Das Protokoll beschreibt ein neuartiges Maus-Femur-Fensterkammermodell, das verwendet werden kann, um die Bewegung von Zellen im femoralen Knochenmark in vivo zu verfolgen. Die Intravital-Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um drei Komponenten des femoralen Knochenmarks (Gefäße, Kollagenmatrix und Neutrophile) im Zeitverlauf abzubilden.
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Methodenartikel
Femur Fensterkammer Modell für
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Knochenmark ist ein komplexes Organ, das verschiedene hämatopoetische und nicht-hämatopoetische Zellen enthält. Diese Zellen sind an vielen biologischen Prozessen beteiligt, darunter die Blutbildung, die Immunregulation und die Tumorregulation. Häufig verwendete Methoden zum Verständnis zellulärer Aktionen im Knochenmark, wie z. B. Histologie und Blutbild, liefern statische Informationen, anstatt die dynamische Wirkung mehrerer zellulärer Komponenten in vivo zu erfassen. Ergänzend zu den Standardmethoden wurde ein auf Fensterkammern (WC) basierendes Modell entwickelt, das eine serielle in vivo-Bildgebung von Zellen und Strukturen im murinen Knochenmark ermöglicht. Dieses Protokoll beschreibt ein chirurgisches Verfahren zur Installation des WC im Femur, um einen langfristigen optischen Zugang zum Femurknochenmark zu ermöglichen. Um seinen experimentellen Nutzen zu demonstrieren, wurde dieser WC-Ansatz insbesondere verwendet, um Neutrophile innerhalb des Gefäßnetzwerks des Femurs abzubilden und zu verfolgen, wodurch eine neuartige Methode zur Visualisierung und Quantifizierung des Transports und der Regulation von Immunzellen im Knochenmark bereitgestellt wurde. Diese Methode kann angewendet werden, um verschiedene biologische Prozesse im Knochenmark von Mäusen zu untersuchen, wie z. B. Hämatopoese, Stammzelltransplantation und Immunreaktionen bei pathologischen Zuständen, einschließlich Krebs.
Einleitung
Das Knochenmark ist ein wichtiges Organ beteiligt bei der Hämatopoese und Immunregulation. Es besteht aus einem hämatopoetischen Komponente hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und einem stromal Komponente , die nicht-hämatopoetischen Vorläuferzellen enthält, die zu Mesenchymzellen 1 ergeben. Zwei Drittel der hämatopoetischen Aktivität wird 2 auf die Erzeugung von myeloischen Zellen gewidmet. Insbesondere kann eine große Anzahl von Neutrophilen werden im Knochenmark produziert, mit 1-2 x 10 11 pro Tag erzeugten Zellen in einem normalen erwachsenen Menschen 2. Neutrophile sind die erste Verteidigungslinie gege....
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Protokoll
HINWEIS: Bei allen Tier Arbeit wurde unter Protokoll # 2615 von der University Health Network Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt durchgeführt.
1. Chirurgische Vorbereitung der Maus
- Vor der Operation sterilisieren alle chirurgischen Instrumente und die Fensterkammer (WC) durch Autoklavieren. Ergänzen Sie die Trinkwasser mit 50 mg / kg Körpergewicht von Amoxicillin 2 Tage vor der Operation. Injizieren Sie die Maus mit 0,1 mg / kg Körpergewicht von Buprenorphin intraperitoneal 4 Stunden vor der Operation.
- Anesthetize die athymischen Nacktmaus durch intraperitoneale Injektion von 350-400 & mgr; l Salzlösung, die 80 mg / kg ....
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Ergebnisse
Murine femoral bone marrow erfolgreich zugegriffen , um die WC Verwendung Visualisierung einzelner Neutrophilen und Gefäßnetze zu ermöglichen. Figur 1 zeigt das WC Instrument und beschreibt die chirurgische Prozedur, die Exposition des Oberschenkelknochens und Ausdünnung der Kortikalis beinhaltet optischen Zugang im Inneren des zu gewinnen Knochen. Die Operation wird in den Mäusen gut vertragen; sie wurden für 5 Tage für negative körperliche Reaktionen, wie der hinteren .......
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Diskussion
Echtzeit, Serien Abbildung der dynamischen zellulärer Prozesse in Knochenmark enthält Informationen, die sonst herausfordernd ist unter Verwendung herkömmlicher Techniken, wie beispielsweise die Histologie und die Gesamtblutwerte zu erhalten. Das Femur WC hier beschriebene Modell bietet einzigartige Möglichkeiten, zelluläre und strukturelle Veränderungen im Knochenmark im Laufe der Zeit zu untersuchen. Obwohl ein Femur WC Modell bereits berichtet wurde, unser neuartiges Design bietet eine größere Abbildungsfeld und klei.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Danksagungen
Die Autoren möchten die Advanced Optical Mikroskopie Facility (www.aomf.ca) an der Universität Health Network für die Unterstützung bei der Mikroskopie und Herr Jason Ellis von der Prinzessin Margaret Cancer Center Machine Shop zu danken für das WC-Herstellung und die Abbildungsstufe. Wir möchten auch Dr. Iris Kulbatski für Manuskript Bearbeitung danken.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| NRCNU-F athyme nackte Mäuse | Taconic | Ncr nackt | 8-10 Wochen alt, weiblich |
| Saline | Baxter | JB1302P | |
| Ketaminhydrochlorid | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Xylazin | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| OP-Abdecktuch | Proxima | DYNJP2405 | |
| Elektrisches Heizkissen | Life Brand | 57800827375 | |
| Stereomikroskop | Leica | Leica M60 | |
| Augensalbe (Tränengel) | Novartis | T296/2 | |
| 7,5 % Betadin | Purdue Frederick Co | 67618-151-16 | |
| 70 % Isopropylalkohol | GreenField | P010IP7P | |
| 10 % Betadin | Purdue Frederick Co | 67618-150-05 | |
| Skalpellgriff | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Skalpellklinge (#15) | VWR | 89176-368 | |
| Federschere gebogen | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Baby-Mixter Hämostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Feine Schere | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Extra Fine Graefe Pinzette | Fine Science Tools | 11151-10 | |
| Halsted-Mosquito Hemostate | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Mikrobohrer | Harvard Apparaus | 72-6065 | |
| Mikrobohrer | Fine Science Tools | 19007-14 | |
| Femur-Fensterkammer | PMCC Maschinenwerkstatt | Sonderanfertigung | 9,1 mm - 8,5 mm - 7,5 mm (Außen- bis Innendurchmesser), 2,16 mm (Radius von zwei Löchern), 13,9 mm (Abstand zwischen zwei Löchern), 0,7 mm (Dicke) |
| U-förmige Stange | PMCC Maschinenwerkstatt | Sonderanfertigung | 13,8 mm (Länge), 1,6 mm (Breite), 3,7 mm (Höhe) |
| Deckglas (8 mm) | Warner Instruments | HBIO 64-0701 CS-8R | |
| Sicherungsring (8 mm) | ACKLANDS GRAINGER | UNSPSC # | |
| Muttern (Sechskant Edelstahl) | Befestigung | 70701 | |
| Zahnzement | 3M | RelyX U200 | |
| Naht (5-0 Monosof schwarz) | Covioien | SN-5698 | |
| Halsey Nadelhalter | Fine Science Tools | 12501-13 | |
| Buprenorphin (Temgesic) | Reckitt Benckiser | DIN 0281251 | |
| Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim | DIN 02240463 | |
| Amoxicillin (Clamavox) | Pfizer | DIN 02027879 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD2000S | |
| APC- Anti-Maus Ly-6G (Gr-1) | eBioscience | 17-9668 | |
| Zwei-Photonen-Mikroskop LSM 710 | Carl Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | |
| Bildgebungstisch | PMCC Maschinenwerkstatt | Sonderanfertigung | 15,9 cm (Länge), 11 cm (Breite), 0,9 cm (Höhe) |
| Imaris Software | Bitplane | Imaris 8.0 | Bildanalysesoftware, die in Abschnitt 3 des Protokolls beschrieben ist |
| Zen 2012 | Zeiss | Zen 2012 | Bilderfassungssoftware, die in Abschnitt 2 des Protokolls beschrieben ist |
Referenzen
- Zhao, E., et al. Bone marrow and the control of immunity. Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O.
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Nachdrucke und Genehmigungen
