

1. (Optional) Infuse Medikamente (zB Dopamin) in den linken Vorhof - Block eine Standardmedikation Pumpe.
   Anmerkung: Wir haben dosierte Medikamente nach dem whole Körpergewicht des Tieres, da Strömung äquivalent zu einem vollständigen Herzleistung geht durch den Vorhof-Block; nur ein kleiner Teil davon gelangt durch die koronare Durchblutung, wie es in vivo macht. Alternativ kann ein zweiter Satz von Perfusat mit einer vorgegebenen Konzentration von Medikamenten geschaffen werden und verwendet, um das Herz perfundiert.
   HINWEIS: In unserem Protokoll infundieren wir Medikamente über einen 12-minütigen Zeitraum, physiologische Daten, die während der letzten 10 min von jeder Infusion gesammelt und zu einer unmittelbar vorangehenden 10 min Basislinie verglichen wird.

9. Physiologische Manipulations

1. Puls
   1. (Optional) Naht zwei Stimulationsdrähte auf die rechte Vorhofwand und heften sich an einem temporären Stimulationsgerät.
      HINWEIS: Dies ermöglicht eine genaue Steuerung der Herzfrequenz (oberhalb der nativen Sinusfrequenz) und ein Verständnis für die Beziehung zwischen Herzfrequenz und Kontraktilität unabhängig von einer cardiotonischen Medikamenten.
2. Preload
   1. variieren Sie dieVorspannung (als linksventrikuläre enddiastolische Volumen definiert ist), indem die Höhe der Säule Variieren des linksatrialen Block speist.
3. Blutdruck
   1. Betätigen Sie den Blutdruck (der primäre Faktor für die Nachbelastung in diesem Modell) unter Verwendung der Druckventile auf der IH-51.
4. Koronare Sauerstoffgehalt
   1. Erledigen unterschiedlichem Ausmaß der myokardialen Hypoxie durch das Herz mit KHB Perfusion in verschiedenen Gasmischungen gesättigt. Tun Sie dies durch separate Mantel Reservoirs mit (jeweils mit eigenem Gasgemisch) Gleichgewicht zwischen dem Gas und KHB zu gewährleisten.
   2. Erledigen koronare Ischämie durch die Naht mit einem distalen Koronararterie Ligatur.
      HINWEIS: Die Unterbindung der proximalen Koronararterien im Arbeits Herz-Modus in tödliche Myokarddysfunktion führen kann.
   3. Induzieren global koronare Ischämie durch Unterbrechung oder retrograder Perfusion für eine definierte Zeit verzögert.

Ergebnisse

Eine schematische Darstellung einer voll instrumentierten Herz in retrograder Perfusion (1A) und in die linksventrikuläre Herzarbeits (1B). Typische Aorten, linke atriale und linksventrikulärer Druck und Volumen - Kurven sind in Figur 2A gezeigt -. D Die typische enddiastolischen Druck etwa 3 bis 5 mmHg in diesem Modell, und der systolische Spitzendruck etwa 100 mmHg 2E veranschaulicht die Änderung. in atrialen Verfolgungs links, wenn die LA Kanüle aus dem Vorhofseptum während der Platzierung und Positionierung der Kanüle wegbewegt wird. In diesen Experimenten wurde Aortendrucks bei 90 mmHg eingestellt, und LA Druck auf 10 mmHg eingestellt.

Um die Effekte von Katecholaminen testen, wobei jeder physiologische Parameter (vor allem aus dem Druck-Volumen-Katheter abgeleitet und zugeordnete Software) wurde im Vergleich zu dem unmittelbar vorhergehenden Basisperiode. In dem gezeigten Beispiel ist Dopamin wurde bei 15 & mgr; g / kg / min in den linken Vorhof-Block infundiert. Obwohl das enddiastolische Druck in den beiden Bedingungen, die identisch ist (der feste atrialen Druck in diesem Modell angegeben), verringert sich die linksventrikuläre enddiastolische Volumen um 2,5% und der linksventrikulären endsystolischen Volumen verringert sich um 4,9%, eine erhöhte Schlagvolumen Nachgeben (3A). Im Vergleich zu Placebo - Infusionen, die linksventrikuläre Hubarbeit, identifiziert als der Bereich innerhalb der Druck-Volumen - Kurve, erhöht um 32% während der Behandlung mit Dopamin (3B, P <0.001, t - Test, n = 10 pro Gruppe). Dies wurde mit einem stärkeren Anstieg der myokardialen Sauerstoffverbrauch im Vergleich zu Placebo - Infusionen (3C) zugeordnet ist . Auf diese Weise kann die relative Potenz und Energiekosten von verschiedenen cardiotonischen Medikamenten und Dosierungen zu einander unabhängig von deren Auswirkungen auf die Belastungsbedingungen verglichen werden.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung der Strömung in einem Voll instrumentierte Herz in Retroperfusion und Arbeits Herz - Modus (Panel A: Langendorff - Modus; Feld B:.. Arbeits Herz - Modus Im retrograden Modus wird KHB bei einer eingestellten Perfusionsdruck in die Aortenwurzel infundiert. dieser Modus wird verwendet , um das Myokard folgende ischämischen Zeit und während der Instrumentierung zu erholen. im Herz - Modus arbeiten, Perfusat das linke Herz fließt durch , bevor Sie den Koronarkreislaufs Perfusion. In diesem Modus muss das Myokard seine eigene Perfusionsdruck erzeugen. Bitte klicken Sie hier um zu sehen eine größere Version dieser Figur.

Fild 2: Repräsentative Druck und Volumen Tracings während der Baseline Messungen. (A) Aortic Wurzeldruck, (B) des linken Atriums Druck, (C) linksventrikulären Druck und (D) linksventrikuläre Volumen Kurven während einer Baseline - Messung angezeigt werden. Hubvolumen, Schlaganfall Arbeit, Herzzeitvolumen, tau, und andere Parameter können automatisch von der Software in Echtzeit berechnet und angezeigt werden. Ein stumpfer linksatrielle Tracing (E) mit einem schlechten Herzleistung zugeordnet ist, in Arbeits Herz - Modus kann ein Hinweis sein , dass die Kanüle in den linken Vorhof Fehlpositionierung wird. Beachten Sie, dass die prominente v Welle in der gut platzierten linken Vorhofdruckkurve ist weit verbreitet, wahrscheinlich aufgrund einer verringerten linken Vorhofs Compliance in der voll instrumentierten Tier. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3:. Wirkung von Dopamin auf die Druck-Volumen - Kurve Dopamine Infusion führt zu einer Verschiebung nach links in der PV - Kurve (A), einschließlich einer erhöhten Schlagvolumen verringerte systolische Volumen zu beenden, verglichen mit Baseline - Messungen. Man beachte , dass die Form einiger Komponenten dieser PV - Kurven von denen unterscheiden , die typischerweise in vivo gemessen aufgrund der Abwesenheit von arteriellen und venösen Elastanz (siehe 4). (B) Relative zu einem unmittelbar vorhergehenden Ausgangswert erhöht Hubarbeit deutlich während Infusionen von Dopamin als Placebo (**, P = 0,0017, t-Test), wie auch den myokardialen Sauerstoffverbrauch (*, P = 0,013, t-Test, C). Unter Verwendung dieses Modells war die durchschnittliche myokardialen Sauerstoffverbrauch zu Beginn der Studie 0,22 ± 0,02 mmol O ₂ / Gramm Gewebe / Minute, eine geschätzte dissolv mited Sauerstoffgehalt von 165 & mgr; mol / L in Kochsalzlösung bei 40 ° C Solche Messungen können die myokardialen Sauerstoffverbrauch verschiedener Medikamente zu vergleichen verwendet werden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Analyse der Druck Volumen Loops. Die theoretische Druck-Volumen - Kurve gezeigt Beschreibt den normalen Herzzyklus Aortenklappe (AV) Verschluss (1) Im Anschluss an , isovolämischen Kontraktion (1 - 2) auftritt. Als ventrikuläre Druck sinkt unter Vorhofdruck. Die Dauer dieser Phase wird durch Tau dargestellt. Die Mitralklappe (MV) , dann öffnet sich gleichzeitig mit Vorhof Systole des Ventrikels Füllung (2 - 3). Systole beginnt dann mit isovolämischen contraction (3 bis 4) , bis ventrikulären Druck übersteigt Druck diastolischer arterieller, zu welcher Zeit das AV öffnet. Hubvolumen ist der Unterschied zwischen den Zeilen 1 - 2 und 3 -. 4 - Takt Arbeit ist der Bereich innerhalb des 1 - 2 - 3 -. 4 Kurve Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Dieses Arbeitsherzmodell erlaubt die Beurteilung der ventrikulären Leistung mit voller Kontrolle über Vorlast und Nachlast, Sauerstoffspannung des Perfusat sowie Herzfrequenz. Unter anderen Faktoren erlaubt es Beurteilung der intrinsischen myokardiale Wirkung von inotrope Medikamente unabhängig von Nachlast und Vorspannung, die Art und Weise , die nicht möglich sind , unter Verwendung eines in - vivo - Modell. Da dieses Modell eine kristalloider Perfusat verwendet, es Beurteilung das Myokard ohne Interferenz von Hämoglobin ermöglicht es , die spektroskopische Analyse der myokardialen Energiezustände zu vereinfachen, zum Beispiel. ¹⁴ In diesem Modell wird der rechte Vorhof nicht als Teil unserer Instrumentierung einer Kanüle versehen, obwohl es möglich ist , zu tun. Wir wählten absichtlich nicht so zu tun, um Probenahme von koronaren Sinus Fluss für die Beurteilung der myokardialen Sauerstoffverbrauch zu erleichtern. Wichtig ist aber, führt das rechte Herz immer noch Druck und Volumen der Arbeit in diesem Modell, wie es die Co-Pumpenronary Sinus fließen in die Lungenarterie Kanüle. Eine rechte ventrikuläre Vorspannung Bereitstellung verbessert Positionierung des Ventrikelseptums und verbessert die linksventrikuläre Leistung und ist ein wichtiger Bestandteil dieses Modells. ¹⁵

Es gibt mehrere experimentelle Fallen zu nennen. Die erste ist die anfängliche retrograden Kanülierung, die zweckmäßigerweise durchgeführt werden sollte (dh in weniger als 2 min) , um den Zeitraum der Ischämie zu minimieren. Die wichtigste Fähigkeit zu meistern ist die effiziente Isolierung, Herstellung und Handhabung der aufsteigende Aorta. Es ist wichtig, dass die Aortenstumpf nicht übermäßig kurz geschnitten werden, nicht ausreichend Platz für Kanülierung oberhalb der Aortenklappe zu verlassen. Es ist jedoch auch wichtig, dass der Aortenstumpf nicht zu lang sein, die Anziehhülse der Aorta um die Kanüle führen kann. Es ist auch wichtig, dass die Aorta Kanüle und Aortenwurzel geeigneter Größe abgestimmt sein. Eine zu große Aorta auf einer kleinen Kanüle kann auchführen zu Torquen der Aortenwurzel an der Kanüle. Die rechte Subclavia dauert in der Regel von der aufsteigende Aorta ca. 7 mm über der Aortenklappe ab. Die Ermittlung der brachiocephalic Gefäße (ca. 1 mm Durchmesser) bei der Präparation und Beschneiden der Aorta dienen als wichtige Ziele für die Quer Aorten-Schnitt. knapp unter dem Start der ersten brachiocephalic Arterie der Aorta Trimmen ist ratsam. Die Aufnahme dieses Schiffes in der getrimmten Aortenwurzel führt typischerweise zu einer Leckage von KHB und Verlust der Aortenwurzel Druck auf den Übergang in die Arbeits Herz-Modus.

Eine weitere technische Herausforderung Aspekt der Kanülierung ist die linke Vorhof Kanülierung. Obwohl es möglich ist, das linke Herzohr zu kanülieren fanden wir, dass die Kanüle häufig im Anhängsel stecken bleibt, und geht nicht leicht in den Körper des linken Atriums. So bevorzugen wir, den Einschnitt in den Körper des linken Vorhofs zu bilden, ungefähr2 mm überlegen atrioventriculare Nut. Es ist wichtig, die linke Vorhof Kanüle in der richtigen Ebene vor dem Einsetzen, um den dünnwandigen Atrium zu vermeiden, zu positionieren, Reißen, wenn die Kanüle zu sichern.

Wir fanden, daß die optimale Größe des linken Vorhofs Inzision von etwa 3 mm betrug. zu klein eines Einschnitts Erstellen kann auch die Platzierung der linken Herzkanüle erschwert und kann zum Reißen des linken Vorhofs führen. Wir verwenden eine gerade, 8 mm, abgeschrägte Stück sauerstoffundurchlässigen Schlauch (Innendurchmesser 2,9 mm) auf der linken Vorhofblock. Wir haben festgestellt, dass diese, anstatt eine Kanüle mit einer abgeschrägten Kante, führt zu beständigsten atrial Kanülierung und erleichtert den Prozess des linksatrialen Block sichern. Unabhängig von der Rohrleitung verwendet wird, ist es wichtig zu gewährleisten, dass das Ende des Rohres nicht durch die atriale Septum oder die Mitralklappe verschlossen ist (wie oben dargestellt, fanden wir, dass die linke atriale Druck Verfolgung in diesem rega hilfreich warrd), als auch subtile Bewegung der Vorhof Kanüle deutlich linksventrikulären Vorbelastung und die daraus resultierenden hämodynamischen Messungen verändern. Aus dem gleichen Grund ist es wichtig, um sicherzustellen, dass der linke Vorhof mit der linken nach dem Öffnen Vorhofblock nicht folgende entweicht. Es ist wichtig, unabhängig von der Art des Schlauches verwendet, um sicherzustellen, dass der Schlauch in diesem System ist Sauerstoff undurchlässig für ausreichende Sauerstoffversorgung des Herzens gewährleisten.

Eine weitere technische Herausforderung Aspekt des Verfahrens war die Platzierung des Druck-Volumen (PV) Katheter. Wir begünstigt zunächst ein retrograder Plazierung des Katheters durch den Aorta Block. Obwohl technisch machbar, wir fanden es viel einfacher und sinnvoll sein, um die PV-Katheter über Transapikal- Einstich zu platzieren. Sorgfalt muss die Position des Katheters während der gesamten Dauer des Experiments zu überwachen genommen werden, da manchmal kann der Katheter in das oder aus dem linken Ventrikel zu bewegen. Dies kann durch Überwachung der pressu geschehenre und Volumen Kurven über die Zeit.

Schließlich sollte darauf geachtet werden, sicherzustellen, dass KHB Lösung für jedes Experiment frisch erstellt wird. Es ist möglich, die Bestandteile von KHB abzuwiegen und speichern sie in konische Röhrchen in Pulverform vor der Zeit. Am Tag des Experiments, mit sterilem, gefiltertes Wasser, Kohlendioxid / Sauerstoff, und dann können diese Calcium zu der Mischung zugegeben gemischt werden. Es ist auch wichtig, das System mit Enzym aktiv Waschpulver wie Tergazyme (oder ähnlich) und ersetzen Sie das Perfusat Filter regelmäßig zu waschen.

Mehrere Grenzen dieser Versuchsvorbereitung zu beachten. Erstens, ähnlich wie bei allen kristalloider perfundierter Langendorff-Präparate, KHB und andere asanguinous perfusates haben eine deutlich verminderte Sauerstofftransportfähigkeit in Bezug auf Blut. Obwohl dies teilweise durch koronare Vasodilatation und supraphysiologischen Koronarfluss kompensiert wird, ist die Herstellung nicht vollständig physiologic aus diesem Grund. Zweitens, wegen der nahezu unendlichen Nachgiebigkeit der Windkesselraum in diesem Instrument verwendet wird , werden nur die systolischen und diastolischen Druck minimal voneinander getrennt und damit die koronare Perfusionsdruck ist nicht physiologischen (siehe 2A). Dies kann in zukünftigen Modellen durch Einbau einer elastance Komponente zur Nachbelastung Block überwunden werden. Drittens, wie bei allen isolierten Herzpräparationen erfährt das Herz einen definierten Zeitraum (2 bis 3 min) von warmer Ischämie die wahrscheinlich myokardialer Verletzung oder Dysfunktion zu schaffen. diese Verletzung durch die Praxis der Technik zu minimieren ist von größter Bedeutung für repräsentative Ergebnisse. Obwohl ferner notwendig für den Tierschutz, kann inhalativen Anästhetika als myokardiale Unterdrückungs in den frühen Reperfusion Prozess dienen, obwohl erwartet wird, dass dieser Effekt schnell wie das Herz mit KHB Reperfusion wird abgeschafft wird.

Die Arbeitsherz beschriebene System ermöglicht eine große Vielfalt von physiologic Untersuchungen relevant für die Patientenversorgung, Forschung und Lehre. Mit einigen zusätzlichen Modifikationen kann das System auch wichtig Physiologie zu simulieren relevant kongenitaler Herzkrankheit, einschließlich der pulmonalen Hypertonie und Einzel Ventrikel Physiologie verwendet werden. Einschränkungen umfassen , dass es eine ex - vivo - Herstellung ist, dass das Herz durch einen Puffer anstelle eines höheren Sauerstoffgehalt Blut perfundiert wird.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Natriumbicarbonat	Sigma-Aldrich	S5761	8,401 g/4 L
Ethylendiamintetraessigsäure	Sigma-Aldrich	E6758	0,744 g/4 L
Kaliumchlorid	Sigma-Aldrich	P9333	1,580 g/4 L
Magnesiumsulfat	Sigma-Aldrich	M7506	0,578 g/4 L
Natriumpyruvat	Sigma-Aldrich	P2256	0,220 g/ 4 l
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S3014	27,584 g/4 l
Dextrose	Sigma-Aldrich	D9434	7,208 g/4 l
Calciumchlorid-Dihydrat	Sigma-Aldrich	C7902	1,470 g/4 l
biventrikuläres Arbeitsherzmodell	Harvard Gerät	IH-51
Druckvolumenkatheter	Millar, Inc	SPR-944-1	Verwendeter Katheter mit 6 mm Abstand
LabChart Pro 8	AD-Geräte	Version 8.1