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Summary

Dieser Strömungs Adhäsionsassay stellt eine einfache, hochschlag Modell von T-Zell-epithelialen Zell-Wechselwirkungen. Eine Spritzenpumpe wird verwendet, Scherspannung zu erzeugen, und die konfokale Mikroskopie erfasst Bilder für die Quantifizierung. Das Ziel dieser Studien ist es, um effektiv T Zelladhäsion quantifizieren Strömungsbedingungen.

Abstract

Insgesamt ist T Zelladhäsion eine kritische Komponente der Funktion, einen Beitrag zu den unterschiedliche Prozesse der zellulären Rekrutierung von Entzündungsherden und die Wechselwirkung mit Antigen-präsentierenden Zellen (APC) in der Bildung von immunologischen Synapsen. Diese beiden Kontexte T Zelladhäsion unterscheiden, daß T-Zell-APC-Interaktionen statisch betrachtet werden können, während T-Zell-Wechselwirkungen Blutgefß durch die Scherbeanspruchung durch Zirkulation selbst erzeugt werden, in Frage gestellt. T-Zellen-APC-Wechselwirkungen werden als statisch klassifiziert, dass in den beiden Zellpartnern sind statisch relativ zueinander. Normalerweise tritt diese Wechselwirkung innerhalb der Lymphknoten. Als eine T – Zelle mit der Blutgefäßwand in Wechselwirkung tritt, verhaften die Zellen und muss die erzeugte Scherbeanspruchung zu widerstehen. ^1,2 markieren Diese Unterschiede die Notwendigkeit einer besseren statischen Haftung und Haftung unter Strömungsbedingungen als zwei unterschiedliche regulatorische Prozesse zu verstehen. Die Regulation der T-Zell-Adhäsion am meisten werden kann kurz und bündig als con beschriebenTrolling die Affinitätszustand von Molekülen exprimiert auf der Zelloberfläche Integrin, und somit die Wechselwirkung von Integrinen mit den adhesion molecule-Liganden auf der Oberfläche der Zelle exprimiert Interaktion reguliert wird. Unsere aktuellen Verständnis der Regulation von Integrin Affinität Staaten kommt von häufig vereinfachend in vitro Modellsystemen. Der Test der Adhäsion Strömungsbedingungen unter Verwendung von hier ermöglicht folgenden Stimulus für die Visualisierung und genaue Quantifizierung von T-Zell-epithelialen Zell-Wechselwirkungen in Echtzeit beschrieben. Eine Haftung unter Strömungs Assay kann auf Studien der Haftung angewendet werden Signalgebung innerhalb von T-Zellen nach der Behandlung mit inhibitorisch oder stimulatorisch Substanzen. Darüber hinaus kann dieser Test über T-Zell-Signalgebung auf jede Klebe Leukozytenpopulation und jedes Integrin-Adhäsionsmolekül Paar erweitert werden.

Introduction

T – Lymphozyten – Adhäsion vermittelt eine Anzahl verschiedener Prozesse in einem gesunden Immunsystem, ³ entscheidende Rolle bei der T – Zell – Handel und Antigenpräsentation spielen. Ob bei der Immunüberwachung oder eine aktive Immunantwort diese beiden Rollen breiten für die Haftung sind kritisch. ⁴ Die physiologischen Signalereignisse von T – Zell-Endothel-Interaktionen unterscheiden sich von T – Zell-Antigen – präsentierenden Zellen (APC) Wechselwirkungen und erfordern daher unterschiedliche Methoden Studie am besten verstehen, die signal~~POS=TRUNC beteiligt. Die feste Haftung einer T-Zelle zu einer Blutgefäßwand während der Lymphozyten-Extravasation erfordert eine schnelle und dynamische Integrin-Aktivierung. Die enge Wechselwirkung zwischen einem aktiven Zustand Integrin und Adhäsionsmoleküle entlang des Endothels führt zu beständige Haftung auf den Fluss von Blut, T – Zellen , so dass auf der Suche nach einer Fläche permissive Zellpassage entlang der Oberfläche zu kriechen. ⁵ Das Crawling einer T – Zelle bi -directionally Alonga Blutgefßwand ist angewiesen auf polarisierter Adhäsion, mit einem ausgeprägten Klebe vorderen Ende der T – Zelle. ⁶ Am wichtigsten ist, feste Adhäsion und Transmigration erfordern Widerstand gegenüber der Scherkraft , die durch den Blutfluss zirkuliert.

Wenn Experimente entwerfen Lymphozytenadhäsion zu studieren, sollten ihr Augenmerk auf den spezifischen Reiz von Zinsen gezahlt werden. Während Integrin-Aktivierung eine übliche und wichtige Komponente für alle Formen der T-Zell-Adhäsion, sind die Kaskaden von der Aktivierung wahrscheinlich einzigartig nachgeordnet einzelnen Rezeptoren und Co-Rezeptoren zu sein. Ebenso funktionieren Integrin und Adhäsionsmolekül-Paare in spezialisierten Mikroumgebungen und auf spezifische Subpopulationen. Auf diese Weise können diese Paare ganz anders geregelt werden. Das Modell präsentiert hier ist ideal für die Untersuchung von Signalkaskaden , die zu Integrin – Aktivierung unter Scherspannungsbedingungen nehmen. ⁷ Diese Wechselwirkungen können nicht adäquat in einem statischen ADHESI verstanden werdenauf System , um die Auswirkungen durch diese Kräfte direkt auf T – Zellen – Verhalten gezeigt haben , wurden. ⁸ Obwohl hier mit T – Zellen und CHO (Chinese Hamster Ovary) Zellen entwickelt , um menschliche ICAM-1 (CHO-ICAM – Zellen) exprimieren das System präsentiert werden , können leicht modifiziert werden, um verschiedene Leukozytenpopulationen oder Adhäsionsmoleküle zu untersuchen.

Dieser Test stellt ein Verfahren T-Zell-Klebrigkeit und Integrin-Aktivierung unter Verwendung von Scherspannung zu quantifizieren, ein Modell für die feste Haftung Stadium der Leukozytenextravasation bereitstellt. Durch die Verwendung von CHO-Zellen ICAM die Affinität von LFA-1 für seinen Liganden in lebenden Zellen können in Echtzeit in Reaktion auf verschiedene Stimuli von Interesse untersucht werden. Diese Technik erfordert einfach erhalten, im Handel erhältliche Mikroströmungskammern in Kombination mit einer Spritzenpumpe, stark die Ausrüstung vereinfacht notwendigen Durchblutung und Scherspannung im Vergleich zu anderen Modellen. ⁹ Ein weiterer großer Vorteil dieses Assays zu modellieren ist , dass spezifische SignalKaskaden und der resultierende Aktivierungszustand einzelner Integrine sauber durch die Verwendung von gentechnisch veränderten CHO-Zellen können menschlichen Adhäsionsmoleküle von Interesse exprimieren, untersucht. Darüber hinaus ist die Kombination von quantitativen Daten mit lebenden Zellen ein wesentlicher Vorteil dieser Methode. Insgesamt während eine Reihe von Tests der statischen T Zelladhäsion beschrieben wurden, die gut T-Zell-APC-Interaktionen zu modellieren, sind diese Modelle nicht ausreichend in den dynamischen Prozess der T-Zell-epitheliale Adhäsion zu erfassen. Aus diesem Grund wird, wenn ein Adhäsionstest der Reiz in Frage entscheiden müssen berücksichtigt werden.

Protocol

1. Auflage die CHO-Zellen ICAM Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist die CHO-ICAM-Zellen in den Strömungskammern für das Wachstum über Nacht mit dem Ziel der Erzeugung einer konfluenten Monoschicht zu plattieren. Pflegen CHO-ICAM-Zellen in 10 cm Gewebekultur behandelten Kulturschalen in 10 ml RPMI-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (CHO-ICAM kompletten Kulturmedium) bei 37 ° C mit 5% CO 2. Um Zellen zu sammeln, 1 ml 0,5% Trypsin-EDTA und Inkubation bei Raumtemperatur für 1 min unter leichtem Schütteln. Neutralisieren des Trypsins mit 4 ml Medium. Zählen Sie die CHO-ICAM – Zellen eine Hemacytometer mit und berechnen 0,75 x 10 5 Zellen pro Kammer. Anmerkung: In diesem Experiment: 2.25 x 10 5 Zellen werden auf Saatgut 3 Kammern erforderlich sein. Zentrifuge 0,75 x 10 5 CHO-ICAM – Zellen pro Kammer für 5 min bei 500 · g, Raumtemperatur und Resuspendieren des Zellpellets in 30 & mgr; l pro Kammer von CHOICAM komplette Kulturmedien. Anmerkung: In diesem Experiment 90 & mgr; l wird auf Saatgut 3 Kammern erforderlich sein. Fügen Sie langsam die Zellen in ein Reservoir der Strömungskammer. Lassen Sie die Zellen für 5 min in 37 ° C – Inkubator mit 5% CO 2 zu begleichen. In 200 ul kompletten Kulturmedien über die beiden Stauseen jeder Kammer. Abwechselnden Zugaben zwischen den beiden Bewegung der Zellen zu vermeiden, da das System äquilibriert. Inkubieren der Zellen über Nacht in einem 37 ° C – Inkubator mit 5% CO 2. 2. Herstellung der T-Zellen Anmerkung: Dieser Test kann mit primären humanen T-Zellen oder T-Zelllinie durchgeführt werden. Ein Protokoll auf T – Zell – Isolierung aus Blut zuvor beschrieben worden ist . 10 Bei der Verwendung von primären humanen T – Zellen frisch isolierten Zellen für beste Ergebnisse. Wenn eine T-Zelllinie verwenden, befolgen Sie die Kultur-Protokoll durch die Quelle der Zellen angegeben. Um die Zellen auf einem Fluoreszenz microsco nachzuweisenpe die T-Zellen mit Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) markiert sind. Zählen Sie die T – Zellen eine Hemacytometer mit und berechnen 2 x 10 6 Zellen pro Kammer. Anmerkung: In diesem Experiment wurden 6 x 10 6 Zellen werden für 3 Kammern erforderlich sein. Zentrifuge 2 x 10 6 T – Zellen pro Kammer für 5 min bei 500 · g, Raumtemperatur und Resuspendieren der Zellen in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) , enthaltend 1% Glucose oder 2% FBS. In CFSE bei 1: 1000 Verdünnung (Lager aus bis 5 mm). Cover von Licht und Inkubation für 8 min bei RT Spin bei 500 × g für 5 min, RT. Resuspendieren Zellpellet mit 240 & mgr; l pro Zustand (siehe Kapitel 4 "Hinweis") von RPMI Medium ohne Serum. In diesem Experiment Zellpellet in 720 ul RPMI Ebene. Teilen Sie die Zellen in leere 1,5-ml-Röhrchen für jede Kammer beschriftet, 240 & mgr; l pro Röhrchen. Halten Sie Zellen in einem 37 ° C Wärmeblock bis zur Verwendung. 3. Definieren von the Input / Output Verschlauchung und Spritzenpumpe Wärmen Sie das Mikroskop Live-Imaging-Kammer auf 37 ° C. Bereiten Sie die Eingabe Verschlauchung: Füllen Sie eine 500 ml Glasflasche mit Wasser und machen zwei Löcher in den Deckel. Beschriften Sie die Löcher "in" und "out". Dies wird für die Eingabemedien als Heizwasser Bad handeln. Führen Sie die Eingabe durch die Löcher in dem Deckel und in das Wasserbad abspritzen. Stellen Sie sicher , dass die Seite des Schlauches, der an der Spritze verbindet kommt durch die "in" Loch und der Seite , die mit dem Eingangsbehälter verbinden die "out" Loch kommt durch. Spülen Sie die Eingabe mit 60 ml Wasser abspritzen alle Luft aus dem System zu entfernen. Prime die Eingangs hosing mit RPMI – Medium Serum fehlt erwärmt auf 37 ° C. Füllen Sie eine 60-ml-Spritze und drücken durch die Medien, bis der Schlauch vollständig grundiert und ohne alle Luftblasen. Hinweis: Je nach length Schlauch verwendet, um das Volumen zu grundieren erforderlich variieren. Berechnen des Volumens der Medien für das Experiment erforderlich, indem die Strömungsgeschwindigkeit multipliziert wird (hier 0,3 ml / min) durch die Anzahl der Minuten (5 min) durch die Anzahl der Kammern in dem Experiment (hier 3); in diesem Experiment verwendet werden 4,5 ml Medium. Hinweis: Wir empfehlen 5 ml zusätzliches Volumen (hier in Höhe von insgesamt 9,5 ml) in der Spritze verbleibenden nach dem Grundieren. Platzieren Sie die gesamte Eingabe – Setup in die Live – Bildgebung Gehäuse des Mikroskops 37 ° C zu halten. Führen Sie den Schlauch und Spritze aus dem Gehäuse heraus und laden Sie die Spritze in die Spritzenpumpe. Bereiten Sie die Ausgabe Verschlauchung: Machen Sie ein Loch in den Deckel einer 250 – ml – Flasche als Ausgangs Abfall zu verwenden. Führen Sie den Ausgangsschlauch durch das Loch und in die Flasche. Angelehnt an die Deckel zu sichern, nicht den ganzen Weg zu schließen. Legen Sie die Ausgabeeinstellung in die Live – Imaging – Gehäuse des mikop. Berechnen der Fließgeschwindigkeit (ml / min) erforderlich , um die gewünschte Scherbeanspruchung (dyn / cm 2) zu erzeugen. Schubspannung variiert in den verschiedenen Gefäßfächer, daher berücksichtigen, die Gesamtmodell einschließlich Zelltypen untersucht und Behandlungen werden, wenn sie auf einer Schubspannung Ebene zu entscheiden. Hinweis: Diese Experimente durchgeführt werden , bei 0,4 dyn / cm 2 bis eng eine kleine Vene Einstellung zu imitieren. Nehmen Sie die Kammer Dimensionen berücksichtigen, wenn sie Scherspannung zu berechnen. Verwenden Sie die folgende Formel ( zur Verfügung gestellt vom Hersteller 11) für die Strömungskammern verwendet hier (Siehe Tabelle der Materialien): T = η * 176,1 * ø wobei T = Schubspannung, η = dynamische Viskosität, ø = Durchfluss. Hinweis: Die dynamische Viskosität von RPMI-Medium bei 37 ° C 0,007 ist. 4. Laden der Strömungskammern und Stimulation der Zellen Hinweis: Um die Haftung zu initiieren,T-Zellen müssen stimuliert werden. In dem folgenden Experiment werden die Zellen bleiben entweder unstimuliert oder werden mit SDF-1α 12 oder Phorbolmyristatacetat (PMA; positive Kontrolle) stimuliert 13. Für die korrekte Darstellung von Chemokin auf T-Zellen, CHO-ICAM-Zellen werden mit SDF-1α (gefolgt von seriellen Wäschen), so dass für die Präsentation auf der Zelloberfläche vorinkubiert. PMA ist ein Phorbolester, die strukturell ähnlich dem zweiten Messenger Diacylglycerol (DAG) ist; hier wird es als positive Kontrolle verwendet. T-Zellen werden direkt mit PMA behandelt, bevor es in die Strömungskammer zu laden. Platzieren Sie die Flusskammer gleiten auf dem Mikroskop und stellen Sie die Fokusebene auf der CHO-ICAM einschichtigen die 20x-Objektiv verwendet wird. Halten Sie CFSE-gefärbten T-Zellen für alle anderen Bedingungen in der 37 ° C Heizblock. Herstellung der CHO-ICAM oder T-Zellen, wie dem Assay für den Zustand unmittelbar vor folgt: Für die nicht-stimulierten Zustand (Kammer 1) halten ein Rohr / Fluss chBernstein unbehandelt, als negative Kontrolle für die Stimulation dienen. Für PMA-Stimulation (Kammer 2), stimulieren eine Röhre von T-Zellen mit PMA (10 ng / ml) als Positivkontrolle zu dienen; sofort behandeln, bevor sie in Flusskammer geladen werden. Für SDF-1α Stimulation (Kammer 3), stimulieren die dritte Strömungskammer mit SDF-1α (100 ng / ml) von 70 & mgr; l zu einem Zeitpunkt 3 Mal von dem oberen Reservoir (Ausgangsbehälter) Entfernen und Hinzufügen dann 70 ul SDF -1α (100 ng / ml) in den unteren Behälter (Eingangsbehälter). Inkubieren für 5 min. Entfernen und entsorgen 70 & mgr; l zu einer Zeit , 3 – mal aus dem Ausgabebehälter von einer Kammer. Hinzufügen , 70 & mgr; l vorbehandelte (gegebenenfalls) T – Zellsuspension in den Eingangsbehälter 3 mal. Warten 5 min die Zellen zu ermöglichen, von dem Einlass der Kammer ( "In") zu bewegen, und dem proximalen Auslass ( "Out") der Kammer zu erreichen. Während dieser Zeit Bild 5Felder für CFSE-gefärbten T-Zellen. Wählen Felder, die während der Mitte der Kammer verteilt sind (Abbildung 1). Verwenden Sie die folgenden Anregungs- / Emissionsbedingungen: Anregung Laser-Wellenlänge: 488 nm; Emissionssammelfilter: 500 – 540 nm. Diese Bilder werden als die Pre-Flow-Zellzählungen dienen. Bringen Sie die Eingangs- und Ausgangsleitungen gleichzeitig an die Strömungskammer Stauseen. Hinweis: Anbringen der Schläuche gleichzeitig kritisch ist, so dass keine Luftblasen in die Kammer und die Aufrechterhaltung Gesamtgleichgewicht innerhalb der Kammer einzuführen. Beginnen Fluss bei 0,3 ml / min (0,4 dyn / cm 2) , während die CFSE-gefärbten T – Zellen sichtbar zu machen . Als Fluss beginnt, insbesondere mit der ersten Kammer, gibt es oft eine Verzögerung zwischen Strömungs Initiierung und T-Zell-Roll Beobachtung daher Zeitpunkt 5 min zu Beginn der T-Zell-Bewegung zu beginnen. Terminate Fluss nach 5 min und Bild 5 Felder in der CFSE-Kanal. Wählen Sie Felder zufällig verteilten throughout der Mitte der Strömungskammer (Abbildung 1). Diese Bilder werden als die Post-Flow-Zellzählungen dienen. 5. Bestimmung des Prozentsatzes von adhärenten Zellen Anmerkung: Die Bestimmung der Anzahl der Zellen in den erfassten Bildern wird objektiv mit automatisierter Software. Für unsere Untersuchungen verwendeten wir die Software Volocity (Version 6.2.1), aber auch andere Software wie ImageJ (Version 1.48V) sind ebenfalls anwendbar. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro Feld Pre-Flow für jede Bedingung. Der Mittelwert der 5 Feldern ist die "pre-Strömungs durchschnittliche Zellzahl." 7 Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro Feld Nachströmzeit für jede Bedingung. Der Durchschnitt der fünf Felder ist die "post-flow durchschnittliche Zellzahl." 7 Der prozentuale Anteil der adhärenten Zellen mit der folgenden Formel: Anteil der anhaftenden Zellen = (post-Strömungs durchschnittliche Zellzahl) / (pre-Strömungs durchschnittliche Zellzahl) x 100%.

Representative Results

Repräsentative Ergebnisse sind aus der Strömungs Adhäsionsassay gezeigt unter Verwendung von Jurkat und primären humanen CD3 + T – Zellen, wie angegeben, stimuliert mit SDF-1α. Die negativen Kontrollen in allen gezeigten Experimente sind nicht stimulierten Zellen. Ein Schwellenwert basal Prozent Anhaftung von nicht-stimulierten Zellen von 5 – 10%; Basis Haftung zeigt insbesondere eine problematische Experiment über diesem Bereich und schlägt vor, die Start Population vo…

Discussion

Um das Stimulans richtig T – Zell – Adhäsion zu analysieren, um in die Studie aufgenommen werden müssen berücksichtigt werden , wenn ein in vitro – Verfahren wählen. Zwar gibt es mehrere Assays sind Signale zu untersuchen, die zu LFA-1-Aktivierung und ICAM-1-Bindung Alle Methoden sind nicht austauschbar. Eine statische Adhäsionstest ¹⁰ ist am besten geeignet , T – Zell-APC – Wechselwirkungen zu untersuchen; alternativ detailliert die Schubspannung Methode hier ist ideal T – Zell-epithelialen Zel…

Materials

T cell samples (cell line or primary)	ATCC	TIB-152	Peripheral human T cells
CHO-ICAM-1 cells	ATCC	CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat	ibidi	80606
500 ml glass bottle	Fisher	FB800500
250 ml glass bottle	Fisher	FB800250
Silicone tubing 0.8 mm	ibidi	10841
Confocal microscope with incubator chamber	Ziess	700	Any wide field fluorescent microscope
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE-300
60 ml syringe	BD	309653
CFSE	eBioscience	65-0850
SDF-1α	R&D	350-NS-010/CF
RPMI	Lonza	12-702F/12
PBS	Lonza	17-516F
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
PMA	Sigma Aldrich	16561-29-8
Volocity software	Perkin Elmer	Version 6.2.1
ImageJ software	NIH	Version 1.48V
Tissue-culture treated culture dishes	Falcon	353003
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red	Gibco	25200114
Heat Inactivated FBS	Denville	FB5001-H
Penicillin/Streptomycin	Fisher	BP295950